扫描电镜工作原理及制样方法
扫描电镜制样
扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。
取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。
三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。
2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。
样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。
如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。
3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。
4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。
5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。
6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。
扫描电镜标本制备技术[资料]
![扫描电镜标本制备技术[资料]](https://img.taocdn.com/s3/m/7880bfcdcf2f0066f5335a8102d276a2002960c6.png)
扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。
透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。
由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。
一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。
2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。
3.导电性能要好，应进行导电处理。
4.二次电子的发射率要高。
5.注意确认和保护样品的观察面。
尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。
(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。
2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。
3.取材部位要准确。
观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。
观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。
为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。
4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。
5.操作应在低温(0～4℃)下进行。
(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。
扫描电镜SEM样品制备
二、实验用品
1. 材料
2.
植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
3. 2. 试剂
4.
丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、
磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导
电胶等。
5. 3. 器材
6.
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
• 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： • 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 • 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
扫描电镜基本工作原理
卡斯坦的设想一提出来之后，立即为欧洲和美国的许多科学工作者所采 用，他们最早是把电子显微镜经过适当改装使其成为电子探针，其分辨率 和测量的精度从今天的角度来看，当然是很低的，只能作一些定性的工作， 但即使这样，也使急于想探索1μ或几μ这样微小区域中的化学组成的科学 工作者感到极大的兴奋，使他们更加努力去进一步改进仪器。第一台商品 型电子探针由法国卡梅卡（CAMECA）公司在卡斯坦的直接指导下于1956年 首先制成。在这同一时期，苏联的洛夫斯基（Lopofckuji ）也独立的发展 了电子探针的概念。并装置了一台结构大体类似的仪器。卡斯坦的第一台 探针并不具有电子束扫描的功能，其后1959年英国的卡斯列特（Cosslett） 和邓克姆布（Duncumt ）又将其进一步改进，使其具有在试样表面的一定 面积上扫描的功能。
早在1938年,Von.Ardence（冯.阿尔顿）将扫描线圈加到 透射电子显微镜上（TEM），制成了第一台扫描透射电子显微 镜（STEM），该仪器有两个会聚透镜,扫描线圈就置于两个透 镜之间,放大倍数8000X，分辨率在500～1000 Å之间。第一台
检 验 厚 样 品 的 用 二 次 电 子 束 成 象 的 SEM 是 在 1942 年 由 Zworykim 等制成，当时的分辨率仅达到1μm 。直到1952年，
2.二次电子的收集 二次电子常用装在样品室侧面的闪烁体——光电倍增
管检测器检测。入射电子产生的二次电子被加有+100V 至+200V偏压的栅网收集。闪烁体表面有几十个纳米厚 的导电铝膜，在其加上+10KV偏压。穿过收集栅网的二 次电子被加速到闪烁体。具有加速电子的能量，足以 使闪烁体发光，光强度与二次电子数量成正比。闪烁 体发出的光量子通过光导管送到光电倍增管转换成电 压信号，用来调制阴极束。
材料检测表征方法之扫描电镜
材料检测表征方法之扫描电镜自从1965年第一台商品扫描电镜问世以来，经过40多年的不断改进，扫描电镜的分辨率从第一台的25nm提高到现在的0.01nm，而且大多数扫描电镜都能与X射线波谱仪、X射线能谱仪等组合，成为一种对表面微观世界能够经行全面分析的多功能电子显微仪器。
在材料领域中，扫描电镜技术发挥着极其重要的作用，被广泛应用于各种材料的形态结构、界面状况、损伤机制及材料性能预测等方面的研究。
利用扫描电镜可以直接研究晶体缺陷及其产生过程，可以观察金属材料内部原子的集结方式和它们的真实边界，也可以观察在不同条件下边界移动的方式，还可以检查晶体在表面机械加工中引起的损伤和辐射损伤等。
1、扫描电镜的结构及主要性能扫描电镜可粗略分为镜体和电源电路系统两部分。
镜体部分由电子光学系统、信号收集和显示系统以及真空抽气系统组成。
1.1 电子光学系统由电子枪，电磁透镜，扫描线圈和样品室等部件组成。
其作用是用来获得扫描电子束，作为信号的激发源。
为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。
1.2 信号收集及显示系统检测样品在入射电子作用下产生的物理信号，然后经视频放大作为显像系统的调制信号。
现在普遍使用的是电子检测器，它由闪烁体，光导管和光电倍增器所组成。
1.3 真空系统真空系统的作用是为保证电子光学系统正常工作，防止样品污染，一般情况下要求保持10-4~10-5Torr的真空度。
1.4 电源系统电源系统由稳压，稳流及相应的安全保护电路所组成，其作用是提供扫描电镜各部分所需的电源。
2、扫描电镜工作原理扫描电镜由电子枪发射出来的电子束，在加速电压的作用下，经过磁透镜系统汇聚，形成直径为5nm，经过二至三个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成一个细的电子束聚焦在样品表面。
在末级透镜上边装有扫描线圈，在它的作用下使电子束在样品表面扫描。
由于高能电子束与样品物质的交互作用，结果产生了各种信息：二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和透射电子等。
扫描电子显微镜(制样)
利用液体CO2（临界状态31℃ ）置换醋酸异戊酯
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（六）镀膜
生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带 电，导电性能也差，当入射电子束打到标本上时， 就会产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影 响周围电子束的扫描和二次电子的发射，严重影 响成像甚至无法成像
（四）脱水
逐级增高浓度的丙酮或乙醇脱水 然后进入中间液（醋酸异戊酯：与CO2互溶性很好）置换
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（五）干燥 ★ 样品经脱水后，仍被脱水剂占有
必须除去脱水剂，使其真正干燥
★ 干燥会引起样品体积变化和表面改变，
要保存生物样品表面的微细结构又要使生 物样品达到干燥的目的就要避免表面张力 的影响
现有的方法： 1、 临界点干燥法
2、 冷冻干燥法
3、 空气干燥法等
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1.临界点干燥法 ▲ 目的是避免表面张力的影响，较好地保存
样品的微细结构 ▲ 利用物质在临界状态时表面张力等于零
的特性，使样品的液体完全气化并以气体 方式排掉，来达到标本干燥的目的
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原理：
物质有固体、液态和气态三种状态 通常以单相状态存在，温度和压力改变时互相 转化
扫描电子显微镜 （Scanning Electron Microscopy
SEM）
材化0801 孟岩 李民 王洪志 张俊
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扫描电子显微镜
（Scanning Electron Microscopy SEM）
1942年 第一台扫描电子显微镜 60年代 分辨率和图像质量的大大的改善 80年代 广泛应用于医学、生物学等领域 90年代 高分辨型扫描电镜的分辨率0.2nm
扫描电镜原理及样品处理
扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年便已被提出来了。
1942年，英国首先制成一台实验室用的扫描电镜，但由于成像的分辨率很差，照相时间太长，所以实用价值不大。
经过各国科学工作者的努力，尤其是随着电子工业技术水平的不断发展，到1956年开始生产商品扫描电镜。
近数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促进了各有关学科的发展。
一．扫描电镜的特点和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点：(一) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。
(二) 样品制备过程简单，不用切成薄片。
(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察。
(四) 景深大，图象富有立体感。
扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍。
(五) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。
可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。
分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm。
(六) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。
(七) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。
二．扫描电镜的结构和工作原理(一) 结构1．镜筒镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。
其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm)，并且使该电子束在样品表面扫描，同时激发出各种信号。
2．电子信号的收集与处理系统在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号，其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。
在上述信号中，最主要的是二次电子，它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，产生于样品表面以下几nm至几十nm的区域，其产生率主要取决于样品的形貌和成分。
通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像，它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。
检测二次电子的检测器(图15(2)的探头是一个闪烁体，当电子打到闪烁体上时，1就在其中产生光，这种光被光导管传送到光电倍增管，光信号即被转变成电流信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送到显像管的栅极。
扫描电镜原理、方法及操作
一、分析测试步骤开机1、接通循环水（流速1.5～2.0L/min ）2、打开主电源开关。
3、在主机上插入钥匙，旋至“Start ”位置。
松手后钥匙自动回到“on ”的位置，真空系统开始工作。
4、等待10秒钟，打开计算机运行。
5、点击桌面的开始程序。
6、点击［JEOL ·SEM ］及［JSM-5000主菜单］。
7、约20分钟仪器自动抽高真空，真空度达到后，电子枪自动加高压，进入工作状态。
8、通过计算机可以进行样品台的移动，改变放大倍数、聚焦、象散的调整， 直到获得满意的图像9、对于满意的图像可以进行拍照、存盘和打印。
10、若需进行能谱分析，要提前1小时加入液氮，并使探测器进入工作状态。
11、打开能谱部分的计算机进行谱收集和相应的分析。
12、需观察背散射电子像时，工作距离调整为15mm ，然后插入背散射电子探测器，用完后随时拔出。
更换样品1、点击“HTon ”,出现“HT Ready ”。
2、点击“Sample ”,再点击“Vent ”。
3、50秒后拉出样品台,从样品台架上取出样品台.4、更换样品后,关上样品室门,再点击“EVAC ”,真空系统开始工作,重复开机10.1.8、10.1.9。
关机1、点击［EXIT ］,再点击［OK ］,扫描电镜窗口关闭,回到视窗桌面上.2、电击桌面上的［Start ］。
3、退出视窗,关闭计算机.4、关闭控制面板上的电源开关.5、等待15分钟后关掉循环水.6、关掉总电源.二. 方法原理1、扫描电镜近况及其进展扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年已经被提出来了，直到1956年才开始生产商品扫描电镜。
商品扫描电镜的分辨率从第一台的25nm 提高到现在的0.8nm ，已经接近于透射电镜的分辨率，现在大多数扫描电镜都能同X 射线波谱仪、X 射线能谱仪和自动图像分析仪等组合，使得它是一种对表面微观世界能够进行全面分析的多功能的电子光学仪器。
数十年来，扫描电镜已广泛地应用在材料学、冶金学、地矿学、生物学、医学以及地质勘探，机械制造、生产工艺控制、产品质量控制等学科和领域中，促进了各有关学科的发展。