微生物检验的操作技术
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微生物检验的操作技术
第一节 无菌操作
一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵
入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污 染的操作技术和管理方法； 无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是 保证微生物实验准确和顺利完成的重要环 节。
2、内容
无菌操作技术主要包括两方面：
1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培 养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌 等；
无菌操作技术
无菌操作
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
2、微生物检验过程中的无菌操作要求
（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放； （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准； （6）、不能用嘴直接吸吹吸管； （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%
来苏尔溶液的消毒桶内消毒。
3、无菌操作技术详细图解
（1）取菌技巧 （2）接种技巧 （3）错误示范 （4）注意事项
（1）取菌技巧A
接种环在火焰上充分烧 红（接种柄，一边转 动一边慢慢地来回通 过火焰三次）
（1）取菌技巧 A
2. 试管前端过火 3. 打打试管盖
（1）取菌技巧A
4. 试管斜倾，放入接种环
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
（1）取菌技巧 D
3. 按钮压至第一段 (不 可压至最底)
4. 深入液面下 2 ~ 4 mm
（1）取菌技巧 D
5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体
（2）接种技巧
4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌 或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通 过火焰消毒；
5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属 丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；
6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不 得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在 开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
净. 3.无菌器材 （1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等； （2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作
台、手等。
。
（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅； 无菌操作台上只允许摆放以下物品：
物品 酒精灯
数量 1个
物品 灭菌平皿
数量 10块
打火机
1个
试管架
2副
接种针 消毒棉球
洗耳球 镊子 油性笔
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
① 无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消 毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；
② 无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用 室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m 处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不 得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔 两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢， 以减少紫外线穿透的影响；
（1）取菌技巧A
5. 试管前端过火，盖上試管盖
6. 接种环烧 红灭菌
（1）取菌技巧 B
1.(方法二：平板反面拿起)
2. 自 平板 上取单一菌 落 (方法一：盖子微开遮 住培养基，避免空气中菌 体掉入)
（1）取菌技巧C
1. 挤出安全 吸球內空气， 插上灭过菌之 玻璃吸管
2. 向上为吸 ，向下为放
二、无菌操作的环境要求
• 无菌室 • 超净工作台 • 无菌器材
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间； （2）无菌室的消毒和防污染 • 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）； • 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）； • 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进
行消毒。
（3）无菌室使用要求
1个
灭菌吸管
根据需要
1瓶
电子称
1台
1个
250ml灭菌三角 瓶
2个
1个
培养基
根据需要
1支
混匀器
1台
三、无菌操作的基本技术
1、无菌接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具 （如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于 培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无 菌操作。
1. 试管前端过火 2. 打开试管盖
（2）接种技巧
方法一：以接 种环沾菌，放
入新的培养基中 接菌
方法二：以安 全吸球吸取菌
液，放入新的培 养基中，向下排 出菌液
方法三：以
Pipetman 吸取
菌液，按钮压至 最底排出菌液
（3）错误示范
试管直放，空气中菌体 容易掉入
操作時离火源遥远
（3）错误示范
2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行 接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打 开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具 应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手 直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子 等；
3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位， 使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或 平皿边；
2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物 的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏 蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器 皿灭菌、操作方法等。
3.无菌操作原则
1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌 区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用 肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；
安全吸球倒放，菌液 容易流入吸球內
安全吸球随意放置桌面，菌 液容易流出至桌上
来自百度文库
（3）错误示范
Pipetman 倒放，菌液容 易流入 Pipetman 內
第二节、微生物的接种、分离纯化 和培养技术
一、接种
1、接种定义 • 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基
第一节 无菌操作
一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵
入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污 染的操作技术和管理方法； 无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是 保证微生物实验准确和顺利完成的重要环 节。
2、内容
无菌操作技术主要包括两方面：
1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培 养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌 等；
无菌操作技术
无菌操作
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
2、微生物检验过程中的无菌操作要求
（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放； （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准； （6）、不能用嘴直接吸吹吸管； （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%
来苏尔溶液的消毒桶内消毒。
3、无菌操作技术详细图解
（1）取菌技巧 （2）接种技巧 （3）错误示范 （4）注意事项
（1）取菌技巧A
接种环在火焰上充分烧 红（接种柄，一边转 动一边慢慢地来回通 过火焰三次）
（1）取菌技巧 A
2. 试管前端过火 3. 打打试管盖
（1）取菌技巧A
4. 试管斜倾，放入接种环
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
（1）取菌技巧 D
3. 按钮压至第一段 (不 可压至最底)
4. 深入液面下 2 ~ 4 mm
（1）取菌技巧 D
5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体
（2）接种技巧
4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌 或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通 过火焰消毒；
5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属 丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；
6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不 得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在 开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
净. 3.无菌器材 （1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等； （2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作
台、手等。
。
（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅； 无菌操作台上只允许摆放以下物品：
物品 酒精灯
数量 1个
物品 灭菌平皿
数量 10块
打火机
1个
试管架
2副
接种针 消毒棉球
洗耳球 镊子 油性笔
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
① 无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消 毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；
② 无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用 室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m 处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不 得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔 两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢， 以减少紫外线穿透的影响；
（1）取菌技巧A
5. 试管前端过火，盖上試管盖
6. 接种环烧 红灭菌
（1）取菌技巧 B
1.(方法二：平板反面拿起)
2. 自 平板 上取单一菌 落 (方法一：盖子微开遮 住培养基，避免空气中菌 体掉入)
（1）取菌技巧C
1. 挤出安全 吸球內空气， 插上灭过菌之 玻璃吸管
2. 向上为吸 ，向下为放
二、无菌操作的环境要求
• 无菌室 • 超净工作台 • 无菌器材
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间； （2）无菌室的消毒和防污染 • 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）； • 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）； • 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进
行消毒。
（3）无菌室使用要求
1个
灭菌吸管
根据需要
1瓶
电子称
1台
1个
250ml灭菌三角 瓶
2个
1个
培养基
根据需要
1支
混匀器
1台
三、无菌操作的基本技术
1、无菌接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具 （如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于 培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无 菌操作。
1. 试管前端过火 2. 打开试管盖
（2）接种技巧
方法一：以接 种环沾菌，放
入新的培养基中 接菌
方法二：以安 全吸球吸取菌
液，放入新的培 养基中，向下排 出菌液
方法三：以
Pipetman 吸取
菌液，按钮压至 最底排出菌液
（3）错误示范
试管直放，空气中菌体 容易掉入
操作時离火源遥远
（3）错误示范
2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行 接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打 开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具 应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手 直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子 等；
3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位， 使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或 平皿边；
2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物 的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏 蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器 皿灭菌、操作方法等。
3.无菌操作原则
1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌 区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用 肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；
安全吸球倒放，菌液 容易流入吸球內
安全吸球随意放置桌面，菌 液容易流出至桌上
来自百度文库
（3）错误示范
Pipetman 倒放，菌液容 易流入 Pipetman 內
第二节、微生物的接种、分离纯化 和培养技术
一、接种
1、接种定义 • 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基