实验思考题

实验一
1蒽酮法测定水溶性糖的原理及注意事项。

原理：略
注意事项：蒽酮试剂是用浓硫酸配制，使用时注意安全；实验前注意给试管编号，避免混淆；移液管不能混用；加试剂时应在冰水浴中完成；比色测定时注意比色皿的润洗。

2蒽酮法测定总糖过程中，冰浴有何作用？
答：加入蒽酮后会放热，促使蒽酮与糖发生反应。

冰浴可使蒽酮与糖的反应停滞，待所有试管均加完后同时放入沸水浴使反应同时进行。

实验二
1薄层层析法分离氨基酸实验中，影响Rf值大小的因素有哪些？
答：待测物质结构与极性；层析溶剂性质（物质组成和比例）；pH值的影响(溶剂、滤纸和样品的pH值)；温度；薄层胶质地是否均匀，薄厚是否适当；展层的方式(上行、下行)；样品中的盐分杂质；点样量等。

实验三
简述茚三酮法测定氨基酸含量的原理。

答：茚三酮与氨基酸在弱酸的溶液中共热，反应首先释放氨气，茚三酮自身被还原成还原型茚三酮，而后茚三酮和还原型茚三酮及氨气反应生成紫色复合物，该复合物在470nm处有最大吸收。

且该复合物的浓度与氨基酸的含量成正比。

而亚氨基酸与茚三酮反应，则生成黄色化合物，最大吸收峰在440nm。

实验四
1制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
pH要准确调到4.7。

实验五
1简述考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法的特点。

答：考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0-10000ug/ml），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克
级蛋白质含量，所以是一种较好的蛋白质定量测定方法。

2制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中的溶液纵向倒转混合？
使蛋白质和染料充分混匀、接触，发生反应。

3根据下列所给条件和要求选择合适的测定方法。

（1）样品不易溶解，但要求测定结果比较准确。

（2）要求在短时间内测定大量样品。

（3）要求很迅速地测定一系列试管中溶液的蛋白质浓度。

答：（1）凯氏定氮法
（2）紫外法
（3）考马斯亮蓝G-250染色法
实验六
1为什么在样品中加含有少量溴酚蓝的40%的蔗糖溶液？
溴酚蓝作指示剂用，因为溴酚蓝分子量小，在电场中泳动速度快，再加上颜色为兰色易于观察，可以指示电泳前沿。

40％蔗糖溶液由于密度大，抗对流，防止样品上浮扩散。

2简述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理。

答：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。

蛋白质在PAGE时，它的迁移率取决于它所带的净电荷（电荷效应）以及分子大小和形状（分子筛效应）等因素。

蛋白质的净电荷决定于环境的PH，pH<pI时,蛋白质带正电荷, pH>pI时,蛋白质带负电荷，离等电点越远,荷电越多。

在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

实验七
1 DNA提取实验中，所用以下试剂的作用分别是什么？
0.14M氯化钠：溶解核糖核蛋白
：EDTA用于螯合金属离子，抑制DNase活性
0.15M EDTA-Na
2
25% SDS：使DNA与蛋白质分开；此外可使酶变性
氯仿-异丙醇混合液：将蛋白质沉淀除去
95%乙醇：使DNA析出
2 DNA提取实验中如何除去RNA和蛋白质？
答：动物组织细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)大部分与蛋白质结合成核蛋白。

在浓氯化钠(1-2M)溶液中, 脱氧核糖核蛋白的溶解度大, 核糖核蛋白的溶解度小。

在稀氯化钠(0.14M)溶液中, 脱氧核糖核蛋白的溶解度小, 核糖核蛋白的溶解度大。

因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白分开。

将抽提得到的核蛋白用SDS处理,DNA即与蛋白质分开,蛋白质可用氯仿-异丙醇沉淀除去,而DNA则溶于溶液中,加入适量乙醇，DNA即析出。

实验八
1α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同？作用特点有何不同？（20分）
答：酶性质：（1）α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；（2）β-淀粉酶不耐热，在70℃下15Min则被钝化
作用特点：（1）α-淀粉酶无差别地切断α－1，4-糖苷键，内切酶，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。

（2）β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链，外切酶。

可将直链淀粉完全分解成麦芽糖和少量的葡萄糖。

作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

2测定麦粒中淀粉酶酶活时为什么要减掉对照管中麦芽糖的含量？
在本实验中从发芽麦粒中提取酶液，作用于淀粉生成麦芽糖，用单位时间内产生麦芽糖的量来表示酶的活性。

而酶液中本来就含有淀粉酶作用于麦粒中贮存的淀粉而产生麦芽糖，因此要将这部分麦芽糖减掉才能准确的计算出淀粉酶的活力。

实验九
1何为同工酶？同工酶电泳实验中，同工酶染色用何种试剂？
答：同工酶是催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。

实验中过氧化物同工酶的染色使用的是联苯胺。

2简述应用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物同工酶的原理。

（略）
重点复习：每个实验的原理和思考题。