蛋白质高效液相色谱技术精品PPT课件
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17
柱的使用和维护注意事项
• ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避 免固定相被破坏。
• ⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱 柱之间连接一保护柱。
• ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内 的杂质。
18
四 检测系统
19
噪音低
灵敏度高
要求
重复 性好
适用范 围广
20
UV 检测器
目前实验室主要用的 是超声15min左右
溶剂使用前都必须经 0.45μm滤膜过滤，以除去 杂质微粒。分清有机相滤 膜和水相滤膜，对于混合
流动相，在混合前过滤
24
蛋白样品 的性质
25
HPLC与其他色谱光谱技术的联用
HPLC
CE
MS MS
CE
UF
26
高效液相色谱—质谱
• 蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重 要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的 自动分离检测。
B相:乙腈;
流速:
1mL/min
B相体积分数 变化为:0～15 min, 15%～
25.5% ;
。 15～21 min,
25.5%
进样量 20μL 柱温 25 ℃
28
29
现状与展望
高效液相色谱目 前多用于蛋白质 的定量分析，对 于大样品的分离 纯化成本较高且 费时，有待进一 步优化其条件或 找到适于分离纯 化蛋白质的方法。
进样量应不大于定量 环体积的50%（最多 75％），并要求每次 进样体积准确、相同 。 缺点是易产生由进样
引起的峰展宽
进样量应不小于定量 环体积的5~10倍（最 少3倍），这样才能 完全置换定量环内的 流动相，消除管壁效 应，确保进样的准确 度及重复性
10
高压输 液泵
二 输液系统
输液系统
在线脱 气装置
6
一 进进样样方系式 统
隔膜进样 停流进样 *阀进样 自动进样
7
六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆 形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国 Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大
HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
上
分
样
析
8
进样方式
部分装液法
完全装液法
高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
1
1 高效液相色谱技术特点概述 2 HPLC系统各组分介绍； 3 流动相的要求及准备过程 4 HPLC色谱技术与其他技术联用
5 HPLC 应用举例 66 现5状与展望
2
高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来
的一项新颖快速的分离技术。
它是在经典液相层析法基础上，
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服
13
分离系统
三 分离系统
*色谱柱
连接管
恒温器
14
色谱柱
• 柱效高 • 选择性好 • 分析速度快
15
进入色谱柱样品的处理
16
柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就 会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 • ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 • ②应逐渐改变溶剂的组成 。 • ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
21
数据处理和计算机控制系统
采集 处理 分析 数据
控制 仪器
色谱 系统 优化
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准 确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在 ±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
22
流动相的要求
粘度小
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入 一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
相信随着新的色 谱柱和多种手段 的联用，高效液 相色谱能够在包 括蛋白质在内的 大分子物质的研 究领域里发挥更 大的作用
30
结束语
当你尽了自己的最大 努力时，失败也是伟 大的，所以不要放弃 ，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
高效液相色谱—毛细管电泳
当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各 自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术 特别适合细胞或组织中蛋白质的分离
27
反相高效液相色谱法对 血清中胰岛素的测定
色谱柱 流动相
梯度 洗脱
其他
C5 柱(100
mm*4.6mm 5μm，Ph-
enomenex 公司，美国
A 相: 10mmol/L Tris缓冲液 (pH 8.5) ;
引进了气相层析的理论具有气
相层析的全部优点。
高灵 敏度
应用 范围广
3
根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
1 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 2 高效离子交换色谱（HPIEC） 3 高效亲和色谱（HPAFC） 4 反向高效液相色谱（RP-HPLC）
4
高效液相色谱仪
5
常用的HPLC仪
• Waters公司 • Agilent公司 • 岛津公司等
梯度仪
11
高压输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作 用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结 果的可靠性 。
ª 流量稳定 ª 流量范围宽 ª 输出压力高 ª 液缸容积小 ª 密封性能好，耐腐蚀
12
柱塞往复 泵
液缸容积小，可至0.1ml，因此易于 清洗更换流动相，特别适合再循环和 梯度洗脱 流量不受柱阻影响
沸点的低固是体甲醇和乙腈与。色一谱般系情况下甲溶醇-剂水的已经 残留能 但物够推少满荐足乙多腈种-水样统做品相初的适始分应实离验，，粘与度甲小醇纯，比度价，格乙低。
腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185205nm处检测的要求。
与检测器 相适应
23
流来自百度文库相的准备
调整PH
根据所分离蛋白质及 色谱柱决定
流动相脱气 滤膜过滤
柱的使用和维护注意事项
• ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避 免固定相被破坏。
• ⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱 柱之间连接一保护柱。
• ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内 的杂质。
18
四 检测系统
19
噪音低
灵敏度高
要求
重复 性好
适用范 围广
20
UV 检测器
目前实验室主要用的 是超声15min左右
溶剂使用前都必须经 0.45μm滤膜过滤，以除去 杂质微粒。分清有机相滤 膜和水相滤膜，对于混合
流动相，在混合前过滤
24
蛋白样品 的性质
25
HPLC与其他色谱光谱技术的联用
HPLC
CE
MS MS
CE
UF
26
高效液相色谱—质谱
• 蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重 要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的 自动分离检测。
B相:乙腈;
流速:
1mL/min
B相体积分数 变化为:0～15 min, 15%～
25.5% ;
。 15～21 min,
25.5%
进样量 20μL 柱温 25 ℃
28
29
现状与展望
高效液相色谱目 前多用于蛋白质 的定量分析，对 于大样品的分离 纯化成本较高且 费时，有待进一 步优化其条件或 找到适于分离纯 化蛋白质的方法。
进样量应不大于定量 环体积的50%（最多 75％），并要求每次 进样体积准确、相同 。 缺点是易产生由进样
引起的峰展宽
进样量应不小于定量 环体积的5~10倍（最 少3倍），这样才能 完全置换定量环内的 流动相，消除管壁效 应，确保进样的准确 度及重复性
10
高压输 液泵
二 输液系统
输液系统
在线脱 气装置
6
一 进进样样方系式 统
隔膜进样 停流进样 *阀进样 自动进样
7
六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆 形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国 Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大
HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
上
分
样
析
8
进样方式
部分装液法
完全装液法
高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
1
1 高效液相色谱技术特点概述 2 HPLC系统各组分介绍； 3 流动相的要求及准备过程 4 HPLC色谱技术与其他技术联用
5 HPLC 应用举例 66 现5状与展望
2
高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来
的一项新颖快速的分离技术。
它是在经典液相层析法基础上，
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服
13
分离系统
三 分离系统
*色谱柱
连接管
恒温器
14
色谱柱
• 柱效高 • 选择性好 • 分析速度快
15
进入色谱柱样品的处理
16
柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就 会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 • ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 • ②应逐渐改变溶剂的组成 。 • ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
21
数据处理和计算机控制系统
采集 处理 分析 数据
控制 仪器
色谱 系统 优化
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准 确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在 ±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
22
流动相的要求
粘度小
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入 一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
相信随着新的色 谱柱和多种手段 的联用，高效液 相色谱能够在包 括蛋白质在内的 大分子物质的研 究领域里发挥更 大的作用
30
结束语
当你尽了自己的最大 努力时，失败也是伟 大的，所以不要放弃 ，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
高效液相色谱—毛细管电泳
当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各 自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术 特别适合细胞或组织中蛋白质的分离
27
反相高效液相色谱法对 血清中胰岛素的测定
色谱柱 流动相
梯度 洗脱
其他
C5 柱(100
mm*4.6mm 5μm，Ph-
enomenex 公司，美国
A 相: 10mmol/L Tris缓冲液 (pH 8.5) ;
引进了气相层析的理论具有气
相层析的全部优点。
高灵 敏度
应用 范围广
3
根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
1 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 2 高效离子交换色谱（HPIEC） 3 高效亲和色谱（HPAFC） 4 反向高效液相色谱（RP-HPLC）
4
高效液相色谱仪
5
常用的HPLC仪
• Waters公司 • Agilent公司 • 岛津公司等
梯度仪
11
高压输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作 用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结 果的可靠性 。
ª 流量稳定 ª 流量范围宽 ª 输出压力高 ª 液缸容积小 ª 密封性能好，耐腐蚀
12
柱塞往复 泵
液缸容积小，可至0.1ml，因此易于 清洗更换流动相，特别适合再循环和 梯度洗脱 流量不受柱阻影响
沸点的低固是体甲醇和乙腈与。色一谱般系情况下甲溶醇-剂水的已经 残留能 但物够推少满荐足乙多腈种-水样统做品相初的适始分应实离验，，粘与度甲小醇纯，比度价，格乙低。
腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185205nm处检测的要求。
与检测器 相适应
23
流来自百度文库相的准备
调整PH
根据所分离蛋白质及 色谱柱决定
流动相脱气 滤膜过滤