第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定_PPT幻灯片
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生物大分子理论201年 硕士生课程 蛋白质翻译后修饰
生长因子（膜）受体结构的特点
膜外区 生长因子特异结合部位
跨膜区
胞内区 具有TPK活性
生长因子（膜）受体作用机理 生长因子与膜受体胞外结构域特异结合
受体二聚化 受体胞内结构域显现TPK活性 特定蛋白的酪氨酸残基磷酸化
生物效应
erbB原癌基因与癌基因蛋白产物比较
胞外区区合结构 跨膜结构域
细胞内 TPK结构域
• 组蛋白修饰种类
乙酰化--组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色 质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因 的转录，增强其表达水平 。
甲基化-- 发生在H3、H4的 Lys 和 Arg 残基 上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激 活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。
磷酸化-- 发生在Ser 残基，一般与有丝分裂和 凋亡相关。
三、蛋白质质量控制、翻译后修饰和动态相互作用研究
…… • 发育与生殖研究
一．总论
提纲
二．个论: 磷酸化\糖基化\组蛋白修饰
三. 研究方法进展: 蛋白组学
蛋白质的磷酸化和去磷酸化 ——概念、功能及其生物学意义
什么是磷酸化和去磷酸化
Serine Threonine Tyrosine
• 磷酸化反应是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其他化合物的过程。 蛋白质的磷酸化则是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基传 移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，磷酸化的作用位点为蛋白上的 Ser, Thr, Tyr残基.其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为蛋白质 的脱磷酸化。
• 蛋白质磷酸化在信号传递中一个最重要的特点是对外界信 号具有级联放大作用。
• 蛋白质磷酸化与脱磷酸化几乎涉及所有的生理过程功能, 具有多样性。如细胞的分裂、分化等过程，虽然信号分子 的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦被激活，其活性却可通 过某些方式（如自身磷酸化作用）维持较长的时间。
蛋白质泛素化修饰的技术路线PPT课件
感染性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对感染性疾病的治疗，一些研究关注利用泛素化系统来抑制病毒或细菌的复制。通过 调节泛素化修饰相关信号通路，可以抑制感染进程并改善疾病预后。
04
泛素化修饰的干预手段
药物干预
01
02
03
靶向药物
针对特定蛋白质的泛素化 修饰，开发靶向药物，以 调节蛋白质的稳定性、定 位或功能。
开发泛素化修饰相关药物
基于对泛素化修饰机制的理解，开发能够调节泛素化修饰的药物，用于治疗相关疾病。
THANK YOU
抑制酶活性
通过抑制泛素化修饰相关 酶的活性，调控蛋白质的 泛素化水平，进而影响其 生物学功能。
激活酶活性
激活泛素化修饰相关酶的 活性，增加特定蛋白质的 泛素化修饰，以调节其生 物学行为。
基因治疗
基因敲除
通过基因敲除技术，消除 与泛素化修饰相关的基因， 从而调控蛋白质的泛素化 状态。
基因过表达
过表达与泛素化修饰相关 的基因，增加特定蛋白质 的泛素化修饰，以调节其 生物学功能。
泛素化修饰在神经退行性疾病中的作用
泛素化修饰可以调控神经元的生长、突起和凋亡等过程。在神经退行性疾病中，异常的泛 素化修饰可能导致神经元功能障碍和死亡。
神经退行性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对神经退行性疾病的治疗，一些研究关注调节泛素化修饰相关信号通路。通过抑制某些 泛素化酶的活性或调节相关信号通路，可以延缓神经元死亡和疾病进展。
蛋白质泛素化修饰的技术路线ppt 课件
目录
• 泛素化修饰概述 • 泛素化修饰的检测技术 • 泛素化修饰相关疾病研究 • 泛素化修饰的干预手段 • 展望与未来研究方向
01
泛素化修饰概述
泛素化修饰的定义
针对感染性疾病的治疗，一些研究关注利用泛素化系统来抑制病毒或细菌的复制。通过 调节泛素化修饰相关信号通路，可以抑制感染进程并改善疾病预后。
04
泛素化修饰的干预手段
药物干预
01
02
03
靶向药物
针对特定蛋白质的泛素化 修饰，开发靶向药物，以 调节蛋白质的稳定性、定 位或功能。
开发泛素化修饰相关药物
基于对泛素化修饰机制的理解，开发能够调节泛素化修饰的药物，用于治疗相关疾病。
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抑制酶活性
通过抑制泛素化修饰相关 酶的活性，调控蛋白质的 泛素化水平，进而影响其 生物学功能。
激活酶活性
激活泛素化修饰相关酶的 活性，增加特定蛋白质的 泛素化修饰，以调节其生 物学行为。
基因治疗
基因敲除
通过基因敲除技术，消除 与泛素化修饰相关的基因， 从而调控蛋白质的泛素化 状态。
基因过表达
过表达与泛素化修饰相关 的基因，增加特定蛋白质 的泛素化修饰，以调节其 生物学功能。
泛素化修饰在神经退行性疾病中的作用
泛素化修饰可以调控神经元的生长、突起和凋亡等过程。在神经退行性疾病中，异常的泛 素化修饰可能导致神经元功能障碍和死亡。
神经退行性疾病治疗中的泛素化修饰研究
针对神经退行性疾病的治疗，一些研究关注调节泛素化修饰相关信号通路。通过抑制某些 泛素化酶的活性或调节相关信号通路，可以延缓神经元死亡和疾病进展。
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目录
• 泛素化修饰概述 • 泛素化修饰的检测技术 • 泛素化修饰相关疾病研究 • 泛素化修饰的干预手段 • 展望与未来研究方向
01
泛素化修饰概述
泛素化修饰的定义
蛋白质翻译后修饰
细胞应激反应
在应激条件下，如氧化应激和DNA损伤， 蛋白质翻译后修饰可以调控应激反应相关蛋 白的活性和功能，从而影响细胞的生存和凋
亡。
THANK YOU
泛素化作用
泛素化可以影响靶蛋白的稳定性、定位、活性以及与其他蛋白质的相互作用，从 而调控细胞内的多种生物学过程，如细胞周期、信号转导和自噬等。
泛素化可以标记受损或不需要的蛋白质，引导其被蛋白酶体降解，从而维持细胞 内蛋白质的平衡。
泛素化调控
泛素化过程受到严格的调控，涉及多种酶的协同作用。这些酶包括E1（泛素活化酶）、 E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）。
E3酶在泛素化过程中起着关键作用，它能够识别并结合特定的靶蛋白，将泛素分子准 确地连接到靶蛋白上。
此外，去泛素化酶能够逆转泛素化过程，去除已经结合在靶蛋白上的泛素分子，从而对 泛素化进行动态调控。
05
其他翻译后修饰
乙酰化
总结词
乙酰化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，通过将乙酰基团连接到蛋白质的特定氨基酸残基上，可以调节蛋白质的 活性和功能。
翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性 ，通过增加或减少蛋白质的降解速率 ，从而影响细胞内蛋白质的水平和功 能。
蛋白质降解
某些翻译后修饰，如泛素化，可以标 记蛋白质进行降解，通过蛋白酶体途 径降解蛋白质，维持细胞内蛋白质的 动态平衡。
蛋白质功能调控
酶活性调节
亚细胞定位
许多蛋白质在翻译后被修饰以改变其酶活性， 例如，磷酸化可以激活或抑制酶的活性，从 而调控代谢过程和信号转导。
03
疾病与磷酸化
许多人类疾病与蛋白质磷酸化的异常有关。例如，一些癌症和神经退行
性疾病的发生与特定蛋白质的异常磷酸化有关。因此，对蛋白质磷酸化
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1.3 核糖体（ribosome）与核糖体rRNA
核糖体是rRNA 与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有 合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放 因子（RF）等。
原核的核糖体（70S）= 30S小亚基 + 50S大亚基 30S小亚基: 16S rRNA + 21种蛋白质 50S大亚基: 23S，5SrRNA + 34种蛋白质
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tRNA的结构—“四环一臂”
倒L形的三级结构
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tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。 tRNA上至少有4 个位点与多肽链合成有关：即3’CCA氨基酸接受位
点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。 每一个氨基酸有其相应的tRNA携带, 氨基酸的羧基与tRNA的 3’
反应如下：
A A t R N A A T P 氨 酰 基 - t R N A 合 成 酶 A A - t R N A A M P P P i
氨基酸的羧基与tRNA 的3’端CCA-OH 以酯键相连，因此其氨基是自 由的。
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tRNAfmet fMet-tRNA合成酶
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分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制
信号肽（signal peptide）是在新生的多肽链中，可被细胞识别系统识别的 特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。
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本章结束
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氨酰基tRNA进入A位
新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助
翻译后修饰 ppt课件
的寡糖链。糖蛋白的空间结构决定了它可
以和那一种糖基转移酶结合，发生特定的 糖基化修饰。
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15
ppt课件
16
甲基化
蛋白质的甲基化（ methylation）修饰是 在甲基转移酶催化下，在赖氨酸或精氨酸 侧链氨基上进行的甲基化．另外也有对天 冬氨酸或谷氨酸侧链羧基进行甲基化形成 甲酯的形式，这里主要关注前一种甲基化 形式
核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及 染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与DNA
间的作用减弱，导致染色质构象松散，这
种构象有利于转录调节因子的接近，从而 可以和转录因子结合，促进基因的转录; 去 乙酰化则抑制基因转录。
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21
不同翻译后修饰过程的互相协 调与影响
在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立 存在的．在很多细胞活动中，需要各种翻 译后修饰的蛋白共同作用
对于同一个蛋白可以拥有一种以上的后 修饰过程．各种翻译后修饰形式相互影响、 相互协调
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22
谢谢观赏
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23
ppt课件
14
糖基化修饰的过程
• N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高 尔基体。在内质网形成的糖蛋白具有相似 的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜 囊之间的转运过程中，发生了一系列有序
的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露
糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加
上了不同类型的糖分子，形成了结构各异
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17
组蛋白上的甲基化修饰
组蛋白上的甲基化修饰有赖氨酸的甲基化 和精氨酸的甲基化两种，它们同转录调节和异 染色体的形成有关。
组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有 关，而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂， 它可以是转录增强或转录抑制
以和那一种糖基转移酶结合，发生特定的 糖基化修饰。
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甲基化
蛋白质的甲基化（ methylation）修饰是 在甲基转移酶催化下，在赖氨酸或精氨酸 侧链氨基上进行的甲基化．另外也有对天 冬氨酸或谷氨酸侧链羧基进行甲基化形成 甲酯的形式，这里主要关注前一种甲基化 形式
核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及 染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与DNA
间的作用减弱，导致染色质构象松散，这
种构象有利于转录调节因子的接近，从而 可以和转录因子结合，促进基因的转录; 去 乙酰化则抑制基因转录。
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不同翻译后修饰过程的互相协 调与影响
在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立 存在的．在很多细胞活动中，需要各种翻 译后修饰的蛋白共同作用
对于同一个蛋白可以拥有一种以上的后 修饰过程．各种翻译后修饰形式相互影响、 相互协调
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14
糖基化修饰的过程
• N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高 尔基体。在内质网形成的糖蛋白具有相似 的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜 囊之间的转运过程中，发生了一系列有序
的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露
糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加
上了不同类型的糖分子，形成了结构各异
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组蛋白上的甲基化修饰
组蛋白上的甲基化修饰有赖氨酸的甲基化 和精氨酸的甲基化两种，它们同转录调节和异 染色体的形成有关。
组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有 关，而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂， 它可以是转录增强或转录抑制
蛋白质翻译后修饰【病理生理学教研室】 ppt课件
Southern Medical University
泛素化
泛素化是指泛素（一类低分子量的蛋白 质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞 内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并 对靶蛋白进行特异性修饰（主要是降解）的 过程。
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(二)蛋白激酶的种类
真核细胞的蛋白激酶可分为五类：
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是丝氨酸 /苏氨酸羟基； 酪氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是酪氨酸的酚羟 基；
组/赖/精氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是咪唑环 、胍基、氨基； 半胱氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是巯基；
MEK5
MKK
ERK1/2
JNKs
p38s
ERK5
MAPK
生长
凋亡
炎症反应
?
细胞反应
Southern Medical University
MAPK的作用底物:
转录因子： ATF2、c-Jun、Chop10、 MEF2C、ELK1
胞内蛋白激酶：MAPKAPK2/3、MNK1/2、 PRAK、MSK1/2
骨架相关蛋白：MAPs、Tau、sHSP
离子通道蛋白：Na+通道蛋白
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MAPK介导的细胞反应
Stress response
Inflammation
Apoptosis
Development Proliferation
MAP kinases Differentiation
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蛋白质组学Proteomics-PPT课件.ppt
ICAT的优点
• ICAT具有广泛的兼容性，主要表现在：(1) 能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组 织中绝大部分蛋白质；(2)烷化反应即使在 盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸 胍等)存在下都可进行；(3)只需分析含Cys 残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分 析的复杂性；(4)ICAT战略允许任何类型的 生化、免疫、物理的分离方法，因此能很 好地定量分析微量蛋白质。
双向凝胶电泳
• 首先利用等电点聚焦来分离不同等电点的 蛋白，再利用SDS－PAGE来分离不同分子 量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克级 的蛋白质就可以被很好的分辨开了。
基质辅助的激光解吸电离技术
（MALDI）的发展
• 日本岛津公司的田中耕一的工作，是质谱分析发 展的一个主动力。 1987年，在第二届中－日质谱 分析联合讨论会上，田中耕一论述了软激光解吸 附技术可以使蛋白质分子离子化。一年之后，他 的这篇创造性的论文发表在Rapid Communications in Mass Spectrometry上。田中 耕一的工作为基质辅助的激光解吸电离技术 （Maldi）打下了基础。2019年，他和弗吉尼亚联 邦大学的John B Fenn，由于他们对软吸附电离 方法上的贡献一起被授予了该年度诺贝尔化学奖
应用实例
• 1.通过比较给药前后细胞的蛋白质组, 鉴别出毒理学的蛋白质标志物 。
• 2. 疟疾疫苗的研究。
ICAT技术
同位素标记的亲和标签（isotope-coded affinity tag， ICAT）技术作为一种体外标记稳定同位素的相对定量方法， 已经成为重要的蛋白质组学定量分析方案。2019年，Gygi 等人用化学方法合成一种能和半胱氨酸反应的亲和试剂， 称为稳定同位素编码的亲和标签，它有轻链和重链(稳定重 同位素)两种形式，可以在体外标记不同状态下的蛋白质样 品，酶解并用亲和柱分离纯化被标记的肽段后，再用质谱 进行分析，和体内标记法一样也能够得到成对的峰表示不 同样品中肽段及对应蛋白质含量的差异。这种稳定同位素 亲和标签技术可以广泛地应用在细胞和组织的定量蛋白质 组学分析上，提供精确的蛋白质相对定量数据。
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• 细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白形式存在
• 糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用
• 成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之
一
第23页/共33页
糖苷键类型 • N连接：天冬酰胺序列子Asn-X-Thr/Ser • O连接:Ser/Thr • 糖基磷脂酰肌醇锚 (glycosyl phophotidylinositol, GPI)：
第19页/共33页
PSD－MALDI－TOF－MS
• PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂， 丢失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量 数减少80kD或者98kD的子离子。
第20页/共33页
磷酸化位点的确定
• 用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行分析。 • 将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断
• 至少有30%的蛋白被磷酸化修饰 • 大部分蛋白磷酸化是可逆的 • 磷酸化的作用位点
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蛋白质组学在磷酸化分析中的困 难
• 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的； • 即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在； • 细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这些酶很容易将磷酸基团脱掉； • 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其化学性质的负电性，在质谱技术中面
抗体免疫印迹法
• 优点 • 灵敏 • 直观
• 克服同位素法的局限 • 无同位素污染，操作相对方便 • 可检测无磷酸化转换的蛋白 • 能区分不同残基的磷酸化
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磷酸化肽段的分离和富集
• 使用磷酸化蛋白的抗体 • IMAC法 • 磷酸基团亲和取代
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蛋白翻译后修饰
蛋白翻译后修饰(齐以涛老师)上课老师没说重点1.蛋白的概念:由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。
2.蛋白后修饰概念与意义(PPT4-5)3.蛋白后修饰种类1、切除加工2、糖基化3、羟基化4、甲基化5、磷酸化6、乙酰化7、泛素化8、类泛素化9、…200、…磷酸化修饰1、概念:磷酸化就是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。
大部分细胞过程实际上就是被可逆的蛋白磷酸化所调控的,至少有30%的蛋白被磷酸化修饰2、作用位点:丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸就是主要的磷酸化氨基酸,大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点,并且其磷酸化位点就是可变的。
3、实例(MAPK途径):分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶( MAPKK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶(MAPKKK)。
在真核细胞中,这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统(MAPK cascade),通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化,将外来信号级联放大并传递下去。
具体过程如下:•MAPKKK位于级联系统的最上游,能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体,或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化•MAPKKK磷酸化后变为活化状态,可以使MAPKK磷酸化•MAPKK始终存在于细胞质中,MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活•MAPK被磷酸化后有3种可能的去向:(1)停留在细胞质中,激活一系列其它的蛋白激酶(2)在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化(3)进入细胞核,通过磷酸化转录因子,调控基因的表达4、功能与意义:一:调节酶蛋白及生理代谢①糖分解代谢中糖原磷酸化酶活性的调节,被磷酸化的酶具有活性,去磷酸化的酶无活性②磷酸化或去磷酸化使胞内已存在酶的活性被激活或失活,调节胞内活性酶的含量二:调节转录因子活性转录因子通常包含DNA结合结构域与转录激活结构域、转录因子在转录激活结构域或调控结构域发生磷酸化,直接影响其转录活性、c-Jun转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化,正调控c-Jun的转录活性、三:调节转录因子核转位•TGF-b与其I型、II型受体结合,结合后的TGF-b I型受体识别R-Smad包括Smad2与Smad3,作用于C末端的丝氨酸使其磷酸化而被激活,激活后的R-Smad与Smad4结合转入细胞核内,发挥转录调节活性•NF-kB与其抑制因子IkB形成复合体时存在于胞质。
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方法
反相液相色谱（PR-HPLC） 免疫沉淀 固相金属亲和色谱 金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 离子交换和等电聚焦
免疫沉淀
原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用 被保留了下来
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来
么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组 分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的 比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量 放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同 时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化 肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测 和分析低丰度磷酸肽
1、磷酸肽的分离和富集
免疫沉淀物
固相金属亲和色谱 Immobilized metal affinity chromatography, IMAC IMAC柱：金属离子、螯合剂、填料 原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+ 可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而 结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液 有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液 中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷 酸肽被释放出来
蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白 质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白 质其磷酸化的部分仅占其总量的10%
三、磷酸化蛋白质的检测
32P放射性标记法 抗体免疫印迹检测法
1、32P放射性标记法
32 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法
放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化 蛋白质
培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标 记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化
已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差
免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集 目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋 白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨 酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）
制备型2D胶电泳
分析型2D胶电泳
考马斯亮蓝染色
转印到膜
磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质
图谱比较
找出相应的磷酸化蛋白质
染色—得到全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
四、蛋白质磷酸化位点的分析
1、磷酸肽的分离和富集
分离浓缩分析物，提高信噪比 如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那
蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的 作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为 完善，调节更为精细，作用更为专一 N-端fMet或Met的切除 二硫键的形成 化学修饰 剪切
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫 应答和应激反应等生理过程起着重要作用
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收 缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过 程
化的相对化学计量 (3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性
的相对状态
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式 的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多
磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷 酸化蛋白鉴定要困难的多
蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程
磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化 精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸
和谷氨酸的酰化 丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化
=1800：200：1
被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷 改变催化基团的性质 改变蛋白质的构象 改变蛋白质的亚细胞分步 蛋白质功能变化的多样性
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的 复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作 用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常 关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定
一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生 物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的 传递过程中占有极其重要的地位
局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质 不能标记组织样本 放射性污染
2、抗体免疫印迹检测法
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法
在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化
μLC－ESI-MS
IMAC
二、磷酸化蛋白质分析的概述
双相磷酸多肽谱图 2D—PP
多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测
此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷 酸化状态的重要信息
(1)磷酸化位点的最大数目 (2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸
磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段 很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中Biblioteka 二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸氨基酸 分析
体外 pmol 32p蛋白标记
蛋白质分离 蛋白酶切 2DPP作图
体内 fmol 32p细胞标记
相关分析
蛋白酶切 2DPP作图
μHPLC
μLC－ESI-MS或 MALDI-MS
反相液相色谱（PR-HPLC） 免疫沉淀 固相金属亲和色谱 金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 离子交换和等电聚焦
免疫沉淀
原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用 被保留了下来
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来
么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组 分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的 比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量 放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同 时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化 肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测 和分析低丰度磷酸肽
1、磷酸肽的分离和富集
免疫沉淀物
固相金属亲和色谱 Immobilized metal affinity chromatography, IMAC IMAC柱：金属离子、螯合剂、填料 原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+ 可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而 结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液 有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液 中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷 酸肽被释放出来
蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白 质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白 质其磷酸化的部分仅占其总量的10%
三、磷酸化蛋白质的检测
32P放射性标记法 抗体免疫印迹检测法
1、32P放射性标记法
32 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法
放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化 蛋白质
培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标 记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化
已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差
免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集 目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋 白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨 酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）
制备型2D胶电泳
分析型2D胶电泳
考马斯亮蓝染色
转印到膜
磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质
图谱比较
找出相应的磷酸化蛋白质
染色—得到全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
四、蛋白质磷酸化位点的分析
1、磷酸肽的分离和富集
分离浓缩分析物，提高信噪比 如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那
蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的 作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为 完善，调节更为精细，作用更为专一 N-端fMet或Met的切除 二硫键的形成 化学修饰 剪切
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫 应答和应激反应等生理过程起着重要作用
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收 缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过 程
化的相对化学计量 (3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性
的相对状态
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式 的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多
磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷 酸化蛋白鉴定要困难的多
蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程
磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化 精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸
和谷氨酸的酰化 丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化
=1800：200：1
被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷 改变催化基团的性质 改变蛋白质的构象 改变蛋白质的亚细胞分步 蛋白质功能变化的多样性
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的 复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作 用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常 关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定
一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生 物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的 传递过程中占有极其重要的地位
局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质 不能标记组织样本 放射性污染
2、抗体免疫印迹检测法
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法
在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化
μLC－ESI-MS
IMAC
二、磷酸化蛋白质分析的概述
双相磷酸多肽谱图 2D—PP
多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测
此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷 酸化状态的重要信息
(1)磷酸化位点的最大数目 (2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸
磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段 很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中Biblioteka 二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸氨基酸 分析
体外 pmol 32p蛋白标记
蛋白质分离 蛋白酶切 2DPP作图
体内 fmol 32p细胞标记
相关分析
蛋白酶切 2DPP作图
μHPLC
μLC－ESI-MS或 MALDI-MS