ABI_3730xl测序仪简介-01
ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
检查胶瓶中的胶以确认有足够的胶完成实验
每天或每次实验前
检查泵胶块和下胶块以确认其未松动
每天
清洁仪器表面、实验台表面
每天
检查毛细管旋钮，连接管螺帽和阀门以防止泄露
每天
每星期
维护工作
频率
使用Change Polymer向导换胶
每星期或需要时
检查旧毛细管的储存条件
每星期
使用注射器抽取20ml去离子水，清洗泵头的密封圈
每次实验前
更换溶液槽中的Buffer和水，确认槽的外围是干燥的
每48小时或每20个runs
更换water和waste溶液槽中的水，确认槽的外围是干燥的
每天或每20个runs
检查泵上下block、连接管、胶管和各通道中是否有气泡，使用Bubble Remove向导除去气泡
每天或每次实验前
检查毛细管的取样末端以确认其未损坏
每星期
使用去离子水浸泡胶垫，用自来水冲洗后再用去离子水洗一遍
每星期或需要时
每月
维护工作
频率
运行Water Wash向导，不管有无气泡，冲洗毛细管端口
每月或需要时
检查旧毛细管的储存条件
每月或需要时
每年
维护工作
频率
对机器内部进行除尘清洁，光路校正等整体保养
每年或需要时
需要时
维工作
频率
清洁漏液托盘
需要时
更换毛细管
需要时
去除毛细管末端已经干掉的胶，使用双蒸水湿润的无纤维布
需要时
使用无屑的棉球沾上无水乙醇轻轻擦拭毛细管检查窗口两端
每季度或空间、光谱校正时
ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
3730测序结果说明
测序结果说明1.测序完成后，我们用对每个样品提供一份测序报告，其中包括：测出的序列彩色峰图（请用Chromas软件打开）序列文件拼接后结果（需要测通的样品）2.在进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚。
3.正常情况下，3730测序仪保证800bp的有效长度，但是有时由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中断无法进行的情况。
如：G/C rich；G/C Cluster；Poly A/T/C/G的连续结构等。
此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有两个以上结合位点。
以上情况是由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们会根据具体测序结果进行相应收费。
出现以上情况后，我们提倡从另一端进行测序，或者用高级试剂盒进行测序。
4.备注说明一般正常的菌液和质粒自收样日至发送报告日周期为二--三天，PCR产物（纯化及未纯化）为三--四天。
对于三个工作日内无法得到满意测序结果的，我们会用E-mail或电话与客户或代理商联系。
并不是所有的样品都能得到满意的测序结果，对于测序结果不好的，我们会尽力找到可能的原因，以建议进一步如何操作。
测序常见问题解答Q1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？A1.首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。
如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以将培养好的4~5ml菌液离心沉淀下来，倒去上清液以方便邮寄。
同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中造成离心管挤压破裂。
Q2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?A2.溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
3730测序流程
能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，通过离心可
沉淀下来
碱裂法提取质粒操作步骤
菌体的培养
（挑单克隆或加少量菌液在含抗生素的培养基中，37℃震荡过夜培养
菌体的收集
（13000rpm离心1min，使菌体充分沉淀，弃上清）
质粒提取步骤一： 加入200ul I液 ，充分振荡,直到管底无沉菌为止 • 溶液I的组分：1.0M Tris-HCl / 0.5M EDTA， pH8.0，用前按比例加入RNase酶 • 溶液I的作用：菌体悬浮 • EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用 。 • 如果缺了溶液I，我们也可以用等体积的水或 LB培养基来悬浮菌体。 • 特别注意：菌体一定要悬浮均匀，不能有结 块。
五 上机操作
ABI 3730xl 自动测序仪外观图
胶泵
废液槽 POP7胶瓶 阳极缓冲液瓶 CCD检测窗口 缓冲液槽 水槽
96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架
已跑完板子放这 待上机样品放这
六 测序结果的分析处理
3730xl Sequence Map
测序结果峰图文件
Thanks!
ABI BigDye 3.1的组成成分
• • • • • • 测序酶 脱氧的dNTP 双脱氧的dNTP(荧光标记) Mg2+ ddH2O buffter
DNA测序模板用量
PCR产物
100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1000-2000 bp 2000 bp 1- 3 ng 3-10 ng 5-20 ng 10-40 ng 20-50 ng
RNase酶未加或失活
质粒提取步骤二： 加入300ul II液， 轻柔颠倒5~10次。 • 溶液II的组分： 0.4 N NaOH / 2% SDS； 两种溶 液等体积混合后使用 ，必须现用现配 • 溶液II的作用：裂解作用 • 溶液II在天气冷时会产生絮状沉淀，可温水预热 至沉淀消除。 • SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是： a.溶解细胞膜上的脂质与蛋 白，从而破坏细胞膜。 b.解聚细胞中的核蛋白。 c.能使蛋白质变性而沉淀下来。
ABI公司相关仪器简介
• 触摸屏
• 多种规格：
样品基座升降温速度3.9℃5 ℃ /s
见微知著 去伪存真
60-Well 96-Well & 96-Well Fast 384-Well
Genetic Analyzer
• 1986年全球第一台测序仪370 373 377 310（1996年，第一台毛细管） 3100-avant, 3100 3130, 3130xl （中、高通量） 3730， 3730xl（生产规模）
见微知著 去伪存真
7500 Real-Time PCR System
见微知著 去伪存真
• 五色荧光技术 • 新型光路设计检测更
多荧光标记FAM™/SYBR®
Green I, VIC®/JOE, NED™/ TAMRA™/ Cy3®, ROX™/Texas
Red®,和Cy5®
• 96-well • Standard-小于2hs
降温速度4.1℃/s
• 9700技术
• 2h 25min • 26*52*30，12kg • GeneAmp 快速PCR
通用试剂&96孔快速 反应板
见微知著 去伪存真
Veriti TM Thermal Cycler
• PCR仪的革新
• 9700 & VeriFlex TM Blocks——6个独立的温 度模块
见微知著 去伪存真
Thank You！
见微知著 去伪存真
见微知著 去伪存真
2720 Thermal Cycler
样品基座升降温速度 2.7℃/s
• 9700技术
• 价格优惠
• 小巧21*36*22，6.1kg， 散热装置在仪器后面
• 可计算Tm值，确定引物 的退火温度
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
Sanger测序流程
③测序反应板离心后，每个反应孔加入EDTA-Na2溶液2.5μl，85%乙醇40μl，充分震荡3min，离心3000g，4℃，30min（EDTA作为金属离子螯合剂, 能与测序PCR反应体系中的离子结合从而去除离子）。
④离心结束后将测序反应板倒置于吸水纸上，倒离心至离心力达到185g（或900rpm）时立即停止。
⑤每孔加入70%乙醇50μl，充分震荡1min，离心3000g，4℃，15min（DNA片段在70%的乙醇中溶解度低, 能通过离心沉淀下来）。
⑥重复4步骤。
⑦避光风干15~30min，每孔加入10μl HIDI（变性处理，生物安全柜中进行），离心后在PCR仪中96℃反应2min，降温至4℃后取出。
6、上机测序变性结束后，上测序仪（ABI 3730）进行测序。
1.创建样品板程序①选择GA Instruments > ga3730 > Plate Manager；②点击New按钮，弹出的New Plate Dialog窗口中填写相应的内容（在ID和Name空白栏中输入样品板的名字; 在Application中选择相应的测序程序; 在Plate Type中选择96或者384孔板; 在Scheduling中定义取样顺序; 在Plate Sealing中选择Septa; 在Owner Name、Operator Name中输入操作者。
③点击“OK”按钮; 在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中, 填入相关的内容（在Sample Name中填入样品名, 96孔板在A01行填写“1”，384孔板依次在A01、B01、A02、B02行写1、2、3、4；在Results Group 1栏中选择数据上传路径; 在Instrument Protocol 1栏中选择测序程序; 在Analysis Protocol 1栏中选择数据分析程序）。
④然后全选A01行，点击Edit > Fill Down Special, 选中Fill Down Special (96 Cap), 将自动生成96行; 如果是384孔板, 依次全选A01、A02、B01、B02行，重复4次操作, 点击“OK”。
3730中文说明书
指示灯 绿灯长亮
操作 继续实验
绿灯闪烁 仪器与电脑无法联机
黄灯长亮
仪器下载 firmware 仪器自检 加热炉门打开 前门打开 缓冲液槽未安装 毛细管未安装 开门状态下进行向导 操作 故障
黄灯闪烁
红灯长亮
确认已进入 WIN2000 界面 确认网线连接正确 确认前门关闭 确认各溶液槽位置正确 确认 3730User 的帐号和密码正确 确认前门，加热炉门已关闭 确认毛细管和缓冲液槽已安装
如果有胶冲入阳极缓冲 液杯中请更换缓冲液
ABI Prism® 3730 简明使用手册
用无纤维纸擦干
2.毛细管空间定位 ( Spatial Calibration )
什么是毛细管空间定位？
毛细管空间定位程序把每道毛细管的荧光信号落在CCD上的位置标记出来，从而使DC软件能 够找到这些信号。
何时作毛细管空间定位？
5.激发和检测
当标记有荧光素的DNA片断移动到检测窗口时，荧光素受到激光束的激发而产生荧光信号， 此荧光信号被CCD检测器所检测并被转化为电信号传递到计算机。
第 2 页 共 30 页
ABI Prism® 3730 简明使用手册
6.数据采集和处理
CCD检测器把检测到的荧光信号转换为电信号，并把它传送给安装了Data Collection软件 的计算机工站。工作站接收到信号后，用预先设置好的方式进行初步处理，并把这些数据 存贮在计算机的数据库里。
固定器 橡胶垫 槽盖 溶液槽 基座 电源线 （仅限于缓冲液槽）
注意： 溶液槽组装好后，请仔 细检查，橡胶垫是否平 整；槽盖的橡皮垫圈安 装正确；固定器和橡胶 垫的孔已对齐 1X缓冲液在2～8度可放 置1个月，室温可放置1 星期 每48小时请更换缓冲液
法医DNA实验室及仪器简介
驱动电机、调速器、 定时系统 制冷系统 速度辅助 密度成型器 抽真空系统
铝合金——甩平式& 铝合金&钛合金—— 高强度钛合金
角式
角式
硬质玻璃、硬塑料、 具盖聚乙烯硬塑料制 具盖聚乙烯硬塑料制
不锈钢
品
品
各式离心管
玻璃离心管 PA管 PP管 PC管 CN管
微型离心机
微型低速离心机 —— 4,000rpm-6,000rpm —— 6×1.5ml、0.5ml、0.2ml
分析超速离心机
70,000rpm 具有紫外、干涉光两种检测器 绝对/相对分子量测定、样品纯度/浓度测定，分子的聚合/解离分析，
热动力学和流体力学参数确定，核酸/蛋白/病毒测定与分析
制备超速离心机
40,000rpm-100,000rpm
容量大
用于分离制备线粒体、溶酶体， 病毒，具有生物活性的核酸、 酶等生物大分子。
Pop4&Pop6 96-& 384- 两支注射器
Pop4&Pop6 96-& 384- 两支注射器
Pop4 &6 &7
Pop4 &6 &7
Pop7
96-& 384- 胶瓶 96-& 384- 胶瓶 96-& 384- 胶瓶
Pop7
96-& 384- 胶瓶
移液器
德国Eppendrof
法国Gilson
法医DNA实验室及仪器简介
于丹
法医物证学任务 ——个体识别 ——亲权鉴定
法医物证学研究方法：化学、物理、形态学、免疫血清学、 生物化学、分子生物学、遗传学等等。
法医DNA实验室中的重要仪器 ——离心机 ——PCR仪 ——遗传分析仪 ——移液器
核子基因公司简介及系列产品与服务介绍
••••深圳市核子基因科技有限公司（简称核子基因）成立于2012年，是一家集基因技术研发、市场应用于一体的高新科技型企业，分司法鉴定、医学检验、健康管理，科研服务四个板块。
核子基因与协和医科大学、武汉大学、复旦大学、中国医科大学等高校共同建立了多个国内领先的基因研发平台，拥有多项国际水准的科研成果，为国内各大科研院校、医院、研究机构提供专业的基因检测和研究服务。
核子基因自成立至今，凭借着雄厚的资本、先进的设备、领先的技术、优质的服务、高效的管理不断发展壮大。
（核子基因深圳总部南山智园图）核子基因成立4年时间内，在深圳、广州、北京、哈尔滨、长春、沈阳、济南、西安、上海、杭州、武汉、长沙、重庆、成都、贵阳、昆明、南宁、海口等全国大中城市设有44家子公司和28个标准化实验室，检测服务已经覆盖全国。
••••核子基因已获得28个国家正式审批的医疗和司法牌照核子基因检测平台1.Illumina公司：NextSeq500、Hiseq4000二代测序仪。
2.ABI公司：3500XL、3730XL测序仪。
3.sequenom公司：MassARRAY飞行时间质谱（MALDI-TOF）仪。
••••••••4.Affymetrix ：GeneChip 实验平台。
5.罗氏公司：480Q-PCR 仪。
深圳市核子基因科技有限公司主营三大项目：1.医疗：无创产前基因检测、胚胎植入前遗传学筛查、17/3500种常见遗传病基因、染色体异常基因检测、新生儿48种常见遗传病基因检测、心血管病精准用药基因检测、耳聋基因检测、地中海贫血基因检测、肿瘤个体化用药基因检测、TCT 、HBV 、HPV 基因分型检测等基因筛查。
2.健康：防癌基因检测：肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、喉癌、鼻咽癌、食管癌、淋巴瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病 、甲状腺癌、膀胱癌、宫颈癌、基底细胞癌、睾丸癌、胰腺癌、乳腺癌天赋基因：艺术特长、性格特征、情商、智商、身体素质儿童常见病基因：多动症、肥胖、孤独症、高度近视、哮喘、慢性鼻窦炎成人心血管疾病：冠心病、脑卒中、先天性心脏病、原发性高血压成人慢性病基因：阿尔兹海默症、帕金森、心肌梗死、心绞痛、痛风、2型糖尿病儿童常见疾病安全用药：解热镇痛类、平喘类、消化系统类、抗菌类、抗寄生虫类、抗过敏类、神经系统类、糖尿病类其他：儿童认知宝、数学能力检测、防拐基因身份证、叶酸基因、酒精基因、耳聋基因、肌肤抗衰老基因3.司法：隐私亲子鉴定、司法亲子鉴定、无创亲子鉴定、亲缘鉴定。
3730XL 测序仪器操作指南说明书
3730XL 测序仪器操作指南开机：（1）打开显示器和电脑的电源开关，按键Ctrl+Alt+Delete ，输入密码125；（2）打开仪器电源开关，仪器初始化过程中电源旁指示灯由黄色闪烁20秒变为绿色；（3）双击打开桌面上Data Collection 软件，等待Service Console 窗口中的指示灯全部变成绿色后，DC 软件打开弹出。
关机：（1）与开机顺序相反，先点击Service Console 窗口上Stop ALL 按钮，等4个绿色小方框都变为红色圆圈时即可点击“X ”，关闭Run 3730 Data Collection 软件；（2）关闭仪器电源；（3）关闭电脑主机。
测序模板导入：（1） 当Data Collection 软件打开后，点击GA Instruments 3730, 点开“+”号；（2） 然后点击plate manager ，点击import 导入已经编辑好的模板（E:/plate manager ），最后点击open 就ok 了。
E: Plate manger (如何编辑模板)A. Copy 上一个编辑好的模板，按当天日期修改文件名（如20150630）B. 双击点击“是”（激活窗口点“关闭”）C. 将打开的EXCEL 表格中Container Name 和ID Plate 改为文件名（20150630）D. 将Sample Name 先修改为blankE.按列的顺序依次输入A1H1……A2H2，以此类推，空白孔不改，仍为blankF.点击左上角保存，点击是，跳出窗口G.点击右上角“X”关闭，跳出的窗口点击“不保存”运行程序：（1）打开Data Collection软件中的run schedule search advanced plate ID start with（例如20150630找到相应的测序表）点击add Done；（2）当软件左上方三角星由灰色变为绿色时，点击ok就开始运行程序，大约测序反应需要2.5小时，微卫星分析需要1小时。
ABI 3730xl测序仪简介-01
基因分型
2008年基因分型样本量为30000个； STR,SNP,CNV遗传标记
测序的原理
DNA测序的双脱氧链末端合成终止法. Sanger法测序的原理：
用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终 止核苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱 氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地 在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱 基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。
- 氩离子激光光源； 氩离子激光光源； 实现实时的、空间连续的测量；可以保证返回的光信息能够达到探测的量级。 激发波长为488nm和514.5nm 毛细管规格: 毛细管规格 96道毛细管 道毛细管 毛细管长度: 毛细管长度 50cm 凝胶的规格: 凝胶的规格 POP-7液体分离胶 液体分离胶 配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer) 配套的试剂 基因测序 和 × 基因分型(Liz120, Liz500, ROX500) 基因分型
SNP遗传标记在SnapSHot反应的结果
原理： 单碱基延伸,单碱基测序.利用延伸引物对PCR产物进行单个碱基的延伸,并引 入尾部的荧光.其荧光的颜色及其荧光出现的位置进行区分其基因型 SnapSHot技术优点： 可以研究样本量少,snp位点多,位点间物理距离较远的SNP检测.
13010G
13263A
DNA测序技术的发展历史与最新进展
・技术与方法・ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
ＢＵＬＬＥＴｌＮ
２０１０年第８期
ＤＮＡ测序技术的发展历史与最新进展
解增言
摘
林俊华
谭军
舒坤贤
（重庆邮电大学生物信息学院．重庆４０００６５）
要：ＤＮＡ测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。从１９７７年第一代测序技术的出现。经过３０多年的发
展，ＤＮＡ测序技术取得重大进展，以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化，以单分子测序为特点的第三代测序 技术也已经出现。介绍每一代测序技术的特点，并重点介绍了第二代测序技术及其应用。展望新的测序技术时于未来生物 学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。
Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ
连接
带有接头的单链ＤＮＡ被固定在
ＤＮＡ捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个单链ＤＮＡ 片段。随后扩增试剂将磁珠乳化，形成油包水的混 合物，这样就形成了许多只包含一个磁珠和一个独 特片段的微反应器。
３．１．３
扩增
每个独特的片段在自己的微反应器
Ａｎａｌｙｚｅｒ测序平台和ＡＢＩ公司的ＳＯＬ—
２．３
第一代ＤＮＡ测序技术 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它
荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Ｓａｎｇｅｒ原理，用荧光标
们的基础上发展来的各种ＤＮＡ测序技术统称为第 一代ＤＮＡ测序技术。第一代测序技术在分子生物 学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划
（ｈｕｍａｎ
ｇｅｎｏｍｅ
记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大 大提高了ＤＮＡ测序的速度和准确性。 早在１９８５年，Ｓｍｉｔｈ等采用激光激发标记的荧 光，并用ＣＣＤ检测，比常规电泳测序速度提高９倍， 测序速度达到８
ABIPRISM3730型遗传分析仪基本操作培训
一种毛细管/一种胶，多种应用
从测序切换到片段分析时，无须换胶和毛细管 实验参数由Run Module文件定义
Type of Run
Spatial Calibration Spectral Calibration
Sequencing
Existing Run Modules (Supported in 3100/3100Avant)
Fragment Analysis
35
FragmentAnalysis22_POP4 FragmentAnalysis36_POP4 HIDFragmentAnalysis36_POP4 FragmentAnalysis50_POP4 FragmentAnalysis50_POP6 SNP22_POP4 SNP36_POP4
质粒DNA (200ng/ µL)
引物 (3.2 pmol/µL) BigDye 去离子灭菌水
循环条件
1 µL 1 µL 8 µL 10 µL 总体积 20 µL
96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25个循环 →4 °C保温
信号更强，测序更长 峰间距更均匀，序列判读更准确 峰高更均匀，杂合子判读更准确 困难模板测序的成功率更高
z 从v1.0、v2.0到v1.1不必做光谱校正 z 从v3.0到v3.1不必做光谱校正 z 从v1.0、2.0、1.1到v3.0、3.1要做光谱校正
9
质粒测序的反应体系
标准反应体系
4
DNA测序的原理
DNA测序基本过程
通过一种特殊的PCR反应（测序PCR），使 DNA分子大量复制，而且复制过程平均地在 每一个碱基上终止，在每一个位置上都有一 部分反应被终止，也有一部分反应继续进行
一代至四代测序技术详细讲解
一代至四代测序技术详细讲解一、我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时，却成为限制其广泛应用的一个障碍。
1980年，英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖，至今已有近三十年了。
在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。
目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。
在过去几年，应用极为广泛的毛细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式，它运用尖端的荧光成像技术进行碱基识别。
上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角，也使实验研究达到一个新的水平。
学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨，与此同时，人们却发现这些技术存在一定的不足――大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应用，并降低了其市场价值。
过去，研究人员使用Applied Biosystems（ABI）公司的3730XL毛细管电泳测序仪进行基因分析，每年至多能完成六千万碱基的测序量。
随着测序技术日新月异的发展，这种情况已经成为历史。
在2021年刚刚开始进行新一代测序技术开发时，Roche公司和454公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上述提及的 ABI仪器速度的50倍之上。
也就是从那时起，因基因数据过多而产生的问题凸显了出来，而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈加严重。
举个例子，ABI的新一代测序平台SOLiD （supported oligonucleotide ligation and detection）单次运行，便可以分析6Gb的碱基序列；而Roche/454测序仪单次运行可以将上述结果转换成12-15个千兆字节（gigabytes）的数据信息；Illumina Genome Analyzer（GAII）测序系统仅在两个小时的运行时间里，就得到10兆兆字节（terabytes）的信息。
3500遗传测序仪介绍
370型全世界第一台基因分析仪 373型基因分析仪 377 型基因分析仪，光栅+CCD 310型毛细管基因分析仪,全世界第一台毛细管分析仪 377-96基因分析仪 3700型96道毛细管基因分析仪 3100 16道毛细管基因分析仪 3100 Avant 4道毛细管基因分析仪 3730 48道毛细管基因分析仪 3730xl 96道毛细管基因分析仪 3130 4道毛细管基因分析仪 3130xl 16道毛细管基因分析仪
Life Technologies™ Proprietary | 33
仪器耗材——胶的安装
Pull Lever Down Pull Lever Up
Life Technologies™ Proprietary | 34
仪器耗材——缓冲液
Life Technologies™ Proprietary | 35
Life Technologies™ Proprietary | 23
内部照明灯开关
仪器结构
3500/3500xl基因分析仪
宽度：61cm 深度：61cm 高度：72cm 重量：82kg
3130/3130xl基因分析仪
• 宽度：74cm
• 深度：54.8cm • 高度：81cm • 重量：130kg
易于安装的锁定装置 过期日期 • 内壁无涂层 • 50 µ m 内径 • 160 runs
Life Technologies™ Proprietary | 30
易于存储
仪器耗材——毛细管
Life Technologies™ Proprietary | 31
仪器耗材——胶
Additional “free” volume to enable installation, wizards and proper pouch functionality (and may be left over at the end) Standard volume For running 960 or 384 samples Provides: - Ease of use - Quality - Predictable cost per sample
常用的五种基因测序仪器的比较
2. HeliScope 的优势
• 单分子测序减少了试剂的使用，测序成本 价格大大降低，使得人的基因组测序低于 1000美元慢慢走向可能。
• 不需要扩增建立DNA库，从而切断数据结 果中潜在错误的来源
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五种测序仪器的比较
• 由上表可以看出，第二代和第三代测序仪由于消耗的试剂 少在测序费用上有了明显的降低，但是在读长上3730xl依 然具有绝对的优势，不过随着技术的完善，新一代的测序 仪依然拥有极大的提升空间。
• 准确性。 新的超精确检测模块（ECC模块）将提供高达 99.99%的精确性；多达98%的可定位碱基的质量 值高于45；更多标签以提高灵敏度和动态范围； 高准确性的原始读序，支持无参考序列的数据分 析。
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三、测序仪之——Illumina Genome Analyze
1. Illumina GA的测序原理 • 制备DNA • 桥式PCR产生DNA簇 • 测序
上市时间
2002年 2007年 1月
2007年
2005年 2008年
2月
20
如何选择合适的测序仪
测序的准确度和各自的优势的考虑：比如是善于发
现插入、缺失突变还是善于发现碱基替换突变。
项目考量：比如重测序对于测序长度的要求没有从
头测序的要求高；对于需要依靠标签计数的测序项目，会更 加需要能将待测片段分割成尽量多、尽量小片段的测序方法。
大规模并行焦
ROCH-454
磷酸合成
GS FLX
测序法
通过质量优
化将错误率 可获得超过20 GB的
降低到0.1%
高品质数据
检测同 聚物
每轮运行能获得4-6 超长的读
亿个碱基对
长400bp
37303730xl中文简明使用手册(40页)
Step3：上样前设置
3A. 确认下胶块，泵胶块，胶块连接管及胶管已安装到位 3B. 确认阴极Buffer，Water，Waste槽的液面不低于刻度线（约80ml） 并已安装到位 3C. 确认阳极Buffer杯中液面不低于刻度线（约67ml）并已安装到位 3D. 确认毛细管已安装到位，空间定位已完成 3E. 确认Dye Set相应光谱校正已完成 3F. 确认样品已正确放置于样品舱内 3G. 在Plate Manager内编辑样品板，准备上样
CCD检测器把检测到的荧光信号转换为电信号，并把它传送给安装了Data Collection（简称 DC）软件的计算机工站。工作站接收到信号后，用预先设置好的方式进行初步处理，并把 这些数据存贮在计算机的数据库里
7. 自动数据提取和分析
工作站会自动地从数据库中提取这些数据，并根据不同的运行模式，完成对样品DNA的碱 基序列或片段信息的分析，然后把分析完成后的结果数据以样品文件的形式保存于计算机的 硬盘中
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Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer 简明使用手册 白色固定器 灰色橡胶垫 溶液槽盖 溶液槽
可加热基座
普通基座
供电接头
Water/Waste 槽组件
Buffer/Water/Waste槽组件组装示意图 注意： 1. 组装溶液槽盖的时候，注意周围的橡皮垫正确安装
黄灯闪烁
红灯长亮
·确认已进入Windows界面 ·确认网线连接正确 ·确认仪器门已关闭 ·确认各溶液槽位置正确 ·确保电脑名未更改，否则请改回原电脑名 ·确保电脑防火墙已关闭 · 确 保 电 脑 与 仪 器 连 接 的 IP 地 址 为 ： 192.168.0.1 ·确保电脑用于通讯的用户名3730User，密码 为3730User，并且设置为永不过期 ·确认仪器门及加热炉门已关闭 ·确认毛细管及缓冲液槽已安装
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
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基因分型
2008年基因分型样本量为30000个； STR,SNP,CNV遗传标记
ABI 3730xl测பைடு நூலகம்仪简介
生物医学研究院 5楼 联系电话：54237651 联系人：夏明英，李士林
主要特性（一）
- 内置一体化自动进样器及样品孔打孔装置； - 内置样品板条形码自动识别； - 100次（9600个样品）运行试剂一次上机； - 自动碱基识别与质量评分判定； - 动态铂金内镀毛细管壁；
12406G
4833T 10646G 4491C
7028T
12705T 14569G
5301T 15607A 9824A 5178A
4715T 5417G 3010T 4216T 663A 11719A
3730xl的总结
基因检测：
2008年对4万个样本进行测序
检测碱基数达到2千4百万个
现可检测的PCR产物长度为600-1000bp
- 氩离子激光光源； 实现实时的、空间连续的测量；可以保证返回的光信息能够达到探测的量级。 激发波长为488nm和514.5nm
毛细管规格: 96道毛细管 毛细管长度: 50cm 凝胶的规格: POP-7液体分离胶
配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer)
1000样本
10小时
测序的原理
DNA测序的双脱氧链末端合成终止法. Sanger法测序的原理：
用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终 止核苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱 氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地 在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱 基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。
SNP遗传标记在SnapSHot反应的结果
原理： 单碱基延伸,单碱基测序.利用延伸引物对PCR产物进行单个碱基的延伸,并引 入尾部的荧光.其荧光的颜色及其荧光出现的位置进行区分其基因型 SnapSHot技术优点： 可以研究样本量少,snp位点多,位点间物理距离较远的SNP检测.
13010G
13263A
主要用途（三）
1、原始数据分析 数据收集软件 （随机配置） Data Collection v3.0 Auto-analysis with GeneMapper® v4.0
Seqencing analysing® v5.2
2、基因测序及分型的运行时间 96样本 1小时40分钟 (3130xl需要6个小时)
基因分型(Liz120, Liz500, ROX500)
主要特性（二）
- 高质量测序结果 • 电泳温度70°，去除二级结构的影响； • 新型Pop-7分离胶，可测900-1100碱基测序长度; • 新型碱基识别与质量评分软件，提高测序准确性; - 最高灵敏度的光路系统 • 毛细管内荧光检测 • 后置超薄CCD检测系统 • 双光束双侧激光激发，荧光信号强度高度均一 • 高灵敏度提高检测DNA的浓度范围 - 超低成本测序平台 • 高灵敏度减少DNA和测序试剂的使用量。 • 胶使用量比3700少30倍 • 高成功率及长读结果减少非电泳相关的整体项目成本 • 更高的自动化减少劳力成本及人为失误的成本
Liz500：FAM(蓝色), VIC (绿色), NED (红色), HEX(黑色) Liz120；ROX500(FAM,JOE,NED,PET) 2、目的片断的大小. Liz500(35-500bp), Liz120(15-120bp)
STR遗传标记基因分型
CNV遗传标记在MLPA反应的结果
不同测序片段分析
200-250bp（36cm）
300-350bp（36cm）
500-650bp(36cm)
不同测序片段分析
150bp-300bp(50cm)
STR遗传标记的测序结果
AC
具有Ploy-A的片段序列
A
基因分型
原理:在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大小， 检测基因型. 内标选择: 1、荧光.(引物上物加的荧光的类型)