GBS核酸检测

试剂盒介绍


规格：20人份/盒
有效期：－18 ℃以下避光保存6个月 试剂：DNA提取液、GBS PCR反应液、GBS阳性对照品，空白对照品

标本类型：生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本
标本要求
溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响，应尽量避免 这些样本的检测。 其他常见干扰物质（粘液和脓液）以及常用药物（青霉素G、阿奇 霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太 尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露）均无明显影响。
40 μL 体系：35 μL PCR反应液 + 5 μL DNA模板
PCR扩增
程序： 50℃ 2min 95℃ 5min
（ 95℃ 15s
60℃ 35s ） 45 cycles
实时监测PCR扩增过程
FAM 通道
HEX通道
结果有效性判定
FAM通道检测结果：分析样本，空白对照品： Ct值不显示；阳性对照品： Ct<30.00； HEX通道检测结果： 分析内参照基因，Ct≤35.00
GBS核酸检测
GBS概述
GBS概述
B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS) 学名无乳链球菌，革兰氏阳性链球菌，正常寄 居于阴道和直肠，属于条件致病菌。
在20世纪70年代，GBS已被证实为围产 期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中 占有不可忽视的地位。
什么是围产期……
产品优势一
灵敏度高：采用PCR方法检测DNA，试剂与国际领先试剂性能相同 特异性强：不与临床常见其它各类病原体产生交叉反应 稳定性好：样本DNA提取质量高，阳性对照品、空白对照品内参基因扩 增曲线高度吻合，试剂稳定
无污染：全封闭PCR体系，避免实验室其它PCR产物污染
易操作：操作简便，采用预制PCR反应液，无需额外加入内参照基因、 酶等 速度快：检测周期短，从核酸提取到PCR结束实验过程不到2小时
模板纯度要求低 ：不需要分离病毒/细菌/培养细胞，DNA 粗制品及 RNA均可作为扩增模板
实时荧光PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对模板进行分 析的方法。
1. 每扩增一条DNA链，就切断一个探针 2. 每切断一个探针，就产生一个单位荧光信号 3. 荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
GBS的筛查与预防
阳性(+) 孕35-37周取阴道和直肠拭子作GBS检测
抗生素预防
未检测
阳性(+)
阴性(－) 临产后GBS检测 或产时高危因素：早产，产时发热 ≥38 ℃，胎膜早破≥18小时 阴性( － ) 且无产时高危因素 抗生素预防
不需要抗生素预防
预防GBS疾病的抗生素使用方案举例:

《围产期GBS预防指南》指出：
谢谢
产品优势二
公司GBS、 UU (解脲脲原体)、NG（淋球菌）、CT（沙眼衣原体） 四 个核酸检测试剂盒检测样本类型，DNA提取步骤和PCR扩增程序相 同，结果阈值线的设定也相同；四个病原体可以同时依次进行DNA提 取、PCR扩增步骤，区别只是所用试剂不同。如果客户四个检测项目 全部使用公司产品，会节省时间和工作量，符合客户操作简便的要求。
GBS阳性患者应用抗生素进行预防性治疗

Boyer在1989年研究中指出，产时氨苄青霉素使用超过1小时就可以 使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中表明，与 无产时应用抗生素相比，抗生素预防超过2小时的有效率是89%，不 足2小时的有效率为71%。
挑战：我妈妈会 进行IAP治疗吗？
有无青霉素过敏 否
青霉素G，首次剂量500万单位 （静脉注射）然后每4小时250〜 300万单位，直至分娩或者氨苄青 霉素，首次剂量2g（静脉注射）， 然后每4个小时1g，直到分娩 否 头孢唑啉，首次剂量 2G，然后每8个小时 1g，直到分娩 否
《围产期GBS预防指南》
是 病人在接受青霉素或 头孢菌素时有无出现 下列任一症状？ 过敏症、血管性水肿、 呼吸窘迫、荨麻疹 是 红霉素和克 林霉素治疗 是否有效 是 克林霉素每8小时900mg （静脉注射）直至分娩
乳胶微粒凝集试验、协 由于B族链球菌血清型 同凝集试验、对流免疫 操 作 比 培 养 法简 便 ， 成 细菌抗原检 测 较多，容易造成漏检， 电泳试验及酶联免疫试 本低。 灵敏度相对较低。 验等。
采用的是所有B族链球菌 cfb 基因保守序列，所有 荧光 PCR 方法 荧光探针， PCR 法扩增 需 要 专 门 的 PCR 实 验 GBS 都存 在； 灵敏度最 检测 核酸。 室及荧光PCR仪。 高，出结果快（<2h）， 操作简单。
是指怀孕28 周到产后一周这一分娩前后的重要时期 围产期保健是指产前、产时和产后的一段时间内，对母亲、胎儿和
人群GBS带菌率
国外研究表明 ，不同地区、不同种族的妊娠晚期妇女GBS带菌率 约为6.5％～36.0％，国内报道的妊娠妇女GBS带菌率为3.5%～32.4 ％，新生儿体表带菌率与母体带菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖 、糖耐量异常、多次妊娠以及性生活活跃的妇女中带菌率较高。
标本保存
待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-18℃以下保存不超过4天。
检测流程（ ＜ 2 h ）
DNA 提取
PCR反应体系配制
PCR扩增及结果分析

标本 GBS阳性对照品 空白对照品
分装GBS PCR反应液


PCR扩增



加DNA模板

结果分析
35 min
5 min
1h 10min
DNA提取
PCR介绍
什么是PCR……
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是 一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段；可看作 生物体外的特殊DNA复制。
PCR原理
PCR一般由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂， 形成单链DNA 。 ②退火 ：（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形 成局部双链。 ③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物 的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;2～3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
GBS对新生儿的影响
GBS感染是新生儿感染的主要原因 早发型感染 多见于出生后1周内。 母婴垂直传播是其主要传播途径。 主要临床表现为败血症（80%）、肺炎（7%）、脑膜炎（6%）；若治 疗不及时，可引发远期后遗症，如智力发育迟缓、视觉听觉丧失等。
晚发型感染 多发生于出生1周后。 主要为水平传播：可能与院内感染或家庭接触有关。 常呈隐匿性发病，其特征表现为脑膜炎；1/3的晚 发型疾病出现脑膜炎，故这些生存下来的新生儿中更 易发生神经系统后遗症。
GBS核酸检测产品
荧光PCR检测B族链球菌（GBS）
B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
产品特点
Taqman 探针实时PCR技术 选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子， 设计特异性引物和探针 内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果 UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性 适用仪器：Roche LightCycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K 等多色荧光PCR仪
沉淀+ 50μL DNA提取 液
13,000 rpm
1mL标本
10 min
沉淀 +1mL生 理盐水
13,000 rpm 5 min
标本，GBS阳性对 照品，空白对照品 均需要提取DNA。
取上清至 1.5mL离 心管中保 存
13,000 rpm 10 min
99-100 ℃ 加热 10min
PCR体系配制

GBS的传播与感染
感染GBS产妇
30~60%
未传染给新生儿
40%~70% 传染给新生儿
97% 无症状
1%~3%
早发性疾病：败血症，肺炎 或脑膜炎
5%会导致死亡
国内外GBS筛查现状

美国疾病控制中心(CDC) 制定了《围产期GBS预防指南》 该指南已经获得以下认可： 美国妇产科学院 美国儿科学会 美国护士助产士协会 美国家庭医生协会 美国微生物学会 美国流行病学会 美国药理学会
其它成份
酶
一Leabharlann Baidu为Taq酶
模板
待扩增DNA链
PCR扩增仪
PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。 现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。 国外厂家：Bio-Rad，ABI, Roche …… 国内厂家：杭州朗基 ，杭州博日……
PCR反应特点
特异性强：引物与模板DNA特异正确结合 ，碱基配对原则 ，Taq DNA 聚合酶忠实性扩增 灵敏度高 ：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 (pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平 简便快速：一般在1～4 小时完成扩增反应
以上要求需在同一次实验中同时满足
结果分析
阴性：样品的FAM通道无Ct值显示, HEX通道Ct≤35.00 阳性： 样品的FAM通道 Ct≤38.00， HEX通道Ct≤35.00 备注：若样品的FAM通道 38.00<Ct≤45.00，建议重新检测该样本， 若重检结果仍为38.00<Ct≤45.00或Ct≤38.00，判定为阳性； 若Ct不显示且HEX通道Ct≤35.00，判定为阴性。
万古霉素每12小时1g（静 脉注射）直至分娩
GBS检测方法比较
方法学 具体方法 优势 劣势
细菌培养
周期长（ 18-60h) ，， 选择肉汤培养液 18-24h ， 特别不适合临产时孕 血平皿培养18-36h； 结果判读直观，易开展， 妇不知道自身是否有 后 续 药 敏 学 实 验 ： 成 本 低 ， 可 进行 药 敏 学 GBS 感染 的情 况； 灵 STAEP 签定板条培养 4- 分析。 敏度较低；实验操作 24h后，药敏学分析。 人员需要较深的经验。

在我国，2011年，中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和 孕期保健指南(第1版)》中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。
《围产期GBS预防指南》指出

对所有孕妇于妊娠35～37 周进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗


以下情况应进行预防性治疗 ： 本次妊娠有GBS 菌尿 上次新生儿GBS 感染史 在妊娠37 周之前分娩 破膜时间超过18小时 分娩体温超过38.0度
新生儿进行一系列的保健工作，使母亲健康和胎儿、新生儿的成长发育 得到很好的保护。
GBS对孕妇的影响



GBS感染是胎膜早破的重要发病因素 GBS对绒毛膜有较强吸附能力和穿透能力，接种2小时内即可 吸附于母体组织，继而侵入绒毛膜，通过炎症细胞的吞噬作用 及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭，使胎膜局部张力减低， 从而导致胎膜早破 。 GBS生殖道感染是导致早产的重要因素 GBS引起泌尿生殖道感染时，会引起磷脂酶A2和前列腺素及 细胞因子的释放，刺激子宫收缩导致早产。 GBS是造成产褥感染的主要致病菌之一 产褥感染是指分娩时及产褥期生殖道受病原体感染，引起局部 和全身的炎性应化。产褥感染发病率为1%～7.2%，是产妇死 亡的原因之一 。
PCR原理
变性，退火，延伸 二次循环 三次循环
一次循环
PCR反应体系
PCR反应体系中的主要试剂有：
缓冲液 dNTP 引物 一般酶试剂会有配套缓冲液，通常含有Mg2+ 通常包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP 与待扩增DNA链互补的DNA片段
纯化水
水的纯度要求很高，最好只有水分子，不含