dna测序仪

特点

重现性好，所用试剂简单，易于掌握；
所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA 序列效果较好； 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况， 通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作 用。
第十四章 全自动DNA测序仪和 蛋白质自动测序仪
“基因组”----生命科学的“元素周期表 ”
元素周期表
元素周期表的发现奠定了二 十世纪物理、化学研究和发展的 基础
人体解剖图奠定了现 代医学发展的基础
“基因组序列图”将奠定二十一世纪生 命科学研究和生物产业发展的基础！
生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之 中
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转录图谱
利用EST（expressed sequence tags 表达序列标签）作为标记所构建的 分子遗传图谱
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来自百度文库
序列图谱
通过基因组测序得到的，以A、T、G、 C为标记单位的基因组DNA序列
• 物理图谱的构建
• 大片段克隆的筛选
• 霰弹法测序与“工 作框架图”的构建
• 序列的全组装与 “完成图”构建
ddNTP结构示意图
PCR（聚合酶链式反应）原理
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃）

与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟
基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过
其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH 发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它 们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键 ，从而使正在延伸的DNA链在此终止。


荧光标记引物法
Primer Primer Primer Primer
A
G
C
T
图18-8 荧光标记引物法原理
多色荧光标记法 -- 荧光标记终止底物法
定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷 酸上
反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带 有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的 同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料 经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来 判断所代表的不同碱基信息


单色荧光标记法

也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法 和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个 反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物 也分别在不同泳道中电泳

单色荧光标记法与多色荧光标记法的 异同点：
均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法

了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病 ，是生命科学的核心内容之一

核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子， 其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性 疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主 要对象

核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结
构―核苷酸的线性排列构成它的一级结构
在全自动DNA测序仪中应用广泛
Maxam-Gilber化学降解法


原理
一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得
到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱 基。因此生成4种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标 记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有 长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在



无需延伸反应及克隆
更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并 测序。 比较繁琐费时，过长序列有困难。

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（一）双脱氧链末端终止法测序原理

利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（polymerase
chain reaction, PCR）


据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相 同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP) ，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可
能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。
由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系 列长度不同的多核苷酸片段。
补BAC内的空洞，形成一条完整的BAC序列。然后参照物理图谱，将 相互关联、部分重叠的BAC克隆联成一个大的重叠群(Contig)。但一些
长串联的高度重复序列区域和克隆或测序所不能获得的区域，仍会存
在一些物理空洞（Physical Gap）。与Shot-gun方法相比较，Clone by Clone的技术难度较高，尤其是大片段基因组文库（如BAC文库）

蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位
－氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构 是了解蛋白质功能的基础
第一节 全自动DNA测序仪
DNA测序

核苷酸序列
早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确

20世纪80年代以后 ：DNA自动测序仪
Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确

单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增 管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳

多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同 扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳
多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一 扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳

（三）荧光标记DNA的检测原理

Template
dNTPs
Polymerase Terminator
Primer
A
G
C
T
双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T
T TGACCGGAT
C
C C A A C T
G
G
T T G
T
A
G
C
G C
T
G
T A
A
双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）

荧光染料 标记法
单色荧光标记法
荧光标记引物法
荧光标记终止底物法 荧光标记引物法 荧光标记终止底物法
多色荧光标记法
5
多色荧光标记法 -- 荧光标记引物法

定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端

一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光 染料颜色不同
测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等 按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C 、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电 泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底 物保持对应关系
…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA
TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…
T
双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）
A
C
G
双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）
双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）
（二）新生链的荧光标记原理

早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、
背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代

荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们
的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不 同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在DNA自动 测序中得到广泛应用
克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone)

全基因组散弹法(鸟枪法) (whole-genome shotgun method)

两种大规模基因组测序策略的比较
策 项 目 遗传背景 速度 费用 计算机性能 适用范围 代表测序物种 全基因组霰弹法 不需要 快 低 高（以全基因组为单 位进行拼接） 工作框架图 果蝇、水稻 略 逐步克隆法 需要（需构建精确的 物理图谱） 慢 高 低（以BAC为单位进 行拼接） 精细图 人、线虫



DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发 射出特征波长的荧光
代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射 到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算 机加以处理 整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信 号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度 为纵轴的信号数据的集合 经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结 果以一种清晰直观的图形显示出来
克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone)

是以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略。其 方法是先构建议染色体为单位的遗传图谱，再利用高覆盖率的大片断 基因组文库（BAC、YAC等）获得精细的物理图谱，选择合适的BAC
或YAC克隆进行亚克隆测序，用计算机拼装，通过引物步移等手段填
原DNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳
进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。

基本步骤
第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰； 第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯 键断裂； 第三步，比较G、A+G、C+T、C以及A>C各个泳道，可从测序
凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。
全基因组散弹法(鸟枪法) (whole-genome shotgun method)

Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法

都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某 一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度 的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片
段的分离和检测，从而获得DNA序列

双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故



多色荧光标记技术检测优点：

一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳
，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精 确度的影响，提高了测序精度

一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可
以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下
，加样的工作量也大大减少
DNA序列测定的策略
DNA聚合酶的催化 以目的DNA为模板 按照碱基互补配对原则 在引物的引导下 单核苷酸聚合形成新DNA链

普通的PCR反应体系中，加入的 核苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷三 磷酸（dATP，dCTP，dGTP， dTTP）
dNTP结构示意图

测序反应体系中，加入的核苷酸
单体为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP）



A
G
C
T
模板：T C C A T G A T 产物：A G AG G AGG T AGGT A AGGTA C AGGTAC T AGGTACT A
新生链的荧光标记原理
荧光标记引物法和荧光标记终止 底物法的异同点：


都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专 一对应关系 荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的 端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同 一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中， 而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔 荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一 时间完成 在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而 后者的四种反应可以在同一管中完成

测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多 数产物均为单链

反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪 中开始电泳
两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分 子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过 检测窗口 由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测 区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段
的精细物理图谱的构建是技术性极强的工作；并且测序费用和所需的
时间也相对较多。
人类基因组计划研究的主 要成果和进展表现在这 “四张图”
• 遗传图谱
又称为连锁图谱（linkage map）， 指基因或DNA标志在染色体上的相对 位置与遗传距离
•
物理图谱
以定位的DNA标记序列如STS作为路 标，以DNA实际长度即bp、kb、Mb 为图距的基因组图谱。