小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
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10min。弃去上清，加ACK至2~3ml，轻轻吹打混匀并放置 3~4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以 1500rpm离心10min； 3. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min； 4. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个 核细胞悬液。
白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过 10%。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应 先做红细胞计数
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
1
基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大 细胞、干细胞。
2
3
免疫细胞分离方法：
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 2. 根据细胞理化性质：
1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度 法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
22
解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆 盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠 鼠龄越小，胸腺体积相对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积 较大，长条形态，属于外周免疫器 官。外周血中淋巴细胞可经再循环 驻入脾脏等外周免疫器官的特定区 域，所以富含各类免疫细胞。
23
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： • 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液
基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠 上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
11
12
13
免疫磁珠法细胞分选过程
14
免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置
15
全自动细胞分选系统
16
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： 人外周血单个核细胞(peripheral blood
中浸泡3~5min； • 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界
处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋 膜组织。
取脾脏
24
实验步骤：
（二）制备单个核细胞悬液： 1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指
套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2. 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
6
NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以CD16、 CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细 胞。
7
FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息 处理系统和细胞分离纯化系统组成。
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒 （如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞 生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一 体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
27
计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对 压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则
28
细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡
或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数
下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。
29
红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要 重新充池计数。正常数值范Байду номын сангаас内，两次红细胞计数相差不得 超过5%。
4
T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
➢ CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）
5
B细胞表面标志
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
18
不同细胞密度不同
19
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
20
密度梯度离心法
血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 离心后
21
实验五 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞， 其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在 1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合 溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,•各种血液成 分将按密度梯度重新分布聚集。
17
不同细胞密度不同
8
荧光激活细胞分离仪分离法
9
流式细胞分析仪
10
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚 合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即 可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。
将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率 和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h) 的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活 性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
25
实验步骤：
（三）计算细胞浓度 1. 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释； 2. 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞
总数； 3. 计算细胞总数：
细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀 释倍数。
26
计数池
正面观
支持堤
侧面观
支持堤 计数池 支持堤 1mm （0.1mm缝隙）
白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过 10%。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应 先做红细胞计数
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
1
基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大 细胞、干细胞。
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3
免疫细胞分离方法：
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 2. 根据细胞理化性质：
1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度 法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
22
解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆 盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠 鼠龄越小，胸腺体积相对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积 较大，长条形态，属于外周免疫器 官。外周血中淋巴细胞可经再循环 驻入脾脏等外周免疫器官的特定区 域，所以富含各类免疫细胞。
23
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： • 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液
基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠 上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
11
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13
免疫磁珠法细胞分选过程
14
免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置
15
全自动细胞分选系统
16
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： 人外周血单个核细胞(peripheral blood
中浸泡3~5min； • 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界
处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋 膜组织。
取脾脏
24
实验步骤：
（二）制备单个核细胞悬液： 1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指
套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2. 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
6
NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以CD16、 CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细 胞。
7
FACS
流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息 处理系统和细胞分离纯化系统组成。
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒 （如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞 生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一 体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
27
计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对 压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则
28
细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡
或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数
下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。
29
红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要 重新充池计数。正常数值范Байду номын сангаас内，两次红细胞计数相差不得 超过5%。
4
T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
➢ CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）
5
B细胞表面标志
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
18
不同细胞密度不同
19
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
20
密度梯度离心法
血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 离心后
21
实验五 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离
mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞， 其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在 1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合 溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,•各种血液成 分将按密度梯度重新分布聚集。
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不同细胞密度不同
8
荧光激活细胞分离仪分离法
9
流式细胞分析仪
10
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚 合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即 可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。
将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率 和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h) 的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活 性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。
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实验步骤：
（三）计算细胞浓度 1. 将上述细胞悬液做一定倍数的稀释； 2. 混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞
总数； 3. 计算细胞总数：
细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀 释倍数。
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计数池
正面观
支持堤
侧面观
支持堤 计数池 支持堤 1mm （0.1mm缝隙）