第二章 离心机的原理及应用

2 、关好离心机盖，设定离心机转子型号、转速、 离心时间、温度、启动运转。
3、离心时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心
管）取出，离心结束。
大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目
的。
• 因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为
上清液。
（一）电动离心机的使用方法：
• 1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。并检查离 心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。 • 2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软
垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔
应该用蜡封住）。 • 检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中， 然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与 套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡。
• 3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互 对应的两插孔内。
• 盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离
已破碎的细胞
500g,10’
• 举例：
沉淀 (细胞核)
上清液 10 000g,10’
上清液
100 000g,3h
沉淀(细胞膜 碎片、线粒体、 溶酶体)
沉淀 (核糖核蛋白体)
上清液 (可溶性组分)
• 2．密度梯度离心
• 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的 组分得以分离的一种区带分离方法。 • 密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。 • 梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组 分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活。
⑵ 离心管帽
超离心机所用离心管一般都附有管帽，离心时离心管需 戴上管帽。
3、转子及选择
角转子（ Type ）、水平转子（ sw ）、垂直转子（ v ）、 区带转子（c）等 ⑴ 角转子 指离心管腔与转轴成一定倾角的转子 角度越大，沉降越结实，分离效果越好 角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离 效果差。
• 相对离心力是指颗粒所受的
离心力与地心引力(重力)之比。 即:RCF=Fc/Fg==4π2n2r /
（3600×980.6）×g
将有关数字代入上式，化简为： RCF=1.12×10-5〃n2〃r×g
• 式中
RCF：相对离心力(g)；n：
转子每分钟转数(r／min)；r： 旋转半径(cm)；g：重力加速度， 980．6 cm／s2
•
3．等密度离心
• 将CsCl2、CsSO4等介质溶液与样品溶液混合，然后在选 定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场 中沉降形成密度梯度 • 样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形 成区带。 • 常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
• 前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其 等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。 • 应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时， 铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度 梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度 和离心机转速及离心时间。 • 此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性，故最 好使用钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干 燥。
实例1：
高 速 冷 冻 离 心 机
J-30I
用 途
1. 细菌，蛋白沉淀 - 核酸提取 - 细胞 /亚细胞组份分离。 2. 动、植物病毒分离、血液血清提取及 溶液中大、小颗粒不同组份的分离。
、
操作步骤
1、打开离心机盖,选
择容量适合的转子，将 带样品离心管放入转子 内（样品一定要平衡 好），再将转子放入离 心室内固定好转子。
• 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的 方法，称为差速离心。 • 操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使 大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分 离较小的颗粒。 • 如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。
• 差速离心所得到的沉降物含有 较多杂质，需经过重新悬浮和 再离心若干次，才能获得较纯 的分离产物。 • 差速离心主要用于分离大小和 密度差异较大的颗粒。操作简 单方便，但分离效果较差。
第二章 离心机的原理与应用
• 离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根 据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不 同，而使物质分离的技术
• 一、离心机的种类与用途
• • • • 离心机有多种多样。 按用途有分析用、制备用及分析-制备两用之分； 按结构特点则有管式、吊篮式、转鼓式和碟式等多种； 按离心机转速的不同，可分为常速(低速)、高速和超速 三种。
• 梯度离心中颗粒沉降区 带横过离心管，离心后 区带不必重新定位 • 但只有处于样品区带中 心的颗粒才直接向管底 沉降， • 其它颗粒则撞向壁的两 侧，产生“壁效应”， 但受振动和变速搅乱后 对流现心法是分离沉淀的一种方法。
• 它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较
(分析性超速离 心主要用于检测 大分子物质的沉 降特征和结构等)
离心机
制备型
分析型 分析性超速离心机
普通离心机
冰冻离心机
台式（或地 面式）普通 离心机
台式高、超速 离心机 0.6-10万转/分
大容量冰 冻离心机 小于0.6万 转/分
高速冰冻 离心机 0.6-2.5万
超速冰冻 离心机 2.5-8万或 更高
心机转速，直至所需数值。
• 达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让
离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。
离心机 • Eppendorf管放置、重量的平衡
（二）离心机使用要点
①工作转速在允许范围内 ②严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，对称 放置。 ③加盖，防止离心管飞出伤人。 ④发现异常立即关机 ⑤每次离心后要想清楚是留什么、弃什么。
转速与RFC的换算：便于进行转速和相对离心力之间 的换算，人们在式③的基础上制作了三者关系的列 线计算图 半径 相对离心力 转速
方法：三点一线，左对左，右对右
2、转子离心管及选择 ⑴ 离心管
玻璃离心管质虽硬、但脆，不能承受超离心的压力。 超离心机离心管：塑料管及不锈钢管。 注意离心管的平衡 离心时样品一般应装满离心管，否则将可能因有气泡而 使管的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡 产生事故
• 颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向 离心管，然后再沿管壁滑向管底因此管的一侧 会出现颗粒沉积，称为“壁效应”。 • 最适合差速离心，强度大、方便但加速或减速 时，对样品有搅动。
⑵ 水平转子 旋转时随着转子的转动从 垂直悬吊上升到水平位置 （约200—800rpm）时。 颗粒在水平转子中的沉降 是沿管子方向的，
• 高速离心机的转速为1×104～2．5×104 r／min。相 对离心力达1×104～1×105g，
– 主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。
• 为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子 变性失活，有些高速离心机装设了冷冻装置，称高速 冷冻离心机。
3．超速离心机
• 超速离心机的转速达2.5×104～8×104 r／min，最大相 对离心力达5×105g甚至更高一些。超速离心机的精密度 相当高。
• 常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯 度系统，其梯度范围是：蔗糖浓度5％～60％，密度 1.02～1.30g/cm3。 • 密度梯度的制备可采用梯度混合器，也可将不同浓 度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠 管底，浓度越高，形成阶梯梯度。
• 离心前，把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。 • 离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在 密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。 • 各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。 • 在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而 改变。 • 随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当 增大离心力而缩短离心时间，可以减少区带扩宽。
• • • • •
若转速以惯用的每分钟转数(r／min)来表示，则 ω=2πn/60 代入上式，得到：αc =ω2r =4π2n2r /3600 式中 n：转子每分钟转数(r／min)。 在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数 表示，如4000 r／min。 而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离 心力来表示。如：65 000g。
三、离心条件的确定
• 离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上 述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度 梯度等以外 • 确定离心机的转速和离心时间 • 还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。 •
• 1．离心力
• 物质颗粒在离心场中所受到的离心力(Fc)的大小，决定于 颗粒的质量(m)和离心加速度(αc)：Fc=mαc • 离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径： αc=ω2r 式中ω：转子的角速度(rad／s)；r：旋转半 径，即颗粒到旋转轴中心的距离(cm)。
1．常速离心机
• 常速离心机又称为低速离心机。 • 其最大转速在6000 r／min以内，相对离心力(RCF)在 1×104g以下
– 主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣等固形物，和粗结 晶等较大颗粒。
• 低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样， 可根据需要选择使用。
2．高速离心机
– 分离细胞器、病毒、蛋白质、核酸、多糖等
• • • •
为了防止样品液溅出，一般附有离心管帽； 为防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统； 为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。 此外还有一系列安全保护系统、制动系统及各种指示仪表 等。
二、离心分离方法的选择
• 离心分离的方法可分为三类
• 1．差速离心