通则0512高效液相色谱法-(-2016年3月26日--)
高效液相色谱法
高效液相色谱法Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT高效液相色谱法1简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
色谱柱内径一般为～μm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。
1.1.1色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱法
高效液相色谱法一、原理高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，压入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
二、适用范围高效液相色谱法是一种分离分析方法，适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。
中国药典主要用于药品的含量测定、有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等。
三、仪器高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机（或兼有组分收集系统）等组成。
使用时应按仪器的说明书进行操作。
四、仪器的校正1.高效液相色谱仪的柱箱控温精度、基线噪声、基线漂移、灵敏度或检测限、线性范围的检定均按仪器说明书的技术要求进行校验，应符合规定。
2.以紫外-可见光检测器、荧光检测器、差示折光检测器为检测器的实验室通用液相色谱仪的检定，所用各种标准物质应使用经国家技术监督部门批准颁发的标准物质。
具体校正方法和主要技术指标见“高效液相色谱仪检测器的校验”。
3.泵的耐压试验4.泵流量设定值误差、流量稳定性误差的试验5.柱恒温箱温度设定值误差和控温稳定性误差的试验6.梯度准确度的试验7.定性定量重现性的试验五、对仪器的一般要求1.色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填充剂有硅胶（正相色谱）和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶（反相色谱）最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
2.药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
高效液相色谱法简介
高效液相色谱法简介“色谱”一词是由俄国科学家斯威特提出的。
色谱法是基于补充物质在相对运动物的两相之间分布时，物理或物理化学性质的微小的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。
发展与上世纪初，飞速发展于五十年代，有超过30位科学家家因为它而获得诺贝尔奖，其有自己的理论和研究方法，同时也有众多的应用领域。
色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。
柱色谱：柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。
常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。
收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。
柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。
薄层色谱：薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。
薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。
气相色谱：GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。
待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。
但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。
也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程1 定义及概述：1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求：2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备：3.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH 计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45µm适宜的滤膜滤过，用前脱气。
维生素B2片分析方法验证方案
一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
液相色谱法测定复方酮康唑乳膏中丙酸氯倍他索和酮康唑的含量方法对比
液相色谱法测定复方酮康唑乳膏中丙酸氯倍他索和酮康唑的含量方法对比摘要：目的：应用反相高效液相色谱法分离和测定复方酮康唑乳膏中丙酸氯倍他索和酮康唑的含量。
方法：该供试品经80℃水浴锅传热溶解，放冷至室温以无水乙醇定容至50mL量瓶，超声30min，滤纸过滤。
再经0.45μm滤过后采用Diamosilc18（2）为色谱柱，甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾【用40%氢氧化钠调PH 值为7.2】（70：30）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长239nm。
结果：丙酸氯倍他索和酮康唑的线性范围分别为0.01236～0.02884mg/mL和0.4799981～1.119995mg/mL，并与相应的峰面积呈线性关系，相关系数分别为r1=0.9999611和r2=0.99999583；测得丙酸氯倍他索和酮康唑的平均回收率分别为和%。
结论：该法可快速、灵敏、准确测定丙酸氯倍他索和酮康唑含量，并应用于日常样品复方酮康唑乳膏的分析检测。
关键词：反相高效液相法；丙酸氯被他索；酮康唑引言：复方酮康唑乳膏属于外用制剂，主要用于皮肤浅表真菌感染。
反相高效液相检测的主要成分分别为丙酸氯倍他索和酮康唑。
丙酸氯倍他索属外用强效皮质激素，作用迅速，具有较强的毛细管收缩作用及抗炎作用。
酮康唑属吡格类抗真菌药，对皮真菌、酵母菌、双相真菌和真菌纲有抑菌和杀菌作用。
目前，液相色谱仪法对乳膏制剂的测定已被广泛的应用。
但在实验中发现其丙酸氯倍他索和酮康总测定的方法过于繁琐、时间长和效率较慢。
因此，为了能快速、准确地测定复方酮康唑乳膏中的丙酸氯倍他索和酮康唑含量，本文建立其分析方法，并应用于日常样品复方酮康唑乳膏的液相分析。
1 仪器与试剂高效液相色谱仪（岛津企业管理（中国）有限公司,配备LC-16型二元溶剂输送泵、SPD-16型紫外-可见检测器、CTO-16型柱温箱、SIL-16自动进样器和labsolution5.83）、电子恒温水浴锅(型号HHS21-8)、十万分之一电子天平（岛津AUW220D）、PH计(雷磁PHS-3C)和超声仪（洁康PS-60A）丙酸氯倍他索对照品（系中国食品药品检定研究院公司提供，批号100302-201804），标准贮备液（8mg/ml）的制备：精密称取酮康唑标准品800mg，加无水乙醇溶解并定容至100ml量瓶，摇匀，备用。
高效液相色谱法
标题：高效液相色谱法分发部门：总经理室、质量技术部，行政部（存档）高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。
检测器最常用的为可变波长紫外光检测器或紫外一可见光检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备3.1 流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时按SOP“紫外分光光度法”进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节。
版药典黄曲霉毒素测定法
2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。
当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水 (40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测，（1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g，加入甲醇 100ml 使溶解，用水稀释至 1000ml 制成)，衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃；（2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。
混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于 均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
高效液相色谱法
高效液相色谱在蛋白质分离中的应用蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。
所以蛋白质的分离和检测一直是人们研究的热点。
Regnier认为：蛋白质是分子大小、形状和表面都不均一且各具特征的半僵硬分子。
这就赋予蛋白质分离和检测以不同的特点[1]。
目前，高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC) 技术广泛地应用于蛋白质的分离和检测，是由于具有许多优点：①与结晶、过滤等传统分离方法相比较，其分离效果更佳，且一次可得2 个以上的高纯度组分；②分析速度快，一般可以在30min内完成；③灵敏度高，可达ng或pg级，检出范围宽；④方法灵活机动，只需更换色谱柱和检测器，便可适用不同的分离要求；⑤样品回收简单。
近来，因为色谱泵的改进(可产生105MPa 的压力)而出现的特高效液相色谱(VHPLC)，使得蛋白质的分离更加快速高效，HPLC 技术日趋成熟，已成为分离和检测蛋白质的重要工具。
1 HPLC的基本原理HPLC由液体输送系统、进样系统、色谱柱和检测系统4部分所组成。
输液泵将流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，利用混合物中各物质在两相间分配系数、吸附力大小、带电性质，乃至分子量大小的差异而被分离，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离[2]。
各组分依照并依次随流动相流至检测器，将检测到的信号送至数据系统记录处理或保存。
随着HPLC技术的日趋成熟，它已成为分离和检测蛋白质的重要工具。
2 蛋白质的HPLC分离模式蛋白质在物理、化学及功能上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。
根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性，以及蛋白质的来源、实验要求等，可以选择不同的模式来分离目标蛋白。
2.1 反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography，RP- HPLC ）RP-HPLC在HPLC各种模式中的应用最为广泛，其特点是固定相的极性小于流动相的极性，蛋白质分子因其疏水性的不同，使其在两相中的分配不同而得以分离。
天麻钩藤颗粒药典标准
天麻钩藤颗粒药典标准天麻钩藤颗粒是一种中药制剂，主要用于治疗肝阳上亢所致的头痛、眩晕、耳鸣、眼花、震颤、失眠等症状。
其药典标准如下：1. 处方：天麻、钩藤、石决明、栀子、黄芩、牛膝、杜仲（盐制）、益母草、桑寄生、首乌藤、茯苓。
2. 制法：以上十一味，加水煎煮二次，每次1.5 小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为 1.30～1.35（80℃）的清膏。
取清膏 1 份，加蔗糖 2 份及糊精适量，制成颗粒，干燥，即得。
3. 性状：本品为黄棕色至棕色的颗粒；味甜、微苦。
4. 鉴别：（1）取本品5g，研细，加三氯甲烷20ml，超声处理20 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml 使溶解，作为供试品溶液。
另取天麻对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
再取天麻素对照品，加甲醇制成每1ml 含1mg 的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（7:3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
（2）取本品10g，研细，加硅藻土5g，拌匀，加石油醚（60～90℃）30ml，超声处理15 分钟，滤过，弃去石油醚液，残渣挥干溶剂，加甲醇30ml，超声处理15 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml 使溶解，作为供试品溶液。
另取栀子对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
再取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml 含1mg 的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10:7:2:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
版药典高效液相色谱法质谱法
品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。
调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。
2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
（1）色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。
由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间t R和峰宽（W）或半高峰宽（W h/2），按n=16（t R/W）2或 n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
t R、W、W h/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。
（2）分离度（R）用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。
可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。
通则0512高效液相色谱法-(-2016年3月26日--)
通则0512高效液相色谱法--)日26月3年-(-2016．18) 页药典四部60日） (26（ 2016年3月 0512高效液相色谱法通则2 /高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；18) 页60） (药典四部3（ 2016年月26日高效液相色谱法通则0512/ 3常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
．18) 页药典四部6026日） (（ 2016年3月 0512通则高效液相色谱法4 /温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）1.4.1.1 高效液相色谱法高效液相色谱法(high performance liquid chromatography;HPLC)是用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。
它具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点。
与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细(一般为10μm以下)、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏度检测器，大大提高了灵敏度。
紫外检测器最小检测限可达10-9g，而荧光检测器最小检测限可达10-12g。
与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；②可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高；③一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
1.4.1.2 高效液相色谱法主要类型按固定相的聚集状态包括液液色谱法(LLC)和液固色谱法(LSC)两大类。
按分离机制则包括分配色谱法(partition chromatography)、吸附色谱法(adsorption chromatography)、离子交换色谱法(ion exchange chromatography; IEC)和空间排阻色谱法(steric exclusion chromatography; SEC)四类基本类型色谱法；高效液相色谱法中最常见的是化学键合相色谱法及由其衍变和发展的离子抑制色谱法(ion suppression chromatography; ISC)和离子对色谱法(paired ion chromatography; PIC或ion pair chromatography; IPC)；除此之外，高效液相色谱法还包括许多与分离机制有关的色谱类型，如亲和色谱法(affinity chromatography; AC)、手性色谱法(chiral chromatography; CC)、胶束色谱法(micellar chromatography; MC)和电色谱法(electrochromatography; EC)等。
通则0512高效液相色谱法修订
通则0512高效液相色谱法修订通则0512高效液相色谱法修订1. 引言高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量分析方法，广泛应用于化学、医药、环境等领域。
为了保证该方法的准确性和可靠性，需要对通则0512进行修订。
2. 术语和定义2.1 高效液相色谱法（HPLC）：一种通过液相将待分离的物质分离并定量测定的方法。
2.2 色谱柱：用于分离物质的柱状装置。
2.3 流动相：用于推动样品在色谱柱中流动的溶剂。
3. 仪器设备3.1 色谱仪：应具备稳定的流速和压力控制功能。
3.2 注射器：应具备准确的进样容量和稳定的进样速度。
3.3 色谱柱：应具备较高的分离效率和较长的使用寿命。
4. 操作方法4.1 样品处理：样品应在适当的条件下进行前处理，以去除杂质和提高分离效果。
4.2 柱温控制：根据样品的特性和分离条件的要求，应在适当的温度下进行色谱分离。
4.3 流动相选择：根据待分离物质的性质和分离要求，选择合适的流动相组合。
4.4 进样方式：根据样品的性质和需求，选择适当的进样方式，确保进样量准确。
5. 结果计算和报告5.1 峰面积计算：根据峰的面积进行定量计算，应采用准确的积分算法。
5.2 结果修约：对测定结果应进行正确的修约，保证结果准确性和可靠性。
5.3 报告格式：测试结果应按规定的格式进行报告，包括样品名称、测定结果、仪器信息等。
6. 质量控制6.1 标准品的选择：选择适当的标准品进行方法验证和质量控制。
6.2 校准曲线的建立：根据标准品的浓度和峰面积数据建立校准曲线。
6.3 质控样品的测定：应进行质控样品的测定，以验证方法的准确性和可靠性。
7. 场所和安全7.1 实验场所：实验室应具备适当的设备和环境条件，确保实验的安全进行。
7.2 安全操作：操作人员应具备相应的实验操作知识，严格按照操作规程进行操作，确保人员的安全。
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高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。
不同的检测器，对流动相的要求不同。
紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。
蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。
（3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇－水系统和乙腈－水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统，流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。
用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否则导致柱效下降、色谱系统不稳定。
正相色谱系统的流动相：常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。
品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适应性试验的要求。
调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。
2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验：通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
色谱系统的适用性试验定义：按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
（1）色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。
由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间t R和峰宽（W）或半高峰宽（W h/2），按下式计算色谱柱的理论板数：n = 16（ t R / W）2 或 n = 5.54（ t R / W h/2 ）2t R、W、W h/2 可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。
（2）分离度（R）用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。
可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与与调整。
也可以通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰之间有较好的分离度。
除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。
分离度的计算公式为：式中 t R2为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间t R1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽（如图）。
当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。
（3）灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比（S/N）来表示。
通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。
定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。
系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。
（4）拖尾因子（T）用于评价色谱峰的对称性。
拖尾因子计算公式为：式中 W0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离（如图）。
以峰高作定量参数时，除另有规定外，T值应在0.95～1.05之间。
以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在各品种正文项下对拖尾因子作出规定。
（5）重复性用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0%。
3.测定法（1）内标法按各品种正文项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，各精密量取适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量进样，记录色谱图。
测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：式中 A S为内标物质的峰面积或峰高；A R为对照品的峰面积或峰高；c S为内标物质的浓度；c R为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：式中 A X为供试品的峰面积或峰高；c X为供试品的浓度；A's为内标物质的峰面积或峰高；c'S为内标物质的浓度；f为内标法校正因子。
采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。
（2）外标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积（或峰高），按下式计算含量：式中各符号意义同上。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。
（3）加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。
在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取待测物质对照品和参比物质对照品各适量，配制待测物校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测物的校正因子：校正因子=//A AB B c A c A式中c A为待测物的浓度；A A为待测物的峰面积或峰高；c B为参比物质的浓度；A B为参比物质的峰面积或峰高。
也可精密称（量）取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，进样，记录色谱图，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子。
校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。
需作校正计算的杂质，通常以主成分为参比，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液，作为对照溶液；进样，记录色谱图，必要时，调节纵坐标范围（以噪声水平可接受为限）使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%～25%。
除另有规定外，通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。
然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。
（4）不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若无法获得待测物质的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。
同上述（3）法配制对照溶液、进样调节纵坐标范围和计算峰面积的相对标准偏差后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。
除另有规定外，供试品的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算杂质含量。
（5）面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量进样，记录色谱图。
测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。
用于杂质检查时，由于仪器响应的线性限制，峰面积归一化法一般不宜用于微量杂质的检查。