分子克隆 PPT课件
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宿主细胞分为两种：原核细胞和真 核细胞。
⑴感受态细胞(competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导
细菌，使之处于易于吸收和容纳外 源DNA分子的状态，这时的细胞就 称为感受态细胞。
⑵转化过程：
①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即 用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速 生长的细胞，从而获得感受态细胞。
2.PCR反应过程：
1个PCR
20-40个 PCR循循环环
①94℃变性 ② 50-65℃退火 ③72℃延伸
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
①模板：单链或双链DNA
②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 3.PCR基本要素 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶
④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、 dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸 和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶， 称为DNA连接酶(DNA ligase)。 DNA连接酶主要有两种：
T4噬菌体DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶
3.基因克隆常用载体
目前用于基因克隆的载体种类繁多， 包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌 体载体、酵母菌质粒载体以及动、植 物病毒载体等
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因， 常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗 四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因 (Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体
的位点在抗药性基因之外，不导致抗药 性基因的插入失活，仍能编码抗药性基 因，这种含有重组子的转化细胞能够在 含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。
➢转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 ➢转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
➢转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
重组DNA的筛选与鉴定方法 平板筛选（插入失活、蓝白筛选）
1 2
3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
2.分子克隆中常用工具酶：
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
目的DNA DNA 重组 （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
⑸ 2535个循
环
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性）
⑵94℃
30’’
变性
⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火）
⑷72℃
n’(按1’扩增1kb计算）延伸
⑹72℃
3-7’
总的延伸（使产物延伸完整）
⑺4-10℃ 保存
3.与反转录相关的PCR扩增
TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)中， 能以DNA为模板，从结合在模板上的引物 出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式， 从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA 聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活
性，随着温度的降低，酶活性明显下降。 同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无 校正功能。
②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。
（二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA
的吸收。
④.然后将细胞接种于含相应抗生
素的培养基上，含有重组子的感受 态细Baidu Nhomakorabea将形成单菌落。
⑤. 挑选单菌落进行相应的筛选及 鉴定分析。
7.阳性重组子的筛选和鉴定
分子克隆
（一）基本概念:
• 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。
• 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分 子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分 子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获 得新得遗传特征的过程。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year)
pEGFP-N2-PPARγ
pEGFP-N2载 体片段 PPARγ基因 片段
pGL4-PPRE4-luc
PGL4-luc载体片段
PPRE4基因片段
接种
菌液
（1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。
（2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。
是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌 体内，这种内切酶可以分解外源性的 DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的 DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基 化所保护。
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß—内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
DNA限制性内切酶 DNA连接酶 100μl
4.目的基因的分离与制备
⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因
5.目的基因的体外重组
DNA分子的体外重组:是DNA分 子之间的连接过程。这是一个DNA 连接酶催化的生物化学反应 。
6.重组子导入宿主细胞
体外重组生成的重组子必须导入到 合适的宿主细胞中才能进行复制、 扩增和表达。
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录 逆转录酶 AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
⑴感受态细胞(competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导
细菌，使之处于易于吸收和容纳外 源DNA分子的状态，这时的细胞就 称为感受态细胞。
⑵转化过程：
①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即 用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速 生长的细胞，从而获得感受态细胞。
2.PCR反应过程：
1个PCR
20-40个 PCR循循环环
①94℃变性 ② 50-65℃退火 ③72℃延伸
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
①模板：单链或双链DNA
②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 3.PCR基本要素 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶
④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、 dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸 和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶， 称为DNA连接酶(DNA ligase)。 DNA连接酶主要有两种：
T4噬菌体DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶
3.基因克隆常用载体
目前用于基因克隆的载体种类繁多， 包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌 体载体、酵母菌质粒载体以及动、植 物病毒载体等
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因， 常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗 四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因 (Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体
的位点在抗药性基因之外，不导致抗药 性基因的插入失活，仍能编码抗药性基 因，这种含有重组子的转化细胞能够在 含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。
➢转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 ➢转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
➢转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
重组DNA的筛选与鉴定方法 平板筛选（插入失活、蓝白筛选）
1 2
3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
2.分子克隆中常用工具酶：
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
目的DNA DNA 重组 （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
⑸ 2535个循
环
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性）
⑵94℃
30’’
变性
⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火）
⑷72℃
n’(按1’扩增1kb计算）延伸
⑹72℃
3-7’
总的延伸（使产物延伸完整）
⑺4-10℃ 保存
3.与反转录相关的PCR扩增
TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)中， 能以DNA为模板，从结合在模板上的引物 出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式， 从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA 聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活
性，随着温度的降低，酶活性明显下降。 同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无 校正功能。
②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。
（二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA
的吸收。
④.然后将细胞接种于含相应抗生
素的培养基上，含有重组子的感受 态细Baidu Nhomakorabea将形成单菌落。
⑤. 挑选单菌落进行相应的筛选及 鉴定分析。
7.阳性重组子的筛选和鉴定
分子克隆
（一）基本概念:
• 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。
• 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分 子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分 子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获 得新得遗传特征的过程。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year)
pEGFP-N2-PPARγ
pEGFP-N2载 体片段 PPARγ基因 片段
pGL4-PPRE4-luc
PGL4-luc载体片段
PPRE4基因片段
接种
菌液
（1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。
（2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。
是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌 体内，这种内切酶可以分解外源性的 DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的 DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基 化所保护。
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß—内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
DNA限制性内切酶 DNA连接酶 100μl
4.目的基因的分离与制备
⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因
5.目的基因的体外重组
DNA分子的体外重组:是DNA分 子之间的连接过程。这是一个DNA 连接酶催化的生物化学反应 。
6.重组子导入宿主细胞
体外重组生成的重组子必须导入到 合适的宿主细胞中才能进行复制、 扩增和表达。
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录 逆转录酶 AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增