信号通路研究思路

证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是：要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。

其次，要证明你的药物存在保护作用。

再次，证明你的药物可以抑制P38表达。

最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。

首先证明P38表达增加会导致损伤。

这里需要建立一个损伤模型。

正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。

这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。

这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。

如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。

这时还可以用Dominant-negative。

抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。

（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。

如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。

）其次，要证明你的药物存在保护作用。

当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。

再次，证明你的药物可以抑制P38表达。

用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。

最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。

这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。

这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。

抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。

虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。

细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。

其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。

PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因突变（ATM)以及DNA-PK。

相对而言，MEK1/2的抑制剂U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制剂SB203580就要好一些。

所以研究人员一般应用LY294002时采用20μM，应用wortmannin时采用0.2μM，以此来最小化其他的效应。

有些学者们同时应用两种抑制剂进行对比，也许也有顾及于此的原因吧。

但是，从严谨的角度讲起特异性的话，RNAi也不能说是绝对特异的，我们只能说它是高特异性，因为RNAi的机制中还有很多没有完全阐明。

一些研究者会在RNAi处理后，还要在实验中应用Western来同时检测该蛋白所在家族的其他成员的表达量变化以检测其特异性和选择性，以表严谨。

举个例子：比如针对Survivin进行RNAi之后，你最好同时检测XIAP , cIAP1/2等蛋白。

当然，如果你所针对基因的siRNA构建已经很成熟，有前人的文章检测特异性做基础，那就另当别论了，所以给科研态度很严谨的lwjssry兄弟提个醒，如果你的siRNA序列尚无很好的文献应用基础，这个问题你也许应该考虑的。

临时找到一个描诉相关内容的06年文献，影响因子3分多，截取其中的内容供lwjssry兄参考吧：信号通路有细胞特异性和条件特异性，即同一信号通路在不同的细胞之间或同一细胞在不同的条件下，作用机理可能是不同的。

细胞内的信号通路之间存在复杂的相互作用，想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难。

本人最近研究了一个信号系统的两个信号分子，A和B。

A在细胞质，B在细胞核。

以往的研究已经证明A是B的上游信号通路之一。

我们的研究是想证明在某种病理过程中A和B作为一个系统发挥作用。

我们首先应用能够提升该系统的药物干预，发现A升高的同时B也得到升高，但这也不能说明什么问题。

所幸的是A分子目前有特异性的阻断剂，于是我们便对A分子的激活进行阻断，结果发现B分子的激活也收到抑制。

由此初步推测A 和B可能在某种病理过程中作为一个系统发挥作用。

但也只能证明了A是B的必要条件而已。

做信号传导的在于你研究一种的机制有什么作用，其机制是否于信号传导有关，有哪些关系，是什么原因导致此信号传导的表达，表达后的下游基因怎么变化》？这中间最好有基因敲出或者抑制剂和激动剂干预后看看上游下游之间的变化和你预期的结果有没有关系。

如果单纯的做信号传导而去做没有什么意义的，就像前面楼上说的一样信号的启动/最终发挥功能！“想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难”。

我最近正在做一个实验，证明A对B的作用。

先用外源物处理细胞，跑wetern blot，发现A和B都有所增加，B的量增加在A 之后。

于是用抑制剂抑制A，以及用siRNA使A knockdown，然后看B的表达量也下来了。

但是这也只能证明A和B有关联，无法证明A对B是直接作用还是间接作用。

甚至无法说明B的改变是A信号knockdown造成的，还是A信号knockdown以后，细胞为了弥补该信号的不足，补充促进了C信号，而C信号可以改变B信号。

最近在考虑用Co-IP证明A和B 有结合作用，也许能证明A和B的直接关系。

探讨信号转导中分子间的充要条件，与探讨数学中的充要条件是不一样的，因为细胞中信号转导通路往往存在反馈机制。

即使X是上游信号，Y是下游信号，改变Y信号也会通过反馈机制使得X信号发生改变。

所以，在考虑生物体内的信号分子间充要条件时会复杂得多，要慎之又慎下结论。

信号分子的环路效应普遍存在个人觉得研究A分子与某个信号通路应该更具体得分为两种情况：1，以前还不知道A分子是这个信号通路的成分，这时我们要证明A分子是这个信号通路的成分，这时的研究就是上文谈到的研究内容了。

2，A分子是信号通路的成分，这是已知的，现在发现某个现象跟这个通路有关，现在我们要证明A分子是这个信号通路参与这个现象的关键分子，则又是另一种模式。

1，“创造信号通路”，别人没有研究过A和B 之间的相互作用，而你发现了，并证明了，这就是创造，其实准确点说应该是“发现”，因为信号通路是客观存在的，只不过被找到了而已，不过用“创造”这个词比较形象。

这一类的研究是开创性的，比较困难的，研究的时候常常是用免疫共沉淀去把与某个蛋白结合的一堆蛋白都搞出来，再做质谱分析，进行鉴定，再进一步证明两者间的相互作用，这就涉及到充分必要条件的证明。

单纯进行这一类的研究缺乏目的性和研究的意义，所以通常还是建立于某种现象基础上的，用自己“创造”的信号通路来解释某种现象，也就是下面说的第二种模式。

2，“利用信号通路”，利用别人或自己“创造”的信号通路来解释某个具体的现象，比如，某个药物、某种毒物、某种应激、某种射线、等等，在这些刺激下，具体到某种细胞的某条信号通路发挥调控作用。

在第一类中，是用充分必要条件来证实A分子与B分子的作用。

在第二类中，是用充分必要条件来证实A现象与B信号通路之间的关系。

看文献是最基础的训练，看文献，一是看思路，二是学技术和逻辑思维。

思路告诉我们为什么去做，技术和逻辑思维教我们怎么去做。

过表达A基因，发现B基因的mRNA水平明显增加，对应的B的蛋白水平也明显增加；干扰A基因表达，发现B基因的mRNA水平明显降低，对应的B的蛋白水平也明显降低。

投稿，被拒稿，主要原因是审稿人提出：应该弄清楚A是如何调控B的表达的。

请问各位老师，A调控B可能是通过什么途径？需要做什么实验？A和B都是脂类代谢中的酶基因，它们在胞浆和核内都有表达。

回答：1、下一步应该搞清楚B基因mRNA改变的原因是什么，在转录水平还是影响了RNA的稳定性。

2、假设A和B是直接关联的（假定A影响B的转录），是否一般得做两个实验：Luciferase reporter assay和CHIP assay？只做一个CHIP实验行不行？其中Luciferase reporter assay是否就是为了检验A蛋白是否能结合到B基因的Promoter区？是不是A蛋白必须得是转录因子才有可能结合到B基因的Promoter区？另外，怎么知道A蛋白是不是转录因子呢？——针对这个问题的回答：不过建议找几篇JBC上的文章看看，JBC上这种调调的文章挺多的，精读3-5篇，把它的outline搞清楚，你就胸有成竹了。

——我打开JBC网站一看，呵呵，每期专门有Gene Regulation板块。

根据JBC上面的文章，A调控B基因，很多都是通过第三者如转录因子实现的。

我再翻出以前自己的Real-time PCR实验结果，发现过表达A基因后，转录因子C的mRNA水平显著增加，而干扰A基因表达，转录因子C的mRNA水平显著降低。

目前这个现象还没有文献报道。

后期，我准备通过Luciferase reporter assay和CHIP assay来验证转录因子C是否能与B基因作用。

我想请教的问题是：A基因调控转录因子C，除了前期的Real-time PCR实验（当然再补一个Western Blot实验），我还需要做其他实验吗？会不会审稿人再提出：你需要弄清楚A基因如何调控转录因子C才行。

说简单点：A基因通过转录因子C调控基因B，是否要将A影响C，C影响B两步都弄清楚？——看你的目标杂志了，如果是JBC这样偏机制的，估计会要你说清楚的3、A可以影响B的mRNA水平，也能影响B的蛋白水平，这样的话，可能是只通过影响B 的RNA水平影响B的蛋白表达，也可能同时影响B的RNA水平和B的蛋白稳定性。

B的蛋白稳定性你可以通过加入CHX检测B的半衰期。

另外就是你说的Luciferase reporter assay实验。

4、A和B的变化总是一致的，应该很有可能是通过转录水平调控的，因为你的mRNA、蛋白都变了。

既然是转录水平，那就要找到B的启动子的序列，对应和这个序列结合的蛋白，这个蛋白可能是A也可能是其他的间接的。