复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。

外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各
类免疫细胞。

免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。

红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。

是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。

2实验材料：
1）健康小鼠
2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板
3）70汇醇
4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK
5）0.2%台盼蓝
6）细胞计数板、计数器
7）离心机
8）显微镜
3实验方法：
3.1取小鼠脾脏
将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。

用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。

3.2制备单个核细胞悬液
将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用
针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。

吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。

然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。

弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

3.3 计算细胞浓度
稀释十倍，随机选取一个大方格计数
细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml
3.4 计算细胞活力
在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：
324- 16/324 X 100%=95.1%
在理论范围之内
4 实验结果
4.1 研磨脾脏得到细胞悬液
本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。

实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。

这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。

应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。

研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。

所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。

我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。

4.2 白细胞计数
在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题: 起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。

后来我们意识到，这可能是因为充池后立即观察，细胞还悬浮在液体中，和方格线不在同一个平面上。

静置2分钟后再调焦观察，只能隐约看到方格线。

在反复调试中发现，减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度。

另外，一定要注意在充池前对计数板的清洁。

我们小组起初用卫生纸对计数板清洁，在镜下发现残留很多纸纤维，严重影响观察。

改用擦镜纸清理后，就大大减少了杂物对视野的影响。