动物细胞培养

二、动物体细胞核移植技术
1、定义： 动物核移植是将动 物的一个细胞的细胞核,移入 一个已经去掉细胞核的卵母细 胞中.使其重组并发育成一个 新的胚胎,这个新的胚胎最终 发育为动物个体.
用核移植的方法得到的动物称 克隆动物
理论基础： 动物的细胞核具有全能性
2、分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。
（易）
动物细胞培养、核移植、胚胎移植等
供体细胞 （供核）
细胞培养
体细胞 核移 重
注入
植
组
卵巢卵母细胞 （MⅡ中期：供质）
去核
无核卵 母细胞
细 胞
胚胎 构建重 移植 组胚胎
代孕 母体
生出与供体奶 牛遗传基础相 同的犊牛
4、应用前景：
① 加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育 ② 保护濒危物种，增加存活数量 ③ 克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 ④ 可以作为异种移植的供体 ⑤ 可以用于组织器官的移植
其他条件
无菌无毒，适宜条 无菌无毒，适宜
件
条件
一、 动物细胞培养
1. 为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动 物细胞培养材料？
2. 为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？ 3. 为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？ 4. 目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在？代以 内，为什么？
5. 应用:？（4个方面） 6. 培养过程：？ 7. 原代培养的细胞特点：？原代培养与传代培养的 区别？ 8. 动物细胞培养的条件？
性别相同！ 2、用去核的减数？期细胞（MⅡ期），为什么？
体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物 质和营养条件。 3.怎么去核？为何去核？ 显微操作去核法
保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞
4.取传代培养?代以内的供体细胞.为什么？
保存10代以内的细胞；因为其具有正常的二倍体核型。
问题
5.注入去核卵母细胞中的是什么? 供体细胞
５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质 是什么成份？ 胰蛋白酶水解蛋白质
细胞间的成份是蛋白质(胶原蛋白等)
思考题
６、细胞膜的主要成份是什么？ 蛋白质和磷脂
７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？ 能
８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分 散成单个细胞要注意什么问题呢？ 注意时间的控制
９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织细
4.动物细胞培养的条件:
1）无菌无毒 的环境：
对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液 中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更 换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞 造成危害。
2）营养：
液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长 因子、（水、无机盐、微量元素）等；通 常还需加入血浆、血清等天然成分。
3）温度和pH：适36宜.5的±温0.度5℃：。人和哺乳动物细胞最适温度为
▲细胞系：传代50代以后不能再传下去，
部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传 代，获得不死性，叫细胞系。
3、总结：动物细胞 培养过程
动物胚胎或幼龄动物
的组织、器官 剪碎用胰蛋白酶处理
单个细胞 加培养液稀释
原代培养特点：细胞贴壁、 配置细胞悬液
接触抑制
转入培养瓶
原 代 培
传代10代以内，遗传物质不改变， 分瓶传代培养 养
如用于筛选抗癌药物
植物组织培养和动物细胞培养的比较：
比较项目
植物组织培养 动物细胞培养
原理
细胞的全能性 细胞增殖
培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分 植物激素
动物血清
培养结果
植物体
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、培育无 获得细胞或细胞
病毒植株
分泌蛋白
取材
植物幼嫩部分或花 胚胎或幼龄动物
药
的器官或组织
动物细胞工程
–思考与回忆：
• 1、动物细胞全能性特点？
• 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制， 分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。
• 2、动物的细胞培养的理论依据（原理）？
• 细胞增殖
其它动物细胞工程的基础
动物 细胞 工程 常用 技术
动物细胞培养 核移植 动物细胞融合 单克隆抗体技术
一、动物细胞培养的应用和概念：
5、存在问题：
① 成功率低 ② 克隆动物存在健康问题 ③ 克隆动物食品的安全性问题存有争议
补：克隆技术
1、概念：克隆就是无性繁殖，具体地说，是指一个 共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群 遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。
a.分子水平上：一般指DNA克隆。
b.细胞水平上：指一个单一的细胞分裂所形成的 细胞群体。
保持正常二倍体核型。
传代10-50代左右，增长缓慢以 10代细胞
至于完全停止，部分细胞核型可
传 代
能发生变化（遗传物质可能改变） 40-50代细胞 培
继续传代培养少部分细胞获得不
百度文库
养
死性，细胞突变，遗传物质已经 改变，等同于癌细胞。
无限传代
遗细 传胞 物株 质： 未一 改般 变说 已遗细 改传胞 变物系 质：
问题
1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？没有 ２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？是
３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？
分散成单个细胞后，增大了细胞与培养液的接触面积， 细胞容易吸收营养物质，排除代谢废物。
４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？ 先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
16、有些为何能一直传下去吗？动物细胞培养就是为 了得到这些细胞吗？
发生突变，朝着癌细胞方向发展 不是 17、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？用于植 皮的细胞培养应该不多于多少代？
保存10代以内的细胞；因为其有正常的二倍体核型。 10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部 分还发生突变向癌细胞方向发展；10代
13、如果此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎 样办？细胞株和细胞系通常是培养多少代的细胞?
将贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增 殖。这样的过程叫做传代培养
思考题
14、如何理解原代培养和传代培养？ 上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，
之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养
15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？ 不是都能
c.个体水平上：指基因型完全相同的两个或一个 群体。
转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细 胞。有接触抑制现象）。
强调一：细胞贴壁过程
■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就 贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
■培养瓶或培养皿壁要求： 表面光滑、无毒、易于帖附。
强调二：接触抑制
■当贴壁细胞分裂生 长到表面相互接触时, 细胞就会停止分裂增 殖，这种现象称为细 胞的接触抑制。
（难）
3、以课本P48克隆高产奶牛为例分析核移植的 大致过程
供体细胞注入 去核卵母细胞
激活受体细胞， 完成分裂、发 育
减数第二次分裂中期 （MⅡ卵母细胞）
去核的卵母细胞
胚胎移植
代孕牛子宫
克隆牛
问题
1.克隆动物性状与供体动物完全一样吗？性别和供体动 物一样吗？ 不完全一样！因为：1、供体动物只提供 细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA） 来自于受体卵母细胞.2、生物的性状还受环境的影响。
6.核移植时，一般先用？方法使供体与受体细胞融合， 进而使供体细胞核进入受体细胞。再用？方法激活受体 细胞，使其完成细胞分裂和发育进程
电刺激 ；物理或化学方法
7.分析体细胞核移植比胚胎细胞核移植困难的原因 动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难
8.从生殖方式上看克隆牛属于？培育原理？使用的细胞 工程技术主要有？ 无性生殖 动物细胞核的全能性
1、概念：动物细 胞培养就是从动物 有机体中取出相关 的组织,将它分散 成单个细胞,然后, 放在适宜的培养基 中,让这些细胞生 长和增殖.
2、原理：细胞增殖
3：过程
图示
胚胎或幼龄动物器官组织
定义：人们 通常将动物 组织消化后 的初次培养 称为原代培 养。
取出组织
剪碎
胰蛋白酶处理
单个细胞
细胞悬液
原代培养
适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4
4）气体环境：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。
氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养 液的PH。
5.动物细胞培养技术的应用:
1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞
3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.细胞的生理、药理、病理研究
胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近 10、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄 动物的组织或器官，请解释原因？
因为胚胎组织或幼龄组织或器官上的细胞分化程度 低，分裂能力强，容易培养。
思考题
11、培养瓶内表面为何要光滑、无毒？
易于培养
进行生长增殖
12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、 增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞 分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。
*传代培养
定义： 当原代培养的细胞处于接触抑制后,
用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下 来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释, 并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这 个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）
强调：细胞系、细胞株
▲细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，
遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。