模式动物发育生物学实验报告——斑马鱼胚发育背轴节调节因子

模式动物发育生物学实验报告——体节调节因子对斑马鱼胚胎发育的影响
山东大学模式动物发育生物学实验报告
斑马鱼体节发育调节因子对胚胎发育的影响
姜政 2012/10/4 实验目的：
练习用显微注射法向斑马鱼受精卵中注射体节发育调节因子的mRNA，观察两种体节调节因子过表达作 用下斑马鱼胚胎发育的形态特点和规律，了解两种调节因子作用于斑马鱼体节发育的机理。 实验方法：
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Antivin（Lefty）是TGF-β（Transforming Growth Factor-β）超家族中的一个子家族，Antivin的过表达会阻 碍斑马鱼头部和躯干中胚层的发育。Activin的表达与体节调节过程并存，主要作用是减弱原肠期体节信号通 路，是体节调节通路中Cyc和Sqt的拮抗剂，因此Antivin与Sqt等组成了原肠期体节发生的正、负反馈调节因子。 Antivin过表达使斑马鱼体节调节控件Cyc、Sqt作用降低，反过来，Antivin的影响也可以被Cyc和Sqt的过表达 消除。体节分化过程中反馈调节的大致过程是：上游的调节因子启动Sqt、Cyc等的表达，并形成正反馈循环， 同时起始Antivin在中胚层的表达形成体节调节的负反馈循环（图3，右）。Antivin作为拮抗剂可能的机理是阻 断了体节调节受体与Sqt等配体的结合，使受体无法被激活[7]。通常，Antivin过表达的胚胎仅仅由前脑和眼 睛构成[6]，而实验观察发现，多数胚胎最终并没有发育出完整的眼睛，而且Nodal通路的受阻也彻底破坏了 胚胎的血液循环系统（图2）。在胚胎发育的体节期晚期，Lefty家族蛋白（Lefty1、Lefty2等）分别在胚胎左 侧的中脑和基板不对称表达，这显示了Lefty家族蛋白在胚胎左右轴决定（图4）中的作用[8]。
体节信号通路（Nodal Signaling）是斑马鱼中内胚层分化的最初步骤。Squint（Sqt）是一种在中胚层形成 和分化过程中与体节调节相关的生长因子[1]。通常，Sqt与其同系物cyclops（Cyc）共同在体节通路上发挥作 用（图3，左）。Cyc和Sqt都在囊胚期末期的中内胚层胚盘边缘处表达，其中Sqt在卵黄合胞体层(YSL)表达， 两者都是中胚层分化的诱导信号。Cyc和Sqt的同时缺失会导致原肠期中胚层的退化并进一步导致大部分中胚 层和内胚层的缺失，表现为头部、躯干缺失以及胚环不能形成[2, 3, 4]。
图3. 斑马鱼体节调节通路示意图（左）和正、负反馈调节模型（右）（引自Malcolm Whitman 2001）。 2
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通常，Sqt的过表达会导致背侧中胚层的异位和扩增，一些胚胎甚至形成副轴[5]。实验观察（图1）证明 了这一表型。在神经的早期发育过程中，Sqt和bozozok（Boz）是β-环连蛋白下游相互平行的调节蛋白，共 同促进神经前体的发育，Boz和Sqt同时缺失会导致胚胎端脑缺失[6]。
采集斑马鱼受精卵，用显微注射法向三批一定数量的受精卵中分别注射适量Squint配体mRNA、拮抗剂 Antivin （Lefty）mRNA和绿色荧光蛋白mRNA（作为实验对照），注射位置位于卵黄接近胚盘的部分。将 注射之后的受精卵加入ER营养液以28.5℃培养，定时观察胚胎发育情况并做照相记录。 实验结果：
图4. Lefty与Cyclops在斑马鱼胚胎中轴线和对称性形成过程中可能的作用模型（引自Bisgrove B.W. et al. 1999）。
参考文献： 1. Yu Chen, Alexander F. Schier. The zebrash Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature, 411(31): 607-610, (2001). 2. Malcolm Whitman. Nodal Signaling in Early Vertebrate Embryos: Themes and Variations. Developmental Cell, Vol. 1, 605–617, (2001). 3. Alexander F. Schier, Michael M. Shen. Nodal signalling in vertebrate development. Nature, 403(27): 385-389, (1999). 4. Hans Martin Pogoda, Lilianna Solnica Krezel, Wolfgang Driever and Dirk Meyer. The zebrafish forkhead transcription factor FoxH1/Fast1 is a modulator of Nodal signaling required for organizer formation. Current Biology, 10:1041–1049, (2000). 5. Alexander F. Schier and William S. Talbot. Nodal signaling and the zebrafish organizer. Int. J. Dev. Biol. 45: 289-297, (2001). 6. Stephen W. Wilson and John L. R. Rubenstein. Induction and Dorsoventral Patterning of the Telencephalon. Neuron, 28: 641–651, (2000). 7. Meno. C., Gritsman. K., Ohishi. S., Ohfuji. Y., Heckscher. E., Mochida. K., Shimono. A., Kondoh. H., Talbot W.S., Robertson E.J. et al. Mouse Lefty2 and zebrafish antivin are feedback inhibitors of Nodal signaling during vertebrate gastrulation. Mol. Cell, 4: 287–298, (1999). 8. Bisgrove B.W., Essner J.J., Yost H.J.. Regulation of midline development by antagonism of Lefty and Nodal signaling. Development, 126: 3253–3262, (1999).
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图1. 注射Squint配体mRNA的斑马鱼胚胎发育情况。 Squint蛋白过表达的斑马鱼胚胎在原肠期即开始发生形态异常（图1. Sqt 5h），胚层细胞外包时卵黄为
椭球形而不是正常的卵圆形。在体节期，异常主要表现为背部胚层过度发育（类似于锂离子处理32细胞期 胚胎的发育情况），背侧体节排列紊乱（图1. Sqt 18h右图箭头）。30h后，胚胎的畸形更加明显，具体表现 为：躯干背侧细胞增生（图1 Sqt 30h箭头），而同时期正常胚胎背部棱角分明；头部主要器官如眼原基和脑 的大部分缺失，没有明确的器官结构；心包膜与卵黄分离不正常。40h后，胚胎已经有大量黑色素细胞覆盖； 尾部伸展；红细胞开始出现，但心脏部位仍然紧贴腹侧卵黄，且没有心跳和血液循环，心包膜中空透明； 头部缺失，仅能看到耳囊。Squint过表达的胚胎存活率极低，绝大部分停留在了体节期。
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图2. 注射拮抗剂Antivin（Lefty）mRNA的斑马鱼胚胎发育情况。 Antivin过表达的斑马鱼胚胎最主要的形态异常是背部发育缺失，这与Squint过表达胚胎的表现相反。在
第5h原肠期时，大部分胚胎形态与图2. Lefty 5h相近，胚层下包不均匀，而不是正常胚胎的50%外包。进入 体节期和咽囊期，多数胚胎表现出了明显的背部缺失，具体表现为背部躯干没有明显的体节特征，且背部 与尾部相连处躯干缺失（图2. Lefty18h、Lefty29h箭头）。此外，上述胚胎还伴有卵黄不规则变形，头部眼原 基发育异常。50h左右进入孵化期的胚胎，躯干扭曲不能随绒膜形状自然伸展；卵黄形状不规则，心包膜缩 小；有红色血液产生但没有心跳和血液循环；眼睛缺失。 讨论：