鲎血液中血蓝素的提取与检测

2013设计实验
鲎血液中血蓝素的提取与检测
鲎血液中血蓝素的提取与检测
一．实验目的
学习血蓝蛋白提取与检测的原理及应用，掌握血蓝蛋白提取与检测的装置及其操作方法。

二．基本原理
血液有各种各样不同的颜色，这是因为血液中所含的色素物质使得其血液呈现出特定的颜色。

如人和脊椎动物的红色血液，虾等节肢动物的青色血液。

鲎（hòu），一种堪称“活化石”的古老海生节肢动物，却拥有蓝色的血液。

而使其血液呈现出奇异蓝色的物质，就是本次试验所要提取的——血蓝素。

血蓝素又称血蓝蛋白，是节肢动物和软体动物血淋巴中的一种多功能蛋白。

其功能与血红蛋白功能相似，但是载氧效率比血红蛋白低。

过去被称为呼吸蛋白，但最新研究表明，血蓝蛋白不仅是一种含铜呼吸蛋白，而且还是一种重要的免疫分子。

该蛋白参与了能量储存、渗透压维持、蜕皮过程调节,特别是酚氧化物酶活性和抗菌等生物功能的执行。

进一步研究血蓝蛋白功能对于丰富和发展无脊椎动物，特别是甲壳类动物生理生化和免疫系统的基础研究，探索免疫这些结果表明，血蓝蛋白具有广谱抗细菌、真菌、病毒功能及独特的作用机理，有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源。

中国是海
洋大国，开发和利用海洋动物血蓝蛋白资源，将为研制抗菌新药提供理想分子设计骨架和模板，为发展新的抗感染药物奠定重要基础。

提取与检测血蓝素的实验原理如下：
血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。

其分子量450 000～130 000。

节肢动物的血蓝蛋白一条多肽链与一分子氧结合，含铜量0．17%；铜以二价形式与蛋白直接结合。

利用超高速冷冻离心和Sepharose 4B凝胶过滤两步法从日本血吸虫中间寄主-湖北钉螺血淋巴中提取获得一种含铜呼吸蛋白-钉螺血蓝蛋白.该血蓝蛋白具有典型的血蓝蛋白基本特征,含铜量为0.23%,在340nm处观测到该蛋白的紫外特征吸收峰.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该呼吸蛋白由两种蛋白质亚基组成,分子量分别为400KDa和250KDa.透射电子显微镜测定结果证实其四级结构为中凹的圆柱体,且以单体、二聚体和多聚体形式共存于血淋巴中.
三．实验材料
美洲鲎Limulus polyphemu'（东方鲎为我国二级保护动物，故不可用）。

四．实验仪器于试剂
高速冷冻离心机，冰箱，垂直板电泳槽，电泳仪，精密电子天平，
移液枪，恒流泵，Tris-HCl，CaCl2，MgCl2，20%蔗糖，Sepharose 4B 悬浮液等。

五．实验内容与步骤
1.血蓝素的提取
每只鲎都将被固定，然后使用不锈钢针刺入鲎的心包以提取输往心脏的含氧血（鲎并不会因为血液提取而死去）。

放于装有0.1ml 左右储存缓冲液（0.05M Tris-HCl 含5mM CaCl2、5mM MgCl2，pH7.0）的离心管内，后用高速冷冻离心机8000 r/min4℃离心20 分钟，将其上清液（含血蓝蛋白）转移到新的离心管内，就得到初步提取的鲎血蓝素溶液。

2.血蓝素的纯化
（1）取收集的鲎血蓝素粗提液
用超高速冷冻离心机于 4 °C 、190000g 离心力，离心 3.5 小时，弃去上清液，所得沉淀溶于0.05MTris-HCL（pH7.0）缓冲溶液中(含5mMCaCl2，5mMMgCl2，20%蔗糖)。

存于-20℃冰箱中备用。

（2）Sepharose 4B 凝胶过滤柱层析
装柱：垂直固定好层析柱，柱底放置一层支撑网，然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入Sepharose 4B 悬浮液，让其自然沉降，直至沉积达60 ㎝高。

（装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于凝胶表面，以免混入空气而影响分离效果。

）上柱：将样品溶液在洗脱剂的液面恰好与凝胶床的表面相平时加
入凝胶层析柱，使2组分能够均匀地进入凝胶床（样品溶液体积不能过大，通常为凝胶床体积的10%左右，最大不能超过30%）。

打开开关，使样品溶液进入凝胶。

洗脱：吸少量缓冲液（0.05M Tris-HCl 含5mM CaCl2、5mM MgCl2，pH7.0）冲洗柱内壁2次，加洗脱剂至液层3~4㎝左右，接上恒流泵，调好流速（0.2ml/ min），开始洗脱。

所用洗脱剂体积一般为凝胶床体积的120%左右，洗脱流出液用部分收集器收集，收集组分的大小为1ml/管。

浓缩：试用旋转蒸发仪减压浓缩，烘干成粉状（有必要时刻进行重结晶）。

1.用胶管与冷凝水龙头连接，用真空胶管与真空泵相联。

2. 先将水注入加热槽。

3.打开调速开关，打开调温开关，调节其左侧旁的调温旋钮，
使温度维持在60摄氏度（上下5度）
4.蒸发完毕，关闭调速开关及调温开关，然后关闭真空泵，并
打开冷凝器上方的放空阀，使之与大气相通，取下蒸发瓶。

3.血蓝素的检测——SDS-PAGE 电泳法测定血蓝素分子量
血蓝素分子量的测定采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)，简称SDS-PAGE 电泳法。

（1）溶液配制
A 液（丙烯酰胺储存液）：30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr 30g，0.8%
甲叉双丙烯酰胺（Bis）：称Bis 0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中4℃贮存可用1-2个月。

B 液（4×分离胶缓冲液）：4ml10%SDS（十二烷基磺酸钠）；75ml
2.0mol/L pH8.8Tris-HCl 缓冲液（称取Tris24.3g，加入50ml 水，用1mol/L 盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml）；21ml 蒸馏水。

C 液（4×堆积胶缓冲液）：4ml10%SDS（十二烷基磺酸钠）；50ml
1.0mol/LpH6.8Tris-HCl 缓冲液（称取Tris1
2.1g，加入50ml 蒸馏水，用1mol/L 盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml）；46ml 蒸馏水。

电泳缓冲液（内含0.1%SDS，25mM Tris 碱，192 mM 甘氨酸缓冲液，pH8.3）：称Tris3.0g，甘氨酸14.4g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

5×样品缓冲液：取10%SDS 2ml，β-巯基乙醇0.5ml，1%溴酚蓝1 ml，50%甘油
5 ml，0.6ml 1mol/L Tris-HCL PH6.8，最后加蒸馏水定容至10ml。

染色液（1L）：考马斯亮蓝（R-250）1.0g，甲醇450ml，冰醋酸100 ml，然后用
蒸馏水定容至1L。

脱色液（1L）：冰醋酸100ml，甲醇100ml，加蒸馏水定容至1000ml。

各部分凝胶配制
分离胶(8% 10ml) 堆积胶(5% 4ml)
蒸馏水4.8ml 2.3ml
A 液2.7ml 0.67ml
B 液2.5ml —
C 液—1.0ml
10% AP 50µl 30µl
TEMED 5µl 5µl
（2）具体方法
a.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，在灌胶支架上固定好。

固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。

b.按比例配好分离胶，快速加入，大约5 厘米左右，加1- 2cm 高的蒸馏水密封，静置40 分钟。

c.按比例配好堆积胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm 处，迅速插入样梳，静置40 分钟。

d.拔出样梳后，在槽内加入缓冲液，要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。

e.加样前，标准蛋白在沸水中加热5 分钟，使它与SDS 能够更好的结合。

f.进样：（1）取16µl 样品溶解液于离心管内，再加入4µl 5×上样缓冲液，混合后加入梳孔，上样量为20µl；（2）取标准分子量蛋白5µl，连接电泳仪。

g.接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20mA，使所加样在堆积胶和分离胶分界处堆积成一条线进入分离胶后改为40mA，待溴酚
蓝跑出胶外后继续电泳30min，停止电泳，整个过程约100min。

h.取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，用去离子水冲洗干净后，放在装有考马斯亮蓝染色液的大培养皿内，染色
1 小时左右，回收染色液。

i.染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液于TS-2 型脱色摇床脱色，其间要更换脱色液数次,直到蛋白质区带清晰。

注：实验中所用标准蛋白为肌球蛋白(200KDa)，β-半乳糖苷酶(116KDa)，磷酸酶b(97.2KDa)，牛血清蛋白(66.4KDa)，卵清蛋白(44.3KDa)，磷酸苷酶(29KDa)，胰蛋白酶抑制剂(20.1KDa)，容菌酶(14.3KDa)，胰肽酶(6.5KDa)。

钥戚孔血蓝蛋白为标准血蓝素。

六．实验结果（预期）
1.纯化血蓝素
从500mL鲎血液中得到血蓝素约5g(参考猪血红素提取率)，经超高速离心后得到蓝色沉淀。

将此沉淀溶解于0.05MTris-HCl 缓冲液中后，进行Sepharose 4B 柱层析，经核酸蛋白检测仪，记录数据绘图，得到单一的洗脱峰(见图2-1)，说明经超高速离心后所得蓝色沉淀为相似分子大小的同种蛋白。

2.纯化血蓝素SDS-PAGE 分析
假想血蓝素SDS-PAGE 分析图，则第一列为标准蛋白，第二列
为KLH，第三列为血蓝蛋白样品。

参考文献：
——《钉螺血蓝蛋白的提取与性质研究》张云郭道义李永东范小林
国家自然科学基金资助项目(56508001)
——《鲎血救人全流程》小杨2011-07-20 19:36 果壳网
——鲎百度百科
——血蓝素维基百科。