中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
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收稿日期 : 2010 - 06 - 13 基金项目 :广东省教育厅高水平科研项目 (自然科学 ) (粤财
教 [ 2009 ]400号 ) 作者简介 :邹忠杰 ( 1980 - ) ,男 ,博士 ,从事天然活性物质的
发现与评价研究 , Email: zouzhongjie@ hotmail. com。
在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分 析 [ 1 ] 。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效 、 作用机制及安全性等研究中的应用 [ 2 ] 。
代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振 谱 (NMR ) 、气相色谱 2质谱 ( GC2M S)和液相色谱 2质 谱 (LC2M S)等各种高通量 、高分辨 、高灵敏度的谱学 技术 [ 3 ] 。NMR由于其具有很高的重现性 、一次实验 中实现对各种化合物的同时测定 、信号强度与其摩 尔浓度成正比 ,可以很容易进行定量分析 、借助各种 2D 2NMR 技术可以在对复杂样品不进行进一步分离 的前提 下 实 现 结 构 鉴 定 等 诸 多 优 点 而 被 广 泛 应 用 [ 4 ] 。高 分 辨 魔 角 旋 转 核 磁 共 振 技 术 ( high2 resolution m agic2angle2sp inning NMR spectroscopy)可
摘要 :总结中药代谢组学研究中生物样品 (尿液 、血液 )的前处理方法 ,主要包括 :尿液中加入缓冲液提 供相同的 pH值和离子强度 ,保持代谢物化学位移的恒定 。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子 物质 ,增加色谱柱的性能和使用寿命 。血液和尿液样品在进行 GC2M S分析前要进行衍生化处理 。同 时 ,对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结 。 关键词 :中药 ;代谢组学 ;样品前处理 中图分类号 : R 284 文献标识码 : A doi: 10. 3969 / j. issn. 1006 - 8783. 2010. 04. 029 文章编号 : 1006 - 8783 (2010) 04 - 0434 - 04
2 尿液的前处理
2. 1 NMR分析中尿液的前处理 如前所述 ,尿液 pH 值和离子强度的变化引起
化学位移的变化是 NMR 测定中的首要问题 。加入 缓冲液一方面提供尽可能相同的 pH 环境 ,另一方 面减少离子强度不同带来的化学位移的变化 ,文献 [ 10 ]报道 了尿 液详 细的预 处 理 方 法 。首 先 配 制 pH7. 4磷酸缓冲液 : 称取 28. 85 g Na2 HPO4、5. 25 g NaH2 PO4 、1 mmol/L TSP2d4 和 3 mmol/L N aN3 置于 1 L 容量瓶中 ,加入 200 mL D2 O ,然后用水稀释至 1 L ,强烈震摇使盐全部溶解 。400μL 尿液中加入 200 μL磷酸缓冲液 ,离心 ( 12 000 g, 5 m in, 4 ℃) ,上清 液 550μL 转移至 5 mm 核磁管中 。雄黄的安全性 评价中采用了类似的方法 : 400 μL 尿液中加入 200 μL 磷 酸 缓 冲 液 ( 0. 2 mol/L Na2 HPO4 /0. 2 mol/L NaH2 PO4 , pH7. 4 ) , 静 置 20 m in, 离 心 ( 3 500 g, 5 m in, 4 ℃) 。上清液 500μL 加入 50μL TSP2d4 /D2O ( 1 mmo l/L 终浓度 ) [ 14 ] 。Lauridsen 等 [ 11 ] 报道对于 一般的尿液样品缓冲液终浓度要达到 0. 3 mol/L ,对 于浓缩的样品要达到 1 mol/L ,才能较好地保持代谢 物化学位移的一致性 。上述磷酸缓冲液中 , 由于 Na2 HPO4 ·12H2 O 较低的水溶性 ( 4. 2 g /100 g, 20 ℃) ,因此不可能实现高浓度的缓冲 ,缓冲液与尿样 的比例为 1∶2,这必然对样品进行了一定的稀释 ,从 而降低了测定中的信噪比 ( SNR) ,而且低温储存时 , Na2 HPO4 ·12H2 O 容易析出 。X iao等报道了一种改 进的缓冲体系 : K2 HPO4 /NaH2 PO4 (pH 7. 4, 1. 5 mol/ L ) ,缓冲液与尿样的比例为 1 ∶10,可更好保持化学 位移一致性 ,提高信噪比 ,减少样品稀释 ,并且可低 温储存 [ 8 ] 。 2. 2 LC2M S分析中尿液的前处理
Pretrea tm en t m ethods of b iolog ica l sam ples in the study of m etabonom ics of trad itiona l Ch inese m ed ic ine
ZOU Zhong2J ie1 , L IANG Sheng2W ang1 , YUAN J ing2Quan2 , GONG M eng2Juan1 ( 1. S chool of T rad itiona l Chinese M edicine, Guangdong Pharm aceutical College, Guangdong Guangzhou 510006, China; 2. Guangx i S ta tion of Institu te of M edicinal P源自文库lant D evelopm en t, Chinese A cadem y of M edica l S ciences, N ann ing, Guangxi 530023, Ch ina)
尿液中的成分主要是极性低分子量代谢物 ,同 时含有少量的各种细胞 、微量的大分子物质及磷酸 盐 、硫酸盐等各种盐类物质 ,这些都有可能对 LC2MS 分析产生一定的影响 。最简单的尿液处理方式是仅 用 0. 22μm 分析滤膜过滤 ,这可以最大限度保留尿
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广东药学院学报
第 26卷
液中的代谢物 [ 15 ] 。为降低尿液基质的干扰 ,也可以 用蒸馏水进行稀释 ( 1∶1 ～1 ∶4,体积比 ) [ 16 - 17 ] ,但有 可能降低信号强度 ,部分低含量的代谢物可能检测 不到 [ 15 ] 。综合考虑检测到的代谢物的数量 、重现性 及除去微量蛋白质和各种盐类物质的能力 ,Wong等 建议尿液用甲醇 ( 1 ∶1,体积比 )进行稀释 [ 18 ] 。尿液 可以先冷冻干燥然后用有机溶剂如甲醇进行提取 , 这种方法可以获得重现性比较高的结果 ,而且操作 简单 [ 19 ] 。但是这种方法可能会改变尿液的代谢指 纹 ,一方面是由于很难完全溶解冻干产品 ,另一方面 是由于挥发性成分的丢失 [ 11 ] 。 2. 3 GC2M S分析中尿液的前处理
可用于代谢组学研究的生物样品包括尿液 、血 液 、脑脊液 、组织和培养液等 ,最容易获取和应用最 广泛的是尿液和血液 。人类尿液的 pH 值一般在 515～6. 5,但在个别情况下可达 4. 6～8. 0。尿液的 成分主要是极性低分子量代谢物 ,其中包括羧酸类 如柠檬酸 、马尿酸 ;有机胺类如二甲胺 (DMA ) 、三甲 胺 ( TMA ) ;氨基酸类如甘氨酸 、牛磺酸 。NMR 测定 时 ,不同 pH 值尿液中这些代谢物由于氨基或羧基 的解离程度不同 ,化学位移将发生显著的变化 。尿 液中还含有一定数量的离子如 Na+ (90～240 mmol/ L ) 、K+ (34～68 mmol/L )等 ,可能产生不同的离子 强度和络合作用 ,同样对代谢物的化学位移产生影 响 [ 8 ] 。血液成分比尿液复杂的多 ,既包括低分子量 成分也包括高分子量物质如蛋白和脂蛋白 , LC2M S 分析中 ,蛋白质的存在会严重降低色谱柱的性能和 使用寿命 [ 9 ] 。因此 ,十分有必要在分析前利用适当 的方法对样品进行前处理以消除不利因素的影响 。 本文总结了基于 NMR、LC2M S和 GC2M S技术代谢 组学研究中对尿液和血液样品的前处理方法 ,希望 能为此领域的研究者提供一定的参考 。
收集血液于含有肝素的试管中来制备血浆 ;收 集血液于不含肝素的试管中 ,冰上凝集来制备血清 ,
离心 (1 600 g, 15 m in, 4 ℃) ,上清液冷冻储存于 40 ℃的环境中 [ 10 ] 。 Teahan等报道血浆和血清必须 尽快与血细胞分离 ,距离血液采集时间最好不要超 过 30 m in,以降低血细胞代谢发生的可能性 ,但是收 集血清时凝集时间必须足够长 ,建议最好不要超过 35 m in,于冰上凝集可以降低时间延长带来的影响 。 血浆和血清所含有的代谢物成分基本相同 [ 13 ] 。
1 尿液和血液的采集与储存
1. 1 尿液的采集与储存 一般 采 集 于 置 于 冰 上 同 时 加 入 叠 氮 化 钠
(NaN3 ,质量浓度至少为 0. 05% )作防腐剂的容器 中 ,冷冻储存于 - 40 ℃的环境中 [ 10 ] 。另有研究报 道尿液保存在低于 - 25℃的环境中 , 26周之内基本 不会发生任何改变 ,而且不需要加入防腐剂 ,尽管 NaN3 不会对代谢物产生任何影响 。如果要短期 (少 于 1周 )储存于 4 ℃的环境中 ,必须加入 NaN3 作防 腐剂 ,理想质量浓度为 0. 1% (终浓度 。 ) [ 11 - 12 ] 1. 2 血液的采集与储存
Abstract: In order to reduce the chem ical shift variation, the pH and the consistency of ionic strength were controlled by adding buffer to urine samp les. In analysis of blood, efficient removal of macromolecules such as p roteins by organic solvent p recip itation before injection into an analytical LC column was important in enhancing the performance and extending column lifetime. Samp le derivatization of blood samp le and urine samp le before GC2M S analysis was needed. And methods of collection and storage of urine and blood samp les were also reviewed. Key words: traditional Chinese medicine; metabonom ics; p retreatment
第 4期
邹忠杰 ,等. 中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
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以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的 组织进行测定 [ 5 ] 。LC2M S特别是 U PLC2Q 2TOF /M S 以其灵敏度高 、分析速度快 、样品无需衍生化等优 点 ,受到众多研究者的关注 [ 6 ] 。 GC2M S作为一种经 典成熟的分析技术在很多领域中应用广泛 ,其最大 的优势是可以检索多个大型化合物库进行代谢物的 结构鉴定 ,而且这也是代谢组学研究中关键的一个 环节 。气相色谱 2飞行时间质谱 ( GC2TOF2M S)由于 提供了比四级杆质谱更快的分析速度 、更高的分辨 率和更准确的分子量应用日益广泛 [ 7 ] 。
广东药学院学报
Jou rna l of Guangdong Pha rm aceu tica l College Aug. 2010, 26 ( 4)
中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
邹忠杰 1 ,梁生旺 1 ,袁经权 2 ,龚梦鹃 1
( 1. 广东药学院 中药学院 ,广东 广州 510006; 2. 中国医学科学院 药用植物研究所广西分所 , 广西 ,南宁 530023)
代谢组学 (metabonom ics)是继基因组学 、转录 组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法 ,是系统 生物学的重要组成部分 。中药“多组分 、多靶点 、整 合调节作用 ”的特点与代谢组学整体性 、系统性 、综 合性相吻合 。因此 ,以代谢组学为主体的系统生物 学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象 整体观思想的重要途径 。王广基等对代谢组学技术
教 [ 2009 ]400号 ) 作者简介 :邹忠杰 ( 1980 - ) ,男 ,博士 ,从事天然活性物质的
发现与评价研究 , Email: zouzhongjie@ hotmail. com。
在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分 析 [ 1 ] 。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效 、 作用机制及安全性等研究中的应用 [ 2 ] 。
代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振 谱 (NMR ) 、气相色谱 2质谱 ( GC2M S)和液相色谱 2质 谱 (LC2M S)等各种高通量 、高分辨 、高灵敏度的谱学 技术 [ 3 ] 。NMR由于其具有很高的重现性 、一次实验 中实现对各种化合物的同时测定 、信号强度与其摩 尔浓度成正比 ,可以很容易进行定量分析 、借助各种 2D 2NMR 技术可以在对复杂样品不进行进一步分离 的前提 下 实 现 结 构 鉴 定 等 诸 多 优 点 而 被 广 泛 应 用 [ 4 ] 。高 分 辨 魔 角 旋 转 核 磁 共 振 技 术 ( high2 resolution m agic2angle2sp inning NMR spectroscopy)可
摘要 :总结中药代谢组学研究中生物样品 (尿液 、血液 )的前处理方法 ,主要包括 :尿液中加入缓冲液提 供相同的 pH值和离子强度 ,保持代谢物化学位移的恒定 。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子 物质 ,增加色谱柱的性能和使用寿命 。血液和尿液样品在进行 GC2M S分析前要进行衍生化处理 。同 时 ,对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结 。 关键词 :中药 ;代谢组学 ;样品前处理 中图分类号 : R 284 文献标识码 : A doi: 10. 3969 / j. issn. 1006 - 8783. 2010. 04. 029 文章编号 : 1006 - 8783 (2010) 04 - 0434 - 04
2 尿液的前处理
2. 1 NMR分析中尿液的前处理 如前所述 ,尿液 pH 值和离子强度的变化引起
化学位移的变化是 NMR 测定中的首要问题 。加入 缓冲液一方面提供尽可能相同的 pH 环境 ,另一方 面减少离子强度不同带来的化学位移的变化 ,文献 [ 10 ]报道 了尿 液详 细的预 处 理 方 法 。首 先 配 制 pH7. 4磷酸缓冲液 : 称取 28. 85 g Na2 HPO4、5. 25 g NaH2 PO4 、1 mmol/L TSP2d4 和 3 mmol/L N aN3 置于 1 L 容量瓶中 ,加入 200 mL D2 O ,然后用水稀释至 1 L ,强烈震摇使盐全部溶解 。400μL 尿液中加入 200 μL磷酸缓冲液 ,离心 ( 12 000 g, 5 m in, 4 ℃) ,上清 液 550μL 转移至 5 mm 核磁管中 。雄黄的安全性 评价中采用了类似的方法 : 400 μL 尿液中加入 200 μL 磷 酸 缓 冲 液 ( 0. 2 mol/L Na2 HPO4 /0. 2 mol/L NaH2 PO4 , pH7. 4 ) , 静 置 20 m in, 离 心 ( 3 500 g, 5 m in, 4 ℃) 。上清液 500μL 加入 50μL TSP2d4 /D2O ( 1 mmo l/L 终浓度 ) [ 14 ] 。Lauridsen 等 [ 11 ] 报道对于 一般的尿液样品缓冲液终浓度要达到 0. 3 mol/L ,对 于浓缩的样品要达到 1 mol/L ,才能较好地保持代谢 物化学位移的一致性 。上述磷酸缓冲液中 , 由于 Na2 HPO4 ·12H2 O 较低的水溶性 ( 4. 2 g /100 g, 20 ℃) ,因此不可能实现高浓度的缓冲 ,缓冲液与尿样 的比例为 1∶2,这必然对样品进行了一定的稀释 ,从 而降低了测定中的信噪比 ( SNR) ,而且低温储存时 , Na2 HPO4 ·12H2 O 容易析出 。X iao等报道了一种改 进的缓冲体系 : K2 HPO4 /NaH2 PO4 (pH 7. 4, 1. 5 mol/ L ) ,缓冲液与尿样的比例为 1 ∶10,可更好保持化学 位移一致性 ,提高信噪比 ,减少样品稀释 ,并且可低 温储存 [ 8 ] 。 2. 2 LC2M S分析中尿液的前处理
Pretrea tm en t m ethods of b iolog ica l sam ples in the study of m etabonom ics of trad itiona l Ch inese m ed ic ine
ZOU Zhong2J ie1 , L IANG Sheng2W ang1 , YUAN J ing2Quan2 , GONG M eng2Juan1 ( 1. S chool of T rad itiona l Chinese M edicine, Guangdong Pharm aceutical College, Guangdong Guangzhou 510006, China; 2. Guangx i S ta tion of Institu te of M edicinal P源自文库lant D evelopm en t, Chinese A cadem y of M edica l S ciences, N ann ing, Guangxi 530023, Ch ina)
尿液中的成分主要是极性低分子量代谢物 ,同 时含有少量的各种细胞 、微量的大分子物质及磷酸 盐 、硫酸盐等各种盐类物质 ,这些都有可能对 LC2MS 分析产生一定的影响 。最简单的尿液处理方式是仅 用 0. 22μm 分析滤膜过滤 ,这可以最大限度保留尿
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第 26卷
液中的代谢物 [ 15 ] 。为降低尿液基质的干扰 ,也可以 用蒸馏水进行稀释 ( 1∶1 ～1 ∶4,体积比 ) [ 16 - 17 ] ,但有 可能降低信号强度 ,部分低含量的代谢物可能检测 不到 [ 15 ] 。综合考虑检测到的代谢物的数量 、重现性 及除去微量蛋白质和各种盐类物质的能力 ,Wong等 建议尿液用甲醇 ( 1 ∶1,体积比 )进行稀释 [ 18 ] 。尿液 可以先冷冻干燥然后用有机溶剂如甲醇进行提取 , 这种方法可以获得重现性比较高的结果 ,而且操作 简单 [ 19 ] 。但是这种方法可能会改变尿液的代谢指 纹 ,一方面是由于很难完全溶解冻干产品 ,另一方面 是由于挥发性成分的丢失 [ 11 ] 。 2. 3 GC2M S分析中尿液的前处理
可用于代谢组学研究的生物样品包括尿液 、血 液 、脑脊液 、组织和培养液等 ,最容易获取和应用最 广泛的是尿液和血液 。人类尿液的 pH 值一般在 515～6. 5,但在个别情况下可达 4. 6～8. 0。尿液的 成分主要是极性低分子量代谢物 ,其中包括羧酸类 如柠檬酸 、马尿酸 ;有机胺类如二甲胺 (DMA ) 、三甲 胺 ( TMA ) ;氨基酸类如甘氨酸 、牛磺酸 。NMR 测定 时 ,不同 pH 值尿液中这些代谢物由于氨基或羧基 的解离程度不同 ,化学位移将发生显著的变化 。尿 液中还含有一定数量的离子如 Na+ (90～240 mmol/ L ) 、K+ (34～68 mmol/L )等 ,可能产生不同的离子 强度和络合作用 ,同样对代谢物的化学位移产生影 响 [ 8 ] 。血液成分比尿液复杂的多 ,既包括低分子量 成分也包括高分子量物质如蛋白和脂蛋白 , LC2M S 分析中 ,蛋白质的存在会严重降低色谱柱的性能和 使用寿命 [ 9 ] 。因此 ,十分有必要在分析前利用适当 的方法对样品进行前处理以消除不利因素的影响 。 本文总结了基于 NMR、LC2M S和 GC2M S技术代谢 组学研究中对尿液和血液样品的前处理方法 ,希望 能为此领域的研究者提供一定的参考 。
收集血液于含有肝素的试管中来制备血浆 ;收 集血液于不含肝素的试管中 ,冰上凝集来制备血清 ,
离心 (1 600 g, 15 m in, 4 ℃) ,上清液冷冻储存于 40 ℃的环境中 [ 10 ] 。 Teahan等报道血浆和血清必须 尽快与血细胞分离 ,距离血液采集时间最好不要超 过 30 m in,以降低血细胞代谢发生的可能性 ,但是收 集血清时凝集时间必须足够长 ,建议最好不要超过 35 m in,于冰上凝集可以降低时间延长带来的影响 。 血浆和血清所含有的代谢物成分基本相同 [ 13 ] 。
1 尿液和血液的采集与储存
1. 1 尿液的采集与储存 一般 采 集 于 置 于 冰 上 同 时 加 入 叠 氮 化 钠
(NaN3 ,质量浓度至少为 0. 05% )作防腐剂的容器 中 ,冷冻储存于 - 40 ℃的环境中 [ 10 ] 。另有研究报 道尿液保存在低于 - 25℃的环境中 , 26周之内基本 不会发生任何改变 ,而且不需要加入防腐剂 ,尽管 NaN3 不会对代谢物产生任何影响 。如果要短期 (少 于 1周 )储存于 4 ℃的环境中 ,必须加入 NaN3 作防 腐剂 ,理想质量浓度为 0. 1% (终浓度 。 ) [ 11 - 12 ] 1. 2 血液的采集与储存
Abstract: In order to reduce the chem ical shift variation, the pH and the consistency of ionic strength were controlled by adding buffer to urine samp les. In analysis of blood, efficient removal of macromolecules such as p roteins by organic solvent p recip itation before injection into an analytical LC column was important in enhancing the performance and extending column lifetime. Samp le derivatization of blood samp le and urine samp le before GC2M S analysis was needed. And methods of collection and storage of urine and blood samp les were also reviewed. Key words: traditional Chinese medicine; metabonom ics; p retreatment
第 4期
邹忠杰 ,等. 中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
435
以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的 组织进行测定 [ 5 ] 。LC2M S特别是 U PLC2Q 2TOF /M S 以其灵敏度高 、分析速度快 、样品无需衍生化等优 点 ,受到众多研究者的关注 [ 6 ] 。 GC2M S作为一种经 典成熟的分析技术在很多领域中应用广泛 ,其最大 的优势是可以检索多个大型化合物库进行代谢物的 结构鉴定 ,而且这也是代谢组学研究中关键的一个 环节 。气相色谱 2飞行时间质谱 ( GC2TOF2M S)由于 提供了比四级杆质谱更快的分析速度 、更高的分辨 率和更准确的分子量应用日益广泛 [ 7 ] 。
广东药学院学报
Jou rna l of Guangdong Pha rm aceu tica l College Aug. 2010, 26 ( 4)
中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
邹忠杰 1 ,梁生旺 1 ,袁经权 2 ,龚梦鹃 1
( 1. 广东药学院 中药学院 ,广东 广州 510006; 2. 中国医学科学院 药用植物研究所广西分所 , 广西 ,南宁 530023)
代谢组学 (metabonom ics)是继基因组学 、转录 组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法 ,是系统 生物学的重要组成部分 。中药“多组分 、多靶点 、整 合调节作用 ”的特点与代谢组学整体性 、系统性 、综 合性相吻合 。因此 ,以代谢组学为主体的系统生物 学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象 整体观思想的重要途径 。王广基等对代谢组学技术