蛋白质高效液相色谱技术精品PPT课件
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
蛋白质高效液相色谱
生物标志物的检测
生物标志物富集
蛋白质高效液相色谱可用于富集低丰度生物标志物，提高检测灵敏度和特异性，有助于疾病的早期诊 断。
生物标志物验证
通过蛋白质高效液相色谱对潜在生物标志物进行分离和鉴定，为生物标志物的验证提供有力手段。
THANKS
感谢观看
05
蛋白质高效液相色谱的实验流程 与操作
实验流程设计
样品准备
根据实验需求，选择合 适的样品，进行预处理
和溶解。
色谱柱选择
根据蛋白质的性质和分 离要求，选择合适的色
谱柱。
流动相配置
根据实验目的和色谱条 件，配置合适的流动相。
检测器选择
根据实验需求，选择合 适的检测器，如紫外可 见光检测器、荧光检测
成熟阶段
90年代至今，随着技术的不断改进 和仪器的升级换代，蛋白质高效液 相色谱技术逐渐成熟，成为蛋白质 组学研究的重要手段。
应用领域
蛋白质组学研究
用于分离鉴定蛋白质组中的各 种蛋白质，探究蛋白质的表达
、修饰和功能。
疾病标志物发现
用于检测生物样本中与疾病相 关的蛋白质标志物，为疾病诊 断和治疗提供依据。
优点
高灵敏度、高选择性、无需 标记物。
缺点
受电极表面性质影响较大， 且对某些蛋白质的电化学响 应较弱。
04
蛋白质高效液相色பைடு நூலகம்的样品处理
蛋白质的提取与纯化
蛋白质的提取
使用适当的缓冲液和溶剂，从生 物样本中提取蛋白质。
蛋白质的纯化
通过离心、过滤、沉淀等方法去 除杂质，提高蛋白质的纯度。
蛋白质的标记与衍生化
药物研发
用于分离纯化药物目标分子， 研究药物的体内外代谢过程。
高效液相色谱法(HPLC) ppt课件
此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
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32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
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10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
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目前实验室主要用的 是超声15min左右
溶剂使用前都必须经 0.45μm滤膜过滤，以除去 杂质微粒。分清有机相滤 膜和水相滤膜，对于混合
流动相，在混合前过滤
24
蛋白样品 的性质
25
HPLC与其他色谱光谱技术的联用
HPLC
CE
MS MS
CE
UF
26
高效液相色谱—质谱
• 蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重 要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的 自动分离检测。
21
数据处理和计算机控制系统
采集 处理 分析 数据
控制 仪器
色谱 系统 优化
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准 确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在 ±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
22
流动相的要求
粘度小
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入 一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用
沸点的低固是体甲醇和乙腈与。色一谱般系情况下甲溶醇-剂水的已经 残留能 但物够推少满荐足乙多腈种-水样统做品相初的适始分应实离验，，粘与度甲小醇纯，比度价，格乙低。
腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185205nm处检测的要求。
与检测器 相适应
23
流动相的准备
调整PH
根据所分离蛋白质及 色谱柱决定
流动相脱气 滤膜过滤
相信随着新的色 谱柱和多种手段 的联用，高效液 相色谱能够在包 括蛋白质在内的 大分子物质的研 究领域里发挥更 大的作用
30
结束语
当你尽了自己的最大 努力时，失败也是伟 大的，所以不要放弃 ，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
1
1 高效液相色谱技术特点概述 2 HPLC系统各组分介绍； 3 流动相的要求及准备过程 4 HPLC色谱技术与其他技术联用
5 HPLC 应用举例 66 现5状与展望
2
高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来
的一项新颖快速的分离技术。
它是在经典液相层析法基础上，
梯重要的部件之一。其作 用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结 果的可靠性 。
ª 流量稳定 ª 流量范围宽 ª 输出压力高 ª 液缸容积小 ª 密封性能好，耐腐蚀
12
柱塞往复 泵
液缸容积小，可至0.1ml，因此易于 清洗更换流动相，特别适合再循环和 梯度洗脱 流量不受柱阻影响
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
6
一 进进样样方系式 统
隔膜进样 停流进样 *阀进样 自动进样
7
六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆 形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国 Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大
HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
上
分
样
析
8
进样方式
部分装液法
完全装液法
引进了气相层析的理论具有气
相层析的全部优点。
高灵 敏度
应用 范围广
3
根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
1 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 2 高效离子交换色谱（HPIEC） 3 高效亲和色谱（HPAFC） 4 反向高效液相色谱（RP-HPLC）
4
高效液相色谱仪
5
常用的HPLC仪
• Waters公司 • Agilent公司 • 岛津公司等
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服
13
分离系统
三 分离系统
*色谱柱
连接管
恒温器
14
色谱柱
• 柱效高 • 选择性好 • 分析速度快
15
进入色谱柱样品的处理
16
柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就 会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 • ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 • ②应逐渐改变溶剂的组成 。 • ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
17
柱的使用和维护注意事项
• ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避 免固定相被破坏。
• ⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱 柱之间连接一保护柱。
• ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内 的杂质。
18
四 检测系统
19
噪音低
灵敏度高
要求
重复 性好
适用范 围广
20
UV 检测器
进样量应不大于定量 环体积的50%（最多 75％），并要求每次 进样体积准确、相同 。 缺点是易产生由进样
引起的峰展宽
进样量应不小于定量 环体积的5~10倍（最 少3倍），这样才能 完全置换定量环内的 流动相，消除管壁效 应，确保进样的准确 度及重复性
10
高压输 液泵
二 输液系统
输液系统
在线脱 气装置
B相:乙腈;
流速:
1mL/min
B相体积分数 变化为:0～15 min, 15%～
25.5% ;
。 15～21 min,
25.5%
进样量 20μL 柱温 25 ℃
28
29
现状与展望
高效液相色谱目 前多用于蛋白质 的定量分析，对 于大样品的分离 纯化成本较高且 费时，有待进一 步优化其条件或 找到适于分离纯 化蛋白质的方法。
高效液相色谱—毛细管电泳
当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各 自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术 特别适合细胞或组织中蛋白质的分离
27
反相高效液相色谱法对 血清中胰岛素的测定
色谱柱 流动相
梯度 洗脱
其他
C5 柱(100
mm*4.6mm 5μm，Ph-
enomenex 公司，美国
A 相: 10mmol/L Tris缓冲液 (pH 8.5) ;