小鼠脾细胞悬液制备

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小鼠脾细胞培养实验

山东大学实验报告2011年3月30日姓名张行润系年级 2009级生科4班学号 200900140177 同组者张少华科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号 105一、实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。

二、实验原理(一)细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

(二)细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。

染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。

不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。

染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。

死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。

常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。

台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。

所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。

甲基蓝有类似的染色机理。

植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。

死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。

美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。

mAb基本流程

一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。

虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。

我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。

鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。

二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

gentleMACS实验操作步骤中文

gentleMACS™操作步骤1.背景信息在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS®技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。

德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS™分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。

这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。

使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。

2. 分离小鼠脾脏的操作步骤2.1 需要的试剂和仪器●gentleMACS 分离器●gentleMACS C 管(# 130-093-237)●细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（Pre-Separation Filters# 130-041-407)●缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含0.5% 牛血清白蛋白(BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)2.2 步骤▲如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。

▲一只小鼠脾脏的重量约为80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液:1–2 个小鼠脾脏: 3 mL3–4个小鼠脾脏: 6 mL5–6 个小鼠脾脏: 9 mL2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上▲注意: 必须确保组织块在转子区域3. 开机，选择合适的分离程序：1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01.3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04.4. 运行gentleMACS 程序m_spleen_01. 或m_spleen_04.5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管6. (可选) 以300×g 室温下离心2分钟。

7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。

改良的脾细胞悬液制备方法的探讨

第1期农垦医学第41卷脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。

鉴于脾脏的功能丰富，由其制备的脾细胞悬液在科学研究和临床应用研究方面也很广泛，但目前报道的脾细胞悬液制备方法大多数是机械研磨分散法。

本研究探讨一种改良的脾细胞悬液制备方法，旨在为进一步的脾细胞悬液应用提供方法学指导，以期能更好地应用于改良的脾细胞悬液制备方法的探讨贺亚玲1崔林1邢建新2李玲1唐慧1刘欢1陈雪玲2（1.石河子大学医学院形态实验中心，新疆石河子，832002；2.石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室，新疆石河子，832002）【摘要】目的：通过与常规制备脾细胞悬液方法比较，探讨一种具有机械损伤度小,活细胞比例高，收集细胞较多的脾细胞悬液制备方法。

方法：常规取小鼠脾脏，放入小平皿内，用带有弯曲针头的注射器在含有1～2mL PBS 的小平皿中刮出脾细胞；再用5mL和2mL注射器依次吹打混匀，洗涤脾细胞，计数。

常规脾细胞悬液制备方法为机械研磨分散法。

结果：采用改良的脾细胞悬液法使活细胞比例在98%以上，脾细胞收集较多，体重25g左右的昆明系小鼠脾细胞收集量能达到1.6×108/mL，脾细胞相对较完整且能用于进一步的研究。

结论：改良的脾细胞悬液制备方法较常规的方法操作简便，且具有机械损伤度小，脾细胞相对较完整的优点，值得推广和应用。

【关键词】脾细胞悬液；制备方法；改良中图分类号：R-332文献标识码：AStudy on Preparation of Modified Spleen Cell SuspensionHE Ya-ling1,CUI Lin1,XING Jian-xin2,LI Ling1,TANG Hui1,LIU Huan1,CHEN Xue-ling2（1.Center of Morphology Experimental，Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi，832002；2.Department of Medicine Pathogenic Biology and Immunology,Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi，832002）【Abstract】Objective：Compared with the conventional method for preparing spleen cell suspension，a method for preparing spleen cell suspension with small mechanical damage,high proportion of living cells，more spleen cells collection is explored.Methods：The mouse spleen was routinely taken,placed in a small dish，and spleen cells were scraped off in a small dish containing1to2mL of PBS using a syringe with a curved needle.Then spleen cells were blewed and mixed with5mL and2mL syringe,spleen cells were washed,counted.Conventional preparation of spleen cell suspension is a mechanical grinding dispersion method.Results：The improved spleen cell suspension method works better，and has the advantages of small mechanical damage，more than98%of living cells and more spleen cells collected,and the collection amount of spleen cells of Kunming mice weighing25g achieve1.6×108/mL, it can be used for further research.Conclusion：The preparation method of the improved spleen cell suspension is simple and convenient to operate compared with the conventional method,spleen cells are relatively complete advantages，it can be worth promoting and application.【Key words】Spleen cell suspension；Preparation method；Improvement基金项目：石河子大学教育教学改革项目（SJ-2018-15）；石河子大学混合式教学项目资助（BL2016061）。

溶血空斑实验报告

一、实验目的1. 掌握溶血空斑实验的基本原理和方法。

2. 了解溶血空斑实验在免疫学中的应用。

3. 检测实验动物抗体形成细胞的功能。

二、实验原理溶血空斑实验（Plaque Forming Cell assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。

其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中。

其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑。

一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。

空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。

三、实验材料与试剂1. 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜、移液器、吸管等。

2. 试剂：（1）SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.0×10^9个/mL。

（2）Hanks液（含Ca2+、Mg2+）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。

（3）底层基：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%浓度。

（4）表层基：将琼脂糖用Hanks液配成0.7%浓度。

（5）补体：新鲜豚鼠血清或小牛血清，56℃灭活30min。

四、实验方法1. 免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫：取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射1ml SRBC悬液，免疫3次，每次间隔2周。

（2）脾细胞悬液的制备：无菌取小鼠脾脏，剪碎，用生理盐水洗涤，加入适量生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10^6个/mL。

2. 溶血空斑实验（1）将底层基加入平皿中，置于37℃水浴箱中溶化。

（2）取适量脾细胞悬液加入底层基中，轻轻混匀。

（3）加入适量表层基，轻轻混匀。

（4）加入适量补体，轻轻混匀。

（5）将平皿置于37℃水浴箱中孵育4h。

脾脏单个核细胞的制备

脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。

《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。

加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。

台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。

《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。

沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。

粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。

小鼠脾细胞流式实验步骤_概述说明以及解释

小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。

1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。

流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。

通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。

1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。

在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。

1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。

通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。

同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。

2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。

小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。

小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。

2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。

抗体生成细胞实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。

2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。

3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。

二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。

在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。

本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。

四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。

- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。

- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。

- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。

- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。

2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。

- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

- 每2天更换一次培养基。

3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。

4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。

- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。

- 加入抗体，37℃孵育30分钟。

- 加入底物，观察颜色变化。

- 记录抗体生成细胞活性。

五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。

2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。

六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。

2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。

小鼠单克隆抗体的制备

小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。

这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。

1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。

将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。

免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。

2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。

可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。

3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。

4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。

在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。

存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。

5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。

提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。

小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。

但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。

此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。

因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。

小鼠脾脏中分离淋巴细胞

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。

无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。

个人用1500转/分钟，20分钟。

３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。

４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。

一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。

得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培养或做它用。

但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。

因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。

本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。

2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。

2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。

3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。

2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。

2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。

3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。

4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。

2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。

2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。

3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。

3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。

3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。

具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。

4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。

通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。

这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。

小鼠脾细胞观察实验报告（共10篇）

小鼠脾细胞观察实验报告(共10篇) 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告山东大学科目细胞生物学实验题目小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1. 细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞

姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。

培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。

2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。

原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce

体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。

是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。

自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。

特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。

它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。

它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。

溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。

前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。

因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。

至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。

小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。

目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。

其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。

一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。

小鼠脾脏t细胞流式分选实验步骤

实验目的：通过流式细胞仪对小鼠脾脏T细胞进行分选，以探究T细胞在免疫应答中的作用及机制。

一、实验前准备1.1 实验材料准备1.1.1 小鼠脾脏组织1.1.2 10mL注射用生理盐水1.1.3 0.25胰酶液1.1.4 洗涤缓冲液（PBS）1.1.5 红细胞裂解液1.1.6 表面标记抗体：CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC1.1.7 流式细胞仪1.1.8 离心管、移液枪、吸头、培养皿等实验器材1.2 实验环境准备1.2.1 无菌操作台1.2.2 常温恒温器1.2.3 培养箱1.2.4 流式细胞仪操作间二、实验步骤2.1 小鼠脾脏细胞分离2.1.1 将小鼠处死并取出脾脏组织，放入含有10mL生理盐水的培养皿中，剪碎均匀。

2.1.2 加入0.25胰酶液，放入37摄氏度恒温器中消化30分钟。

2.1.3 将组织碎片过滤，用PBS洗涤，避免红细胞污染。

2.1.4 使用红细胞裂解液裂解红细胞，离心沉淀，得到细胞悬液。

2.2 细胞表面标记2.2.1 取得细胞悬液，计数并调整浓度至合适水平。

2.2.2 分别加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC表面标记抗体，进行表面标记反应，避免光照。

2.2.3 进行表面标记抗体的洗涤和离心，得到标记的细胞悬液。

2.3 流式细胞仪分选2.3.1 将标记的细胞悬液输入流式细胞仪，设置合适的参数。

2.3.2 进行T细胞的流式细胞仪分选，并收集目标T细胞子集。

2.3.3 对收集的目标T细胞子集进行进一步的分析或培养。

三、实验注意事项3.1 实验过程中要保持无菌操作，避免细胞污染。

3.2 实验中避免表面标记抗体受光照。

3.3 实验材料和仪器的准备和操作要符合实验要求，确保实验结果的准确性和可靠性。

通过上述步骤，可以对小鼠脾脏T细胞进行流式分选实验，进一步探究T细胞在免疫调节中的作用及机制，为相关研究提供重要的实验数据支持。

在实验过程中，对于小鼠脾脏T细胞的流式分选需要严格控制各个步骤，确保实验结果的可靠性和准确性。

流式步骤

流式步骤
1.取肠系膜淋巴结及脾脏：颈椎脱臼处死小鼠后，腹部朝上固定于泡沫板上，喷少量酒精后打开腹腔，沿盲肠向上寻找淋巴结，取下淋巴结及脾脏放入预冷PBS。

2.提取组织细胞：将淋巴结及脾脏分别在细胞过滤器上均匀研磨，用预冷PBS缓慢冲洗研磨后组织，获得细胞悬液，脾脏细胞悬液中加入1ml红细胞裂解液，裂解5min,将细胞悬液离心，1500rpm,5min。

倒掉上清，加入PBS轻柔洗涤两次，离心后获得细胞。

3.刺激：将获得的细胞加入预冷的细胞培养基混匀后放置在6孔板上，加入MIX、PLUG及STOP，混匀后，放入37℃细胞培养箱6h。

4.收集细胞：取出6孔板后轻轻吹打几次细胞，将LN细胞及脾脏细胞吸到流式管中，取脾脏细胞时小心吹打，勿将底层贴壁的巨噬细胞纤维细胞吸入流式管，离心1500rpm,5min。

加入预冷的PBS轻柔洗涤细胞一次，离心1500rpm,5min，倒掉上清。

5.上机：避光加入细胞表面荧光抗体（CD3、CD4），室温孵育30min,加入PBS洗涤一次，甲醛固定，加入破膜液混匀，冰上30min，PBS 洗涤两次，500rpm,5min。

加缓冲液重悬，然后避光加入胞内INF-γ等的荧光抗体及同型，4℃过夜，加入FACS Buffer上机。

实验二__小鼠脾细胞提取及计数

实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。

其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。

二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。

包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。

在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。

下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。

（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。

（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。

老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。

2)转动旋钮，调整量取体积。

顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。

裂解红细胞的方法

裂解红细胞的方法
1．用100μl 的10*PBS将离心后的沉淀处理10s，混匀。

然后加入900μl 的水，1000rpm离心5min，直到看到沉淀中没有红细胞。

另外有的试验用的0.17M氯化铵常温下反应5分钟，然后300g 离心5分钟
2．另外要注意的是：
皮毛和腹膜要用两套眼科剪眼科镊来处理
分离是尽量的采用钝性分离
离心后用Ack或Tris-NH4cl破红细胞，一般每支小鼠的脾细胞用3ml作用3-5min，然后加10mlPBs，离心。

裂解红细胞最好的情况就是离心后沿离心管底灰白色的脾细胞沉淀的上沿有小半圈红细胞残留。

3．红细胞裂解液配方：脾淋巴细胞悬液制备
无菌条件下剖开小鼠（C57BL或纯系昆明小鼠，体重18-22g，雌雄不限。

）腹腔取脾，研磨过100目筛网，Hank's液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心5分钟，弃上清；加红细胞裂解液10ml，混匀脾细胞，静止4-5分钟，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5分钟，弃上清去除红细胞，Hank's液洗2-3遍，用RPMI1640培养液重悬细胞，计数调整细胞浓度为8-10×106个/ml。

红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml。

0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。