抗体的人源化
什么是抗体人源化
什么是抗体人源化目前，用细胞工程制备人单抗在技术上和伦理上都存在一些难题，治疗性抗体的开发就集中在具有治疗前景的鼠源单抗上。
但是鼠源单抗对人体具有异源性反应，可诱发人抗鼠抗体效应（Human anti-mouse antibodies, HAMA反应），使得单抗的治疗效果明显滞后。
随着基因重组技术的发展和人们对抗体结构认识的深入，研究者们尝试对鼠源性抗体进行改造，致力于在保留与抗原结合的高亲和力的基础上，减少异源性抗体的免疫原性，推动抗体人源化研发的进程。
人源化抗体主要指以用基因克隆及DNA重组技术对鼠源单克隆抗体改造，重新表达产生的抗体。
其大部分氨基酸序列被人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。
嵌合抗体和CDR移植抗体根据人源化程度不同，单抗又可分为嵌合抗体（60%-70%人源化氨基酸序列）和CDR(complementarity-determining region)移植抗体（90%-95%人源化氨基酸序列）。
1、人-鼠嵌合抗体人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）：第一代人源化抗体。
其是在基因水平上将鼠源单克隆抗体的V区和人抗体的C区(variable region, 可变区)连接，在合适的宿主细胞内表达可得到人-鼠嵌合抗体。
嵌合抗体用于人体所产生的HAMA反应比鼠源单抗明显减弱；另外，人源C区(constant region，恒定区)可更有效地介导人体一些免疫反应，如CDC（complement-dependent cytotoxicity, CDC, 依赖补体的细胞毒性作用），ADCC（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）。
2、CDR移植抗体嵌合抗体虽然可以部分解决异种蛋白的排斥问题，但由于其还含有鼠源V区，依然有可能会诱发HAMA反应，干扰抗体疗效，诱发超敏反应，在临床上其应用会受到一定限制。
人源化抗体
人源化抗体人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。
然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。
因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。
经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。
人源化抗体技术重构抗体重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。
构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。
表面重塑抗体表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。
表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得人源化后的表面重塑抗体V区基因；④克隆入相应的表达载体进行表达，并分析改造后的抗原结合情况。
去免疫化抗体去免疫化抗体的构建与前面介绍的其他人源化抗体技术类似，其技术流程主要分为以下5个步骤：①建立亲本鼠单抗的三位结构分子模型，通常需要在最大同源性已知三维结构抗体的三维结构模型的引导下，由相应的计算机软件完成；②利用相关的公用数据库，来寻找鼠单抗序列可能的人T细胞识别表位，也允许同时通过体外试验来确定可能的人T细胞识别表位；③通过以人胚系VH和VL基因为模板并与之比对，结合已有的不破坏原抗体结构和抗原结合位点的人源化抗体改造规律，确定需要被替换的残基；④通过分子模拟检验这些被替换的残基；⑤表达改造后的抗体，并检验改造的效果。
抗体的人源化课件
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双特异性抗体和双功能抗体
双特异性抗体和双功能抗体将一种抗体分 子与另一种抗体分子或功能分子如毒素、酶、 细胞因子、放射毒素等结合形成， 具有特异 性高，针对性强，用量少，副作用小的优点， 在肿瘤临床治疗中有着重要的意义。
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重组Fab成功案例
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小分子抗体的优点：
1. 制备方法较其他基因工程抗体简单。 2.免疫原性要比原来的McAb弱得多。如果将改形抗体构
建成小分子抗体，更有可能消除其免疫原性。 3.由于分子量小，小分子抗体更容易通过血管壁，穿
透实体瘤，有利于肿瘤的治疗。 4.由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，更能
通过噬菌体呈现技术(phage display)产 生亲和力和特异性更强的ScFv。
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ห้องสมุดไป่ตู้
3. 重组单链ScFv抗体的应用
由于ScFv分子量小，免疫原性小，且易穿透 致密的肿瘤屏障，进入实体瘤周围的微循环，缺 乏Fc片段，去除Fc介导的受体结合，使得其 快 速地向肿瘤集中，因此通过与毒素基因重组，抗 体将毒素定位于靶细胞，对靶细胞进行特异 杀 伤。
一 . 概念
将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植 到人抗体可变区框架中而制成的抗体。
此抗体可明显降低由鼠源单克隆抗体所 致的人抗鼠抗体反应。
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人源化抗体类型
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人－鼠嵌合抗体
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人－鼠嵌合抗体
1．恒定区人源化--鼠/人嵌合抗体制备原理：
使从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别 出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig 恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成 鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞， 通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。
抗体人源化思路
重组抗IL-1R人源化抗体制备思路：
1.制备生产高亲和力的抗IL-1R鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株；→
2.杂交瘤细胞总RNA提取，用RT-PCR 技术克隆鼠源单抗可变区基因；→
3.IL-1R鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的分析；→
4.IL-1R鼠源单克隆抗体相应可变区片段（Fv）的模型构建；→
5.人抗体接纳体构架氨基酸序列的分析和选择；→
6.人源化抗体的设计和实际构建；
（设计、构建策略：
①模板替换，使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR；
②表面重塑，对鼠CDR和FR表面残基进行镶饰或重塑，使类似于人抗体CDR
的轮廓或人FR的型式；
③补偿变换，对起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植；
④定位保留，人源化单抗以人FR保守序列为模板，但保留了鼠源单抗可变
区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基；）→
7.将构建的抗体重轻链基因电转化到CHO细胞中，制备获得抗IL-1R重组抗体；
8.通过体外和/或体内测定方式证实制备抗体具有高亲和力及高特异性；
9.获得产生抗IL-1R人源化抗体的单克隆细胞株。
抗体人源化是什么？
抗体人源化是什么？
抗体人源化，是重组抗体（单克隆抗体）生产制备实验研究的重要组成部分。
所谓抗体人源化，为从鼠源性抗体往人源性抗体发展的过程。
百余年前，抗体与抗原特异性结合、抗体被动免疫特性等原理的揭示，开辟了疾病诊断的新途径。
而1975年单克隆抗体技术的问世，加快了这一方法的广泛应用。
初期，临床上使用的单抗多数为鼠源性单抗，由于人和小鼠的种属特异性，鼠源性抗体的使用存在种种限制。
鼠抗体虽然对靶抗原是特异的，可以与靶抗原特异性结合，但它不能激活相应的人体效应系统，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)等，从而无法正常的发生抗原-抗体反应；此外，鼠抗体作为外源蛋白进入人体，会使人体免疫系统产生应答，产生以鼠抗体作为抗原的特异性抗体，即产生人抗鼠抗体(human anti．mouse antibody，HAMA)，通常异源蛋白在人体内会很快得到清除，半衰期很短。
由于鼠源性抗体在临床应用上存在种种限制，人们利用重组DNA技术对鼠源抗体进行人源化改造，使抗体人源化。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是指将动物来源的抗体（如小鼠抗体）转化为人源化的抗体，以增强其在人体内的稳定性和效力。
这一技术的研发和应用，为人类在治疗疾病方面带来了革命性的变革。
本文将介绍抗体人源化的主要原理，从基因工程的角度解释其实现方法。
抗体人源化的主要原理基于两个关键概念：可变区和框架区。
可变区决定了抗体的特异性，而框架区则决定了抗体的稳定性和结构。
在动物来源的抗体中，可变区和框架区通常相互关联，难以分离。
为了实现抗体人源化，需要对这两个区域进行调整和优化。
人源化抗体的设计通常涉及到克隆和表达人类免疫球蛋白基因。
其中，免疫球蛋白基因是一种编码抗体的基因，包括了可变区和框架区。
通过克隆和表达人类免疫球蛋白基因，可以获得人类免疫球蛋白。
为了使人源化抗体具有与动物来源抗体相似的特异性和效力，需要将动物来源抗体的可变区与人类免疫球蛋白基因的框架区进行重组。
这一步骤需要利用基因工程技术，将动物来源抗体的可变区和人类免疫球蛋白基因的框架区进行融合。
通过这种方式，可以将动物来源抗体的特异性与人类免疫球蛋白的结构相结合，实现抗体人源化。
在抗体人源化的过程中，还需要考虑到抗体的亲和力和稳定性。
亲和力是指抗体与靶标结合的紧密程度，而稳定性则是指抗体在人体内的耐受性和长期效果。
为了增强抗体的亲和力和稳定性，可以通过点突变和序列优化的方法进行改良。
点突变是指通过人工改变抗体分子中的一个或多个氨基酸残基，以增强其与靶标的结合能力。
序列优化则是指通过人工改变抗体分子的氨基酸序列，以增强其稳定性和生物活性。
抗体人源化的主要原理可以总结为：克隆和表达人类免疫球蛋白基因，重组动物来源抗体的可变区和人类免疫球蛋白基因的框架区，通过点突变和序列优化的方法进行改良，以获得具有高亲和力和稳定性的人源化抗体。
抗体人源化技术的发展和应用，为药物研发和临床治疗提供了新的途径。
相比于动物来源的抗体，人源化抗体在人体内的稳定性和效力更高，副作用更少。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种生物技术手段，用于将动物源性抗体转化为人源性抗体，以提高其在临床应用中的效果和安全性。
这一技术的主要原理是通过基因工程方法将动物免疫系统中产生抗体的基因导入到人体细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的人源性抗体。
抗体是人体免疫系统中的重要组成部分，其能够识别并结合到入侵体内的病原体或异常细胞，从而触发免疫反应，清除这些病原体或异常细胞。
然而，由于动物源性抗体与人体内抗原的差异，使用动物源性抗体在临床应用中存在一些问题，如免疫原性反应、抗体产量低、抗体结构与功能的不稳定等。
为克服这些问题，科学家们开展了抗体人源化的研究。
首先，需要从动物中提取抗体基因，通常是通过免疫动物模型来获得。
然后，利用基因克隆技术将这些抗体基因导入到人源细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的抗体。
这一过程主要包括以下几个步骤：1. 抗体基因的选择和克隆：从动物的淋巴细胞中提取抗体基因，通常是通过PCR技术扩增目标基因。
然后，将扩增的基因序列进行纯化和克隆，得到抗体基因的克隆片段。
2. 基因导入和表达：将抗体基因导入到人源细胞中，通常是通过转染等技术实现。
导入后，细胞会利用其自身的机制进行基因的表达和蛋白质的合成，从而产生人源性抗体。
3. 抗体的筛选和优化：通过筛选和优化的方法，从转染的细胞中筛选出产生目标抗体的细胞株。
同时，可以通过基因工程方法对抗体的结构和功能进行优化，以提高抗体的亲和力和稳定性。
4. 抗体的大规模生产：一旦获得了产生目标抗体的细胞株，就可以进行大规模的抗体生产。
通常采用的方法是利用细胞培养技术，将产生目标抗体的细胞株培养在培养基中，通过细胞的分裂和增殖，大量产生目标抗体。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程方法将动物免疫系统中产生抗体的基因导入到人体细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的人源性抗体。
这一技术的应用广泛，不仅可以用于治疗各种疾病，如肿瘤、感染性疾病等，还可以用于研究和诊断。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种重要的生物技术，它可以将动物源性抗体转化为人源性抗体，从而提高抗体的稳定性和效力。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组，从而得到具有人源性的抗体。
抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质分子，它们在人体的免疫系统中起着重要的作用。
传统上，抗体是从动物体内提取的，如小鼠、兔子等。
然而，这些动物源性抗体在临床应用中存在一些问题，如免疫原性反应、免疫复合物形成等。
因此，研究人员开始探索将动物源性抗体转化为人源性抗体的方法。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组，从而得到具有人源性的抗体。
具体来说，抗体人源化的过程包括以下几个步骤：1. 克隆动物源性抗体的基因序列。
这一步骤通常通过PCR技术从动物体内提取的抗体细胞中扩增出抗体基因序列。
2. 选择人源性抗体的框架区域。
人源性抗体的框架区域是指抗体分子中不参与抗原结合的区域，它们具有较高的稳定性和低的免疫原性。
因此，选择人源性抗体的框架区域可以提高抗体的稳定性和降低免疫原性。
3. 将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组。
这一步骤通常通过PCR技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行连接，从而得到具有人源性的抗体。
4. 通过表达和纯化技术得到抗体。
将重组后的抗体基因序列导入表达系统中，通过表达和纯化技术得到具有人源性的抗体。
抗体人源化的主要优点是可以提高抗体的稳定性和效力，降低免疫原性反应和免疫复合物形成等问题。
此外，抗体人源化还可以减少动物实验的使用，从而降低动物伦理问题和成本。
总之，抗体人源化是一种重要的生物技术，它可以将动物源性抗体转化为具有人源性的抗体，从而提高抗体的稳定性和效力。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组。
随着生物技术的不断发展，抗体人源化技术将在临床应用中发挥越来越重要的作用。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种重要的生物工程技术，通过对抗体进行基因工程改造，使其具备与人类抗体相似的结构和功能，从而增强其在治疗和诊断领域的应用。
抗体人源化的主要原理包括人源化基因设计、基因克隆、表达和纯化等步骤。
人源化基因设计是抗体人源化的关键步骤之一。
一般来说，人源化的抗体是通过将小鼠源抗体的可变区与人源抗体的框架区（FR）进行重组来实现的。
在设计人源化基因时，需要选择与小鼠源抗体可变区高度同源的人源抗体可变区作为替代。
这样，可以保留小鼠源抗体的结构和功能，同时减少人体免疫系统对抗体的排斥反应。
基因克隆是将人源化基因插入真核表达载体的过程。
首先，需要设计引物，引物的选择应根据人源化基因的序列设计，确保引物与目标基因的特异性和互补性。
然后，通过PCR反应扩增人源化基因，并经过酶切和连接等步骤，将目标基因插入真核表达载体。
最后，将重组的质粒转化到大肠杆菌中，经过筛选和测序，得到正确的克隆。
接下来，表达是指将基因在宿主细胞中转录和翻译成蛋白质的过程。
通常使用哺乳动物细胞作为表达宿主，如CHO细胞或HEK293细胞。
将重组的真核表达载体导入到宿主细胞中，通过细胞培养和优化培养条件，促使基因在细胞中进行表达。
随着基因的表达，抗体蛋白质会被合成和折叠成稳定的三维结构。
纯化是将表达的抗体蛋白质从细胞培养上清中提取和纯化的过程。
通常采用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等技术，根据抗体的特性和目的，选择合适的纯化方法。
通过这些纯化步骤，可以去除杂质和其他蛋白质，最终得到高纯度的抗体。
抗体人源化技术的主要原理是通过基因工程手段将小鼠源抗体改造成人源化抗体，使其在结构和功能上更接近人类抗体。
这样做的目的是为了减少抗体治疗中的免疫反应和排斥反应，提高抗体的治疗效果和安全性。
抗体人源化技术的发展为临床医学带来了革命性的突破，为疾病的治疗和诊断提供了更多选择和可能性。
总结起来，抗体人源化的主要原理包括人源化基因设计、基因克隆、表达和纯化等步骤。
人源化单抗
穿上披风 我们开溜！
❖ 诱发人抗小鼠反应、降低抗体效果甚至造成 人体损伤、半衰期较短、较快被清除而影响 疗效、在人体中常不能有效激活补体和Fc受 体相关的效应系统。
❖ 它不禁具有较长的半衰期，低免疫原性，还 能与天然效应因子相互作用，
人源化抗体的构建相关技术
❖ 嵌合体制备技术 ❖ 噬菌体表面展示技术 ❖ 核糖体展示技术 ❖ 转基因技术
转基因技术
❖ 全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫 方法获得。 产生一免疫反应的基因工程敲 除鼠，然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞 或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活 内源 性的小鼠抗体基因，然后引进人源抗 体基因片段，当对人源抗体免疫的时候就 可以在小 鼠体内产生全人抗体分子。
❖ 另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠 体内细胞，转染 色体小鼠的免疫抗原基因环 境和人类非常相似。 还有一种不同的方法是 向免疫供体或混 合性严重免疫缺陷的小鼠注 入人源淋巴细胞， 通过抗原免疫使小鼠脾细 胞融合骨髓瘤细 胞
子的表达。因而更多的是用来高效表达Fv、 Fab及ScFv等功能片段。
2 酵母表达体系
主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母表达系统 使用最广泛。巴斯德毕赤酵母系统作为甲醇酵 母系统之一，使用得最多，也最广泛。
3 昆虫杆状病毒表达系统
昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比 较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加 工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应 于外源基因的表达。
我国人源化抗体药物
上海中信国健药业有限公司历时5年，自主 研发的抗体类新药“注射用重组人Ⅱ型肿瘤 坏死因子受体－抗体融合蛋白”（商品名为 “益赛普”），获得国家食品药品监督管理 局颁发的《药品ＧＭＰ证书》，成功上市。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
人源化抗体的制备
通过细胞实验和动物实验，验证了人源化抗体能够特异性地识别并结合目标抗原，从而发 挥相应的生物学功能。
探讨了人源化抗体的应用前景
人源化抗体在疾病治疗、诊断和预防等领域具有广泛的应用前景，如肿瘤免疫治疗、自身 免疫性疾病治疗、抗感染治疗等。
对未来研究的建议
深入研究人源化抗体的作用机制
稳定性与安全性评价
稳定性评价
在不同温度、pH值及缓冲液条件下，测定抗体的稳定性及半衰期，以评估抗 体的储存及应用稳定性。
安全性评价
通过体内外毒性试验、免疫原性试验等，评估抗体的安全性及潜在毒性。
数据统计与分析方法
数据统计
采用描述性统计方法，对实验数据进行整理、归纳和可视化展示，如平均数、标 准差、箱线图等。
抗体。
B
C
D
体外重组技术
利用体外重组技术将抗体基因片段进行拼 接、优化和表达，制备出具有特定功能的 人源化抗体。
B细胞永生化技术
从人类B细胞中提取抗体基因，将其转入 永生化细胞系中表达，获得人源化抗体。
02 人源化抗体的基本原理
抗体结构与功能
抗体的基本结构
抗体是由两条重链和两条轻链组成的 Y字形蛋白质，具有识别和结合抗原 的能力。
完全人源化抗体阶段
03
利用噬菌体展示技术、转基因小鼠等技术制备出完全人源化抗
体，实现了抗体的全人源化。
制备技术概述
转基因小鼠技术
通过基因工程手段将人类抗体基因转入小 鼠基因组中，使小鼠能够产生人源化抗体。
A 噬菌体展示技术
将抗体基因片段插入噬菌体外壳蛋 白基因中，使抗体片段展示在噬菌 体表面，通过筛选获得高亲和力的
人源化抗体的制备
抗体人源化介绍
抗体人源化介绍一．什么是抗体人源化？人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利于抗体应用于人体。
人源化抗体就是指抗体的恒定区部分（即CH和CL区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。
二．抗体人源化原理1. 嵌合抗体：嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。
这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
2. 改型抗体：改型抗体也称CDR植入抗体（CDR graftingantibody），抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。
将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
3. 表面重塑抗体：表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。
该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。
4. 全人源化抗体：全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
三．抗体人源化应用：1. 在肿瘤治疗方面：单抗肿瘤药物能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。
人源化抗体：构建的核心原则与策略
人源化抗体：构建的核心原则与策略第一代人源化抗体是通过将鼠源McAb的可变区与人抗体的恒定区相结合，形成了一种嵌合抗体。
尽管这两部分在空间结构上相对独立，使得其独特的抗原亲和力得以保持，但由于嵌合抗体中仍然包含鼠源McAb的可变区，因此在应用时仍可能引发强烈的HAMA反应。
为了克服这一问题，科学家们进一步进行了改进，将鼠源McAb可变区中的相对保守的骨架区（Framework region,FR）替换为人的FR，而仅保留抗原结合部位的互补决定区（Complementarity-Determining region,CDR）。
这种改进使得抗体真正实现了人源化。
然而，FR作为抗体的脚手架，不仅为CDR提供了空间构象环境，有时还参与抗体结合位点正确构象的形成，甚至与抗原的结合。
因此，简单的CDR移植往往会导致原抗体亲和力的丧失或降低。
为了解决这一问题，目前科学家们已经探索出了四种策略，旨在优化FR和CDR之间的相互作用，以恢复或提高人源化抗体的亲和力。
这些策略的实施将有助于进一步提升抗体人源化的效果，为医学研究和治疗提供更多的可能性。
人源化抗体构建原则与策略1.模板替换在使用与鼠对应部分有较大同源性的人抗体FR替换鼠FR时，通常有两种途径可供选择。
第一种途径是采用同一个（或少数几个）具有已知晶体结构数据的人源抗体可变区框架（如VH中的NEW、KOL，VL中的REI等）作为基本模板，通过序列比较与分子模建，确定人、鼠间存在种源差异的氨基酸残基，特别是与鼠CDR密切作用的氨基酸残基，在替换过程中予以保留。
为了确保CDR的空间构象得以维持，需要特别关注原来抗体CDR下方的堆积残基以及周围的残基。
这种方法的优势在于，已知的人源FR晶体结构为残基替换提供了明确的信息。
然而，其不足之处在于可能难以保持鼠CDR的天然构象，从而可能导致抗体亲和力的降低或丧失。
第二条途径是在已有的抗体序列库中搜索与鼠McAb FR具有最大同源性的人源FR进行替换。
3.抗体人源化
二、小分子抗体
Fab：抗原结合片断
Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 SdAb：单区抗体
噬菌体抗体库技术
定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载 体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选
即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一
技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病
毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优
越性
（一）基本原理和程序
（二）噬菌体抗体库技术的含B细胞全部克隆；抗体的VH
和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性
• 避开了人工免疫和杂交瘤技术 • 可获得高亲和力的人源化抗体
三、基因工程抗体的表达
• 原核细胞表达：分融合表达和分泌型表达两种 • 真核细胞表达：有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠
第四节 基因工程抗体
Ig分子结构
重链（heavy chain, H链）：有450-570个氨基酸残基 轻链（light chain, L链）：约有214个氨基酸残基 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区） 互补决定区（complementary determining region,CDR
造技术，可以最大程度地降低抗体的鼠 源性，降低甚至是消除人体对抗体的排 斥反应 • 穿透力强。基因工程抗体分子一般比较 小，更容易到达病灶的核心部位 • 可以根据需要，制备多用途的新型抗体 • 成本降低。可采用原核细胞、低等真核 细胞和植物等多种系统表达
基因工程抗体
一、人源化抗体
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因 ，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交 瘤技术，产生大量完全人源化抗体
目前我国抗体药物发展的瓶颈
• 规模化动物细胞培养技术
抗体的人源化
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基因工程抗体优点
降低抗体的免疫原性。通过基因工程改造技术，可 以最大程度地降低抗体的鼠源性，降低甚至是消除 人体对抗体的排斥反应 穿透力强。基因工程抗体分子一般比较小，更容 易到达病灶的核心部位 可以根据需要，制备多用途的新型抗体 成本降低。可采用原核细胞、低等真核细胞和植 物等多种系统表达
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抗体治疗药物
目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规 治疗的应用阶段 障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低， 不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反 应
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一、放射性同位素标记的抗体治疗药物 优：操作简便，用量少，能观察到药物在体内的分 布和药物动力学。 缺：同位素来源困难，需放射线保护和污物处理。
Fv
ScFv
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三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
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放射免疫显像定位技术
将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基三胺五乙酸 （DTPA）在体外偶联成Ab-DTPA，再注入体内后， 就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大，需3 天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期 100m），因DTPA是重金属离子络合剂，所以In113M可以结合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这 一过程在2小时内可完成。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理一、介绍在生物医药领域中，抗体疗法已成为一种重要的治疗方法。
然而，由于传统抗体来自于小鼠、兔子等动物，其在人体内会引发免疫反应，限制了其临床应用。
为了解决这个问题，科学家们开发了抗体人源化的技术，使得抗体可以更好地适应人体环境，降低免疫反应，提高治疗效果。
二、抗体人源化的原理抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的大部分结构转化为人源结构。
其主要包括以下几个步骤：2.1 选择合适的母体抗体首先，需要选择一个合适的动物源性抗体作为母体抗体。
母体抗体应具有良好的抗体效果和特异性，为后续的人源化工作提供基础。
2.2 基因克隆与测序将抗体的DNA序列进行克隆并进行测序，以得到完整的抗体基因信息。
这一步骤可以通过PCR（聚合酶链式反应）和测序技术来实现。
2.3 序列比对与分析利用计算生物学工具将母体抗体的DNA序列与人源抗体库中的序列进行比对和分析，找出相似性最高的人源抗体序列。
2.4 重新设计抗体基因根据序列比对的结果，重新设计抗体基因，将人源抗体的DNA序列与母体抗体的DNA序列进行重组。
这一步骤可以通过PCR技术和基因克隆来实现。
2.5 表达与纯化将重组后的人源抗体基因导入到表达宿主中，让宿主表达人源抗体。
之后，通过一系列的纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析等，获得纯净的人源抗体。
三、抗体人源化的优势抗体人源化技术具有许多优势，使之成为抗体疗法的主流：3.1 降低免疫反应人源化的抗体与人体自身产生的抗体更为相似，因此在体内的抗原识别和结合过程中，不容易引起免疫反应。
相比之下，动物源性抗体容易被人体免疫系统识别为外源物质，并产生抗体反应。
3.2 增加抗体的半衰期人源化的抗体在人体内的半衰期较长，可以延长抗体在体内的作用时间，提高治疗效果。
3.3 提高抗体的稳定性人源化的抗体结构更为稳定，不容易受到蛋白酶的降解和其他外界条件的影响，增加了抗体的存储和运输稳定性。
3.4 提高抗体的亲和力通过人源化的技术，可以对抗体进行亲和力的改造，使之更好地与特定的抗原结合，提高抗体的治疗效果。
人源化单抗
6 转基因动物表达系统
利用转基因动物制药具有生产成本低、 利用转基因动物制药具有生产成本低、投资周 期短、表达量高、与天然产物完全一致、 期短、表达量高、与天然产物完全一致、分离 纯化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、 纯化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、 结构复杂的血液因子，如人血红蛋白、 结构复杂的血液因子，如人血红蛋白、人血清 白蛋白、蛋白C、纤维蛋白原和抗体等。 白蛋白、蛋白 、纤维蛋白原和抗体等。
昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广， 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比 较经济， 较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加 工和糖基化修饰等诸多优越性， 工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应 于外源基因的表达。 于外源基因的表达。 但该系统也存在不足之处， 但该系统也存在不足之处，即病毒感染会引 起细胞的死亡， 起细胞的死亡，因此大批量生产有一定的困 难。
人源化抗体简介
目录
一、人源化抗体的发展历程 二、人源化抗体的定义及分类 三、人源化抗体的优点 四、人源化抗体的表达体系 五、人源化抗体的临床应用 六、人源化抗体展望
一、人源化抗体发展历程
世纪70年代英国学者 从20世纪 年代英国学者 世纪 年代英国学者Milstein和德国学者 和德国学者 Kohle利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆 利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆 抗体以来，单克隆抗体在医学、生物学、 抗体以来，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等 诸多学科中发黑了巨大的作用。 诸多学科中发黑了巨大的作用。单克隆抗体可用于 分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的机构关 系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于 还可用于分离、纯化特定分子抗原， 临床疾病的诊断和治疗等。 临床疾病的诊断和治疗等。 1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗 等首次构建了抗体基因库， 年 等首次构建了抗体基因库 体研究从细胞水平进入到分子水平， 体研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第三 代抗体-基因工程抗体技术的发展 基因工程抗体技术的发展。 代抗体 基因工程抗体技术的发展。
人源化抗体和全人源化抗体
鼠源单抗人-鼠嵌合单抗人源化单抗完全人源化单抗1.“不务正业”的化学诺奖又颁给了生物学，2018年10月3日，诺贝尔化学奖授予了格雷格•温特(GregoryP．Winter)等3位科学家，以表彰他们在酶的定向进化，肽类和噬菌体展示技术等方面的成绩。
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
请根据材料回答下列问题：（1）噬菌体的遗传物质是________，如噬菌体外壳蛋白展示胰岛素蛋白原，构建基因表达载体时，胰岛素基因前还要插入________。
（2）将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中，需要用到的工具酶有________。
噬菌体外壳蛋白结构基因用EcoRⅠ切割后产生的片段如图：图示末端为________，为使外源蛋白DNA序列能与其相连，外源蛋白DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种酶切割，该酶必须具有的特点是________。
（3）从物质基础来看，不同生物之间能够进行基因重组，原因是________。
（4）雷格•温特发明了“拟人化”和全拟人化的噬菌体展示技术，并开发了制造人源化抗体以及在细菌中重组表达人源抗体的技术，这一技术解决了单克隆抗体传统的制备过程中需要将________和________相融合的需求。
单克隆抗体常应用于分子靶向治疗，其特点是________。
2.噬菌体抗体库技术是指将人的全部抗体基因插入噬菌体的基因组中，然后让该噬菌体感染大肠杆菌，最终使抗体以复合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成含有人的全套抗体的噬菌体抗体库。
回答下列问题：（1）获得人抗体基因的途径之一是从________细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，再通过PCR技术扩增出抗体基因。
扩增抗体基因的前提是________，扩增过程中需使用的酶是________。
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五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
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多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
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Ig分子的结构模式图
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原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
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一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
3. 表位印迹选择
表位印迹选择是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术 相结合的人源化抗体的方法，可以通过数轮筛选得 到完全人源的抗体
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小分子抗体
小分子抗体是完整免疫球蛋白的一部分，分子量比 较小。 小分子抗体包括 Fab 、 Fv 或 ScFv 、单域抗体及最小 识别单位等几种。
Fv
ScFv
连接肽
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四、单链抗体（single chain antibody SCA 或single chain FV,SCFV）
单链抗体：具有有分子量小、穿透力强、免疫原性 小特点，可与效应分子相连接构建新功能的抗体分 子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。
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其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白 而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在 药物治疗中应用前景广阔。它可在靶向位置上将前 体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害， 此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。抗体和酶的 融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物，提高 了肿瘤区域药物的浓度，降低了对正常细胞的毒性。
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小分子抗体有很多优点:
可以用细菌发酵生产，成本低;
分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒 素或酶标抗体等。
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Fab
单区抗体
最小识别单位
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一、双功能抗体
双功能抗体就是双特异性抗体（biospecific antibody，bisFvs） 一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不 同的特异性。具有与两种抗原位点结合的能力。
VLA-linker-VHB
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应用：
（1）治疗作用：
一条链针对抗原，一条针对免疫球蛋白，可与Ig 结合，恢复抗体的全部功能。 （2）免疫诊断：
例：全血凝集试剂
免疫阻断抗体、细胞免疫组化抗体
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二、多功能抗体
在单链抗体（ScFv）基础上发展了结合性能良好的 多聚体：二聚体、三聚体和四聚体等。 优点： 克服了ScFv在体内清除过快的不足 高亲和性能，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个 靶抗原结合
将 鼠 单 抗 的 CDR 区 移 植 到人单抗的骨架区，就 可能使人单抗获得同鼠 一样的抗体特异性，并 可以最大限度地降低鼠 单抗的异源性，这样就 得到了改行抗体。这种 改 造 过 的 抗 体 也 称 CDR 移植抗体
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鼠单抗可变区人源化抗体
1. 改形抗体
2. 表面氨基酸残基的人源化――镶面抗体
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抗体工程
抗体研究进展的三个阶段：
1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，特点：用 抗原免疫动物来获得多克隆抗体
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三、抗体融合蛋白
抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴 （1）配基—配基型融合蛋白，如 CD4-Fcγ. （2）配基—Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受体—FV型融合蛋白
（5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）
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鼠源性单克隆抗体
优点：鼠单抗对人而言有较强得免疫原性，可以产 生较强的人抗鼠抗体（HAMA）反应
缺点：生产成本比较高，难以大规模普及应用
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改造鼠源性单克隆抗体的目的：
一是降低免疫原性 二是降低相对分子量，增加组织通透性
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基因工程抗体优点
降低抗体的免疫原性。通过基因工程改造技术，可 以最大程度地降低抗体的鼠源性，降低甚至是消除 人体对抗体的排斥反应 穿透力强。基因工程抗体分子一般比较小，更容 易到达病灶的核心部位 可以根据需要，制备多用途的新型抗体 成本降低。可采用原核细胞、低等真核细胞和植 物等多种系统表达
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构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区 基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表 达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记 等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、 CHO细胞)构中表达。
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二、改形抗体(Reshaping antibody)