鲎血液中血蓝素的提取与检测
细菌内毒素
细菌内毒素检查法一、细菌内毒素检查法的定义：●本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。
二、背景介绍：●1、细菌内毒素●2、热原●3、鲎1、细菌内毒素●细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质特性：●（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。
●（2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。
●（3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。
●（4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。
2、热原2.1热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质2.2细胞分裂素（IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）内源性热原｛产生细胞分裂素的物质内毒素热原外源性热原｛非内毒素热原（病毒、细菌、真菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）2.3热原和内毒素的关系：2.3.1热原是否就是内毒素？在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
3、鲎3.1鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。
鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。
又具有很高的药用价值。
3.2鲎试剂鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。
鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。
这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”。
鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的“鲎试剂”，能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测细菌内毒素。
目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。
鲎试验实验报告
一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。
2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。
3. 提高微生物学实验技能。
二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。
鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。
根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。
- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。
2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。
- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。
3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。
- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。
4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。
2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。
3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。
六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。
2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。
3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。
七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。
在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。
同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。
美国USP鲎试剂检测方法
USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。
本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。
*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。
直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。
内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。
[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。
]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。
两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。
主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。
使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。
动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。
仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。
]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。
鬼鲎
鬼鲎作者：宫乃斌来源：《科学24小时》2012年第01期每当春夏繁殖季节，雌雄鲎便结为夫妻，成双结对爬到沙滩上掘穴产卵。
此时若捉住雌鲎，“痴情”的雄鲎决不松手。
如果捉住雄鲎，它往往即刻放开妻子，意犹“快逃命吧”，宁愿牺牲自己。
雌鲎则全然不顾“夫妻恩爱”，溜之大吉……夏天的傍晚，在北部湾的海滩上常看到脸盆大小的圆“蟹”驮着另一只较小的同伴蹒跚而行。
它那“蟹壳”如瓢如盔，青褐色，身后拖着的尾巴如出鞘的剑，晃来晃去，而且其状怪异，行为诡秘，因此在《本草纲目》中被称为“鬼鲎”。
其实，这是一对鲎夫妻，它们正在寻找称心如意的“产房”，以便让儿女们出世后能够茁壮成长。
鬼鲎之所以行为诡秘，是因为其中隐藏着许多“高科技”的绝技，其水平甚至够上诺贝尔奖，令人叹为观止。
四眼怪物鲎眼的精细结构及其原理就与诺贝尔奖结缘。
美国科学家、洛克菲勒大学的凯弗·哈特兰教授1931年开始研究鲎眼的单根视神经纤维和感受器，他又于1954年研究了鲎眼感受器的侧抑制性及其相互作用，成绩卓越，1967年终因对鲎视觉的研究取得重大成果而荣获“诺贝尔医学或生理学奖”。
现在我们知道，鬼鲎有四只眼睛并且各司其职，是地球上名副其实的“四眼怪”。
其头胸甲的前端有直径不足半毫米的两只小眼。
这对眼睛小是小，但对紫外光非常敏感，可谓“紫外线传感器”，被用来感知亮度、辨别身处阴暗的早晨还是月光朦胧之夜，弥足珍贵。
在鬼鲎头胸甲的两侧则有一对复眼。
在光学或电子扫描显微镜下，可以发现复眼的超微精细结构。
原来，复眼的外形呈半球形，表面覆盖着角膜层，由800~1200个小单眼组成。
每个小单眼都是椭圆形，有角膜、晶锥、色素细胞、视杆、视网膜细胞等部分，是一个独立的感光单位。
每8个小视网膜细胞又排列成桔瓣状结构，其精细程度堪称世间一绝，令人惊叹不已。
哈特兰发现，鲎的复眼能形成一种侧抑制网络，使物体的图像更加清晰。
其原理是，图像会因随机媒质的干扰而变模糊，侧抑制网络具有提高图像的反差和光信号的信噪比的作用，还能矫正复眼的屈光系统，因而提高了图像的清晰度。
多彩的动物血液
多彩的动物血液如果有人问：血液是什么颜色的？你准会毫不迟疑地回答：红色！是的，哺乳动物，包括人类，血管里流动的是鲜红的血。
但在生物学家的眼里，动物的血液却是多彩的，除红色外，还有蓝、青、绿、白、褐、淡蓝、红绿相间、玫瑰色等颜色。
脊椎动物的血液大多是红色的，生物学家对红色的血液研究比较多，不但搞清了高等动物血液的成分和功用，而且对红色血液的色素也进行了分析，并且了解到血红素中含有二价的铁离子，不但呈红色，且有股铁腥味。
血红素同蛋白质相结合，生成的血红蛋白有一种奇妙的特性，它能与氧分子和二氧化碳分子进行不稳定的结合，成为这两种气体的载体。
血液从左心室泵出流经肺泡时，血红蛋白放出从组织细胞带来的二氧化碳，同新鲜氧气结合，这时的血液呈特有的鲜红色，称为动脉血；血液从右心室出发，流经组织细胞时，血红蛋白把氧气供给细胞，同时将组织中的二氧化碳和废物带走，这时的血液呈现暗红色，称为静脉血。
血红蛋白从鲜红到暗红，又从暗红到鲜红的变化是生命体生生不息的动力，如果这种变化一旦失调，生命就会发生危险。
动物界种类最多、数量最大的是昆虫，据生物学家估计，地球上的昆虫，少说也有100多万种。
昆虫的血液有各种各样的颜色，最常见的是黄色、橙红色、蓝绿色和绿色。
例如在十字花科植物间飞舞的菜粉蝶，其幼虫、蛹或成虫的血液，雌雄有别，雌性为绿色，雄性则是金黄色或无色透明；大天蚕蛾、家蚕的血液为黄色，飞蝗的血液为淡绿色。
环节动物蚯蚓的血液是玫瑰红色的，蛭的血液为红色。
所以，不同种类的动物，血液的颜色各不相同。
同样是血液，为什么颜色会不同呢？研究认为，血液的颜色是由血色素决定的，像鳞翅目昆虫，体液中多胡萝卜素、核黄素、黄酮等，血液就呈现黄色。
血液的颜色还与血蛋白中的金属离子有关，所含离子不同，血液的颜色也不同。
如果血液中有两种不同的血蛋白，相互掺和，血液的颜色也会变化。
例如，直翅目昆虫中的各类蚂蚱，血液中既有黄色蛋白，又有蓝色蛋白，两者相辅，血液就呈现淡绿色。
凝胶法细菌内毒素检查介绍
凝胶法细菌内毒素检查介绍【摘要】简单介绍一种广泛使用，权威的细菌内毒素检测方法─凝胶法【关键词】凝胶法；细菌内毒素；鲎试剂；细菌内毒素检查用水1概述在药品药理检测中，目前有两种常用的热原检测方法-细菌内毒素法（鲎试剂法）和家兔法。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，其中广泛使用，权威的检测方法为凝胶法。
2细菌内毒素检查法的建立1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。
其后Levin和Bang又研究出微量革兰氏阴性菌内毒素遇鲎血液也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。
《中国药典》2010年版规定的细菌内毒素检测法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
3实验原理细菌内毒素在钙离子，镁离子参与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。
4试验试剂鲎试剂：从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。
鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示。
鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必须是统一且标准的。
5实验用具凝胶法细菌内毒检查所需实验用具：移液管（或刻度吸管，定量移液器）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。
所有玻璃器皿或金属用具须采用干热灭菌法250℃干烤30分钟以上（2010版中国药典规定）以除去细菌内毒素。
塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。
6实验用试剂实验所用的主要试剂有：75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。
7实验操作方法7.1试验准备7.1.1洗液的配备配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。
7.1.2玻璃器皿的洗涤将洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱中250℃干烤30分钟以上。
拥有神奇蓝色血液的鲎
我们都可能曾被鲎血救过。
“鲎血”是什么？是什么血？为什么我们曾有这种可能呢？今天不仅给大家解答这个问题，我们还要会从它身上了得到更多信息。
亮一张提取小鲎的现场图，绝对稀奇！不是蓝精灵附体，更不是PS美化后的效果，这就是神奇蓝色血液的活化石——鲎！鲎（hòu）又俗称：马蹄蟹、夫妻鱼、鸳鸯鱼、爬上灶。
栖息于20—60米水深的砂质底浅海区，喜潜砂穴居。
在十九世纪五十年代，科学家们在它的灰蓝色血液中发现了一种凝血剂，称为鲎试剂(Limulus amoebocyte lysate,LAL)，人类因它的血液而受益匪浅。
鲎血可以与菌类、内毒素类物质发生反应，并在这些入侵物周围凝结出一层厚厚的凝胶。
研究者们将鲎的血液提取出来并制成试剂，其中只能检测出含量低至万亿分之一的细菌和其它污染物。
所以呢，它是一种检测药品和医疗用品中不可或缺的角色。
值得一提的是鲎并不会因为血液提取而死去，不过这也是适量的前提下，如果你抽光了它的血，当然还是会死翘翘的。
根据资料来看，鲎血应该被“可持续发展”，我们应该合理利用它的客观价值，如果只是一味的为取其血液，甚至是猎杀的话，那是没几年可利用了。
据说现在加工过的鲎血，（1升左右）可以卖到1.5万美元。
如何才是合理利用它，这种古老的“蓝体动物”？我们接下去慢慢看！首先，先谈抓捕工序。
这里为大家介绍的是美国自然资源部授权的渔民正在抓捕的鲎，它们通常在美国南卡罗来纳州的沙滩上产卵，渔民所要做的只是将它们从浅滩上拾起，再放入渔船之中。
接着得洗一把澡，海选一下健康的鲎童鞋。
工作人员用密封的车辆来将鲎运往实验室，这样能保证它的新鲜和潮湿。
之后，鲎身上的沙子、藤壶和其它杂物将被除去，同时人们还将检查它是否受伤（公司不会提取病鲎的血液）。
然后就能进行血液提取。
每只鲎都将被固定，然后他们使用不锈钢针刺入鲎的心包以提取输往心脏的含氧血。
每个消毒瓶大约能收集到100毫升的血液。
100毫升的血液哦，请大家记住这个量！抽完血，鲎也累了，该给它放生去了。
鲎实验实验报告
一、实验目的1. 了解鲎实验的基本原理和方法；2. 掌握鲎实验的操作步骤；3. 学会观察和分析实验结果；4. 培养实验操作技能和实验报告撰写能力。
二、实验原理鲎实验是一种检测细菌内毒素的方法。
鲎是一种生活在海洋中的生物，其血液中含有一种特殊的凝固蛋白，当与细菌内毒素接触时，会迅速凝固。
通过观察鲎血液凝固的时间，可以判断细菌内毒素的存在和含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鲎血液、细菌内毒素标准品、生理盐水、注射器、试管等；2. 实验仪器：恒温箱、显微镜、计时器等。
四、实验步骤1. 准备工作：将鲎血液和细菌内毒素标准品分别放入无菌试管中，加入适量生理盐水稀释；2. 设置实验组：将稀释后的鲎血液和细菌内毒素标准品分别加入两个无菌试管中，分别标记为实验组和对照组；3. 设置对照组：将稀释后的鲎血液和生理盐水分别加入两个无菌试管中，分别标记为实验组和对照组；4. 加入细菌内毒素：在实验组和对照组的试管中分别加入适量的细菌内毒素；5. 混匀：用无菌棉签轻轻搅拌试管中的混合液，使细菌内毒素充分溶解；6. 观察和记录：将实验组和对照组的试管放入恒温箱中，观察鲎血液凝固的时间，并记录实验结果；7. 结果分析：根据实验结果，判断细菌内毒素的存在和含量。
五、实验结果与分析1. 实验结果：实验组中，鲎血液在加入细菌内毒素后迅速凝固，对照组中，鲎血液在加入生理盐水后无明显变化；2. 结果分析：实验结果表明，细菌内毒素能引起鲎血液凝固，从而判断细菌内毒素的存在。
根据实验结果，可以推算出细菌内毒素的含量。
六、实验总结1. 鲎实验是一种检测细菌内毒素的有效方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点；2. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免污染；3. 通过本次实验，掌握了鲎实验的操作步骤，提高了实验操作技能和实验报告撰写能力。
七、注意事项1. 实验过程中，应严格遵守无菌操作原则，避免污染；2. 实验操作时应保持冷静，避免慌乱；3. 实验结果分析时，应结合理论知识，准确判断细菌内毒素的存在和含量；4. 实验报告撰写时，应清晰、简洁、有条理地表达实验过程和结果。
鲎的血液为什么是蓝色的
鲎的血液为什么是蓝色的
鲎（Horseshoe crab）的血液呈现蓝色，这是因为它们的血液中含有一种名为青霉素酰胺（LAL）的血细胞凝集素。
鲎的血液具有独特的生理和免疫系统特征，它们的血液不仅具有输送氧气和养分的功能，还具有强大的抗菌和抗毒性能力。
当鲎暴露于细菌内毒素（例如细菌的细胞壁成分LPS）时，其血液中的青霉素酰胺会发生反应，引发血细胞凝集作用。
这项特殊的凝集反应对于检测细菌内毒素具有极高的敏感性，使得鲎的血液在药品审批和医疗设备消毒等领域中得到了广泛应用。
因此，鲎的血液被用作生物学检测材料，尤其是在质控和细菌检测方面。
鲎的血液呈现蓝色是由于青霉素酰胺结合铜离子的存在，这与其他动物使用铁离子血红蛋白携氧的机制有所不同。
这也是为什么鲎的血液在氧输送方面不如其他动物的血液有效的原因之一。
破解“蓝血”的秘密鲎试剂确保24亿人次用药安全
|34关注｜四亿多年前的泥盆纪，原始鱼类刚刚问世，而鲎，地球上唯一一种具有蓝色血液的动物已经出现，直至今日，它们仍保留着原始而古老的样貌。
它的蓝色血液是不是使它存活至今的主要原因？它是否有利于人类的健康长寿？在广东湛江市，博康海洋生物有限公司（以下简称“博康生物”）董事长、中国东方鲎试剂原创发明专利技术持有人莫水晶与他的团队经过35年的不懈研究，在中国首创动态浊度法鲎试剂，利用鲎试剂检测内毒素含量，年生产鲎试剂1000万支，供应全国的制药企业和医疗机构共1000多家，每年可确保24亿人次用药安全。
内毒素引起的不明发热可致死从20世纪60年代开始，革兰氏阴性菌逐步成为临床感染的主要致病菌。
而细菌内毒素的产生，主要是革兰氏阴性细菌在凋亡后，其菌体细胞壁被水解，释放出的一种活性、毒性类脂A模式分子，它可激活中性粒细胞，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢，引起发热。
“如果人体烫伤、烧伤，或其他感染病灶在相关的微生物酶的诱导作用下，病灶处再释放出氨、磷脂、脂肪酸、氨基己糖等，都会构成内毒素类脂A活性物质，内毒素主要是促进前列腺素的增加和炎症介质的过度表达引发人体发热，这种发热属于神经性反应。
莫水晶指出，细菌内毒素还可以通过污染的药品注射剂进入人体，所以内毒素血症不管是外源性的还是内源性的，都凶险异常，会加重与引发脓毒症、败血症等危重疾病的发生发展，甚至导致死亡。
莫水晶告诉记者，他也曾受到“细菌内毒素”的伤害。
1975年，莫水晶从老家湛江廉江来到昆明某空军部队，成为一名飞行学员。
停飞后在空军昆明医院工作，1979年在中越边境自卫反击战收治伤病人的工作中，因病住院治疗时，曾注射了受污染内毒素的药品液体制剂，导致机体发热，一时也找不出发热原因。
“当时还没有鲎试剂，而内毒素是不能通过‘微生物培育’或其他方法检测到的，所以我体内有内毒素，谁都不知道。
”莫水晶进一步解释说，由于细菌内毒素不是病原体活体菌株，也不具有蛋白质结构的特性，利用医院临床常规病原学“微生物培养”、“基因排序法”等方法都无法检查，这给临床诊断和治疗用药带来极大困难。
《鲎,一种珍贵的海洋药用动物》读书报告
《鲎,一种珍贵的海洋药用动物》读书报告鲎（hòu）亦称马蹄蟹。
肢口纲（Merostomata）剑尾目（Xiphosura）海生节肢动物，共3属4种，见于亚洲和北美东海岸。
虽又称马蹄蟹，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。
鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫（现在只有化石）一样古老的动物。
鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从 4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。
我国已知的鲎有3种，均分布在南部海域：东方鲎、南方鲎、圆尾鲎。
东方鲎体长50~60cm。
头胸部有宽阔的背甲，形似马蹄。
上有单眼和复眼各一对。
腹面6对附肢：鳌肢短小，分3节。
第2至5对附肢各为6节，适于步行，足的末端呈钳状。
第6对附肢7节，末端特化适于掘土和爬行。
雄性第二对附肢无钳而成钩状。
第2至6对附肢的基部排列于口的两侧，用以咀嚼食物。
最末一对步足之后，有一唇状瓣，可能是和头胸部愈合的第一腹节的附肢。
腹部背面坚硬，呈六角形，两侧具缺刻和短刺。
尾端有长大而能活动的尾剑，当身体偶尔被翻转时，可赖以扶正。
腹部不分节，第一对附肢愈合成生殖厣遮盖生殖孔，其后的5对附肢为双枝型，每对附肢內缘相互愈合。
外肢扁宽，其后壁呈叶片状，重叠似书页，称书鳃，血液流经书鳃时与海水进行气体交换。
南方鲎，分布于印度、越南、新加坡、印度尼西亚。
圆尾鲎，分布于印度、孟加拉、泰国、印度尼西亚。
中国广西钦州、北海、海南儋州、临高、澄迈、海口地区沿海也有分布。
鲎为暖水性的底栖节肢动物，栖息于20－60米水深的砂质底浅海区，喜潜砂穴居，只露出剑尾。
食性广，以动物为主，经常以底栖和埋木本的小型甲壳动物、小型软体动物、环节动物、星虫、海豆芽等为食，有时也吃一些有机碎屑。
中国鲎在中国福建沿海从4月下旬至8月底均可繁殖。
鲎试验(Limulus test)
上图所示：鲎，最具特点的就是鲎的血是蓝色的。
鲎（hòu）亦称马蹄蟹。
肢口纲（Merostomata）剑尾目（Xiphosura）海生节肢动物，共4种，见于亚洲和北美东海岸。
虽又称马蹄蟹爬上灶、夫妻鱼、鸳鸯鱼，东方鲎等，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。
鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫（现在只有化石）一样古老的动物。
鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。
每当春夏季鲎的繁殖季节，雌雄一旦结为夫妻，便形影不离，肥大的雌鲎常驮着瘦小的丈夫蹒跚而行。
此时捉到一只鲎，提起来便是一对，故鲎享“海底鸳鸯”之美称。
鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。
这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。
科学家也使用鲎血研究癌症。
但是，对鲎抽血后，它们就被放生。
鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。
鲎试剂因能与细菌内毒素及β-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械、动物体液等不同样品中的内毒素。
使用鲎试剂检测的试验称为鲎试验。
鲎是一种海洋节支动物，其血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。
当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。
检测内毒素血症的一种试验。
鲎系海边栖生的一种大型节肢动物,属蜘蛛纲。
其多功能血细胞(变形细胞)的溶解物中含有一种可凝性蛋白质,在极微量内毒素(0.0005vg/ml)存在时可形成凝胶。
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2013设计实验鲎血液中血蓝素的提取与检测鲎血液中血蓝素的提取与检测一．实验目的学习血蓝蛋白提取与检测的原理及应用，掌握血蓝蛋白提取与检测的装置及其操作方法。
二．基本原理血液有各种各样不同的颜色，这是因为血液中所含的色素物质使得其血液呈现出特定的颜色。
如人和脊椎动物的红色血液，虾等节肢动物的青色血液。
鲎（hòu），一种堪称“活化石”的古老海生节肢动物，却拥有蓝色的血液。
而使其血液呈现出奇异蓝色的物质，就是本次试验所要提取的——血蓝素。
血蓝素又称血蓝蛋白，是节肢动物和软体动物血淋巴中的一种多功能蛋白。
其功能与血红蛋白功能相似，但是载氧效率比血红蛋白低。
过去被称为呼吸蛋白，但最新研究表明，血蓝蛋白不仅是一种含铜呼吸蛋白，而且还是一种重要的免疫分子。
该蛋白参与了能量储存、渗透压维持、蜕皮过程调节,特别是酚氧化物酶活性和抗菌等生物功能的执行。
进一步研究血蓝蛋白功能对于丰富和发展无脊椎动物，特别是甲壳类动物生理生化和免疫系统的基础研究，探索免疫这些结果表明，血蓝蛋白具有广谱抗细菌、真菌、病毒功能及独特的作用机理，有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源。
中国是海洋大国，开发和利用海洋动物血蓝蛋白资源，将为研制抗菌新药提供理想分子设计骨架和模板，为发展新的抗感染药物奠定重要基础。
提取与检测血蓝素的实验原理如下：血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。
其分子量450 000～130 000。
节肢动物的血蓝蛋白一条多肽链与一分子氧结合，含铜量0．17%；铜以二价形式与蛋白直接结合。
利用超高速冷冻离心和Sepharose 4B凝胶过滤两步法从日本血吸虫中间寄主-湖北钉螺血淋巴中提取获得一种含铜呼吸蛋白-钉螺血蓝蛋白.该血蓝蛋白具有典型的血蓝蛋白基本特征,含铜量为0.23%,在340nm处观测到该蛋白的紫外特征吸收峰.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该呼吸蛋白由两种蛋白质亚基组成,分子量分别为400KDa和250KDa.透射电子显微镜测定结果证实其四级结构为中凹的圆柱体,且以单体、二聚体和多聚体形式共存于血淋巴中.三．实验材料美洲鲎Limulus polyphemu'（东方鲎为我国二级保护动物，故不可用）。
四．实验仪器于试剂高速冷冻离心机，冰箱，垂直板电泳槽，电泳仪，精密电子天平，移液枪，恒流泵，Tris-HCl，CaCl2，MgCl2，20%蔗糖，Sepharose 4B 悬浮液等。
五．实验内容与步骤1.血蓝素的提取每只鲎都将被固定，然后使用不锈钢针刺入鲎的心包以提取输往心脏的含氧血（鲎并不会因为血液提取而死去）。
放于装有0.1ml 左右储存缓冲液（0.05M Tris-HCl 含5mM CaCl2、5mM MgCl2，pH7.0）的离心管内，后用高速冷冻离心机8000 r/min4℃离心20 分钟，将其上清液（含血蓝蛋白）转移到新的离心管内，就得到初步提取的鲎血蓝素溶液。
2.血蓝素的纯化（1）取收集的鲎血蓝素粗提液用超高速冷冻离心机于 4 °C 、190000g 离心力，离心 3.5 小时，弃去上清液，所得沉淀溶于0.05MTris-HCL（pH7.0）缓冲溶液中(含5mMCaCl2，5mMMgCl2，20%蔗糖)。
存于-20℃冰箱中备用。
（2）Sepharose 4B 凝胶过滤柱层析装柱：垂直固定好层析柱，柱底放置一层支撑网，然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入Sepharose 4B 悬浮液，让其自然沉降，直至沉积达60 ㎝高。
（装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于凝胶表面，以免混入空气而影响分离效果。
）上柱：将样品溶液在洗脱剂的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入凝胶层析柱，使2组分能够均匀地进入凝胶床（样品溶液体积不能过大，通常为凝胶床体积的10%左右，最大不能超过30%）。
打开开关，使样品溶液进入凝胶。
洗脱：吸少量缓冲液（0.05M Tris-HCl 含5mM CaCl2、5mM MgCl2，pH7.0）冲洗柱内壁2次，加洗脱剂至液层3~4㎝左右，接上恒流泵，调好流速（0.2ml/ min），开始洗脱。
所用洗脱剂体积一般为凝胶床体积的120%左右，洗脱流出液用部分收集器收集，收集组分的大小为1ml/管。
浓缩：试用旋转蒸发仪减压浓缩，烘干成粉状（有必要时刻进行重结晶）。
1.用胶管与冷凝水龙头连接，用真空胶管与真空泵相联。
2. 先将水注入加热槽。
3.打开调速开关，打开调温开关，调节其左侧旁的调温旋钮，使温度维持在60摄氏度（上下5度）4.蒸发完毕，关闭调速开关及调温开关，然后关闭真空泵，并打开冷凝器上方的放空阀，使之与大气相通，取下蒸发瓶。
3.血蓝素的检测——SDS-PAGE 电泳法测定血蓝素分子量血蓝素分子量的测定采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)，简称SDS-PAGE 电泳法。
（1）溶液配制A 液（丙烯酰胺储存液）：30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr 30g，0.8%甲叉双丙烯酰胺（Bis）：称Bis 0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中4℃贮存可用1-2个月。
B 液（4×分离胶缓冲液）：4ml10%SDS（十二烷基磺酸钠）；75ml2.0mol/L pH8.8Tris-HCl 缓冲液（称取Tris24.3g，加入50ml 水，用1mol/L 盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml）；21ml 蒸馏水。
C 液（4×堆积胶缓冲液）：4ml10%SDS（十二烷基磺酸钠）；50ml1.0mol/LpH6.8Tris-HCl 缓冲液（称取Tris12.1g，加入50ml 蒸馏水，用1mol/L 盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml）；46ml 蒸馏水。
电泳缓冲液（内含0.1%SDS，25mM Tris 碱，192 mM 甘氨酸缓冲液，pH8.3）：称Tris3.0g，甘氨酸14.4g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
5×样品缓冲液：取10%SDS 2ml，β-巯基乙醇0.5ml，1%溴酚蓝1 ml，50%甘油5 ml，0.6ml 1mol/L Tris-HCL PH6.8，最后加蒸馏水定容至10ml。
染色液（1L）：考马斯亮蓝（R-250）1.0g，甲醇450ml，冰醋酸100 ml，然后用蒸馏水定容至1L。
脱色液（1L）：冰醋酸100ml，甲醇100ml，加蒸馏水定容至1000ml。
各部分凝胶配制分离胶(8% 10ml) 堆积胶(5% 4ml)蒸馏水4.8ml 2.3mlA 液2.7ml 0.67mlB 液2.5ml —C 液—1.0ml10% AP 50µl 30µlTEMED 5µl 5µl（2）具体方法a.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，在灌胶支架上固定好。
固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
b.按比例配好分离胶，快速加入，大约5 厘米左右，加1- 2cm 高的蒸馏水密封，静置40 分钟。
c.按比例配好堆积胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm 处，迅速插入样梳，静置40 分钟。
d.拔出样梳后，在槽内加入缓冲液，要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。
e.加样前，标准蛋白在沸水中加热5 分钟，使它与SDS 能够更好的结合。
f.进样：（1）取16µl 样品溶解液于离心管内，再加入4µl 5×上样缓冲液，混合后加入梳孔，上样量为20µl；（2）取标准分子量蛋白5µl，连接电泳仪。
g.接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20mA，使所加样在堆积胶和分离胶分界处堆积成一条线进入分离胶后改为40mA，待溴酚蓝跑出胶外后继续电泳30min，停止电泳，整个过程约100min。
h.取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，用去离子水冲洗干净后，放在装有考马斯亮蓝染色液的大培养皿内，染色1 小时左右，回收染色液。
i.染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液于TS-2 型脱色摇床脱色，其间要更换脱色液数次,直到蛋白质区带清晰。
注：实验中所用标准蛋白为肌球蛋白(200KDa)，β-半乳糖苷酶(116KDa)，磷酸酶b(97.2KDa)，牛血清蛋白(66.4KDa)，卵清蛋白(44.3KDa)，磷酸苷酶(29KDa)，胰蛋白酶抑制剂(20.1KDa)，容菌酶(14.3KDa)，胰肽酶(6.5KDa)。
钥戚孔血蓝蛋白为标准血蓝素。
六．实验结果（预期）1.纯化血蓝素从500mL鲎血液中得到血蓝素约5g(参考猪血红素提取率)，经超高速离心后得到蓝色沉淀。
将此沉淀溶解于0.05MTris-HCl 缓冲液中后，进行Sepharose 4B 柱层析，经核酸蛋白检测仪，记录数据绘图，得到单一的洗脱峰(见图2-1)，说明经超高速离心后所得蓝色沉淀为相似分子大小的同种蛋白。
2.纯化血蓝素SDS-PAGE 分析假想血蓝素SDS-PAGE 分析图，则第一列为标准蛋白，第二列为KLH，第三列为血蓝蛋白样品。
参考文献：——《钉螺血蓝蛋白的提取与性质研究》张云郭道义李永东范小林国家自然科学基金资助项目(56508001)——《鲎血救人全流程》小杨2011-07-20 19:36 果壳网——鲎百度百科——血蓝素维基百科。