分子克隆 PPT课件
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植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
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质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
第三章 分子克隆的载体 ppt课件
✓ 选择标记基因selective marker gene 用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
24
•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
18
2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
34
35
二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
26
•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
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•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
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2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
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二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
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•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
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（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
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PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
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⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
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16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
分子克隆课件
分子克隆目录（一）.基本概念 (2)1.分子克隆： (2)2. Dalton，bp，nt (2)3.保护碱基 (2)4.T-A克隆： (2)5.RNA酶H活性： (2)6.载体： (2)7.质粒(plasmid) (2)8. F因子 (3)9. 位点偏爱（Site preference） (3)10.星星活性： (3)（二）分子克隆的基本过程 (3)1.概述 (3)2.分子克隆中常用工具酶 (3)3.基因克隆常用载体 (7)4.目的基因的分离与制备 (11)5.目的基因的体外重组 (11)6.重组子导入宿主细胞 (12)7.阳性重组子的筛选和鉴定 (13)（三）.单链丝状噬菌体 (14)1.M13 噬菌体的生物学 (14)2. M13 噬菌体载体 (17)3. M13 噬菌体载体的宿主菌 (18)4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 (17)5. 噬菌粒 (11)6. M13KO7 辅助噬菌体 (12)（一）.基本概念1.分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
2. Dalton，bp，nt道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。
碱基对（bp）＝base pair，1 kb就是1000个碱基对；nt＝核苷酸nucleotide 。
3.保护碱基在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
4.T-A克隆：利用Taq酶在PCR产物3‘末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR 产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3’末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。
《分子克隆实验设计》PPT课件
二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
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测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
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测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
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质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
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质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
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转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)
ligation independent cloning-分子克隆技术ppt课件
【参考】NusA技术：显著增强大肠杆菌表达可溶、活性蛋白：/experiment/430/465/;2BT Ecoli T7 ColE1-ori LICv1 transfer His6-tev-yORF AMP （全长4876bp）
NUSA标签
NusA融合蛋白表达系统于1999年由Davis发明，并在2000年由Novagen首先进 行商业化设计和开发，特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难 溶的重组表达蛋白的可溶性。
已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达， 而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中，用蛋白 酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性；相反，在另外许多 报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时，融合蛋白也同样具有活性。 NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结 果。
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且 操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7
《分子克隆》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选第六节重组dna分子的操作过程118限制性内切酶dna连接酶基因载体目的基因染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达119农业应用获得高产稳产和具有优良品质的农作物向日葵培育具有抗逆性的作物新品种抗虫抗病毒抗除草剂抗盐碱抗高温抗干旱第七节基因工程的应用培育体形巨大品质优良的动物超级小鼠超级绵羊超利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达获得人们需要的物质激素抗体酶食品工业开辟新是食品来源鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中畜牧养殖业120世界上第一只转基因动物能产药的奶牛转基因羊转基因鱼上面121本章结束本章结束此课件下载可自行编辑修改供参考
ppt课件
7
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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8
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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2.PCR反应过程：
1个PCR
20-40个 PCR循循环环
①94℃变性 ② 50-65℃退火 ③72℃延伸
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
①模板：单链或双链DNA
②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 3.PCR基本要素 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶
④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、 dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
宿主细胞分为两种：原核细胞和真 核细胞。
⑴感受态细胞(competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导
细菌，使之处于易于吸收和容纳外 源DNA分子的状态，这时的细胞就 称为感受态细胞。
⑵转化过程：
①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即 用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速 生长的细胞，从而获得感受态细胞。
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
目的DNA DNA 重组 （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
⑸ 2535个循
环
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性）
⑵94℃
30’’
变性
⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火）
⑷72℃
n’(按1’扩增1kb计算）延伸来自⑹72℃3-7’
总的延伸（使产物延伸完整）
⑺4-10℃ 保存
3.与反转录相关的PCR扩增
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year)
②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。
（二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA
的吸收。
④.然后将细胞接种于含相应抗生
素的培养基上，含有重组子的感受 态细菌将形成单菌落。
⑤. 挑选单菌落进行相应的筛选及 鉴定分析。
7.阳性重组子的筛选和鉴定
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸 和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶， 称为DNA连接酶(DNA ligase)。 DNA连接酶主要有两种：
T4噬菌体DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶
3.基因克隆常用载体
目前用于基因克隆的载体种类繁多， 包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌 体载体、酵母菌质粒载体以及动、植 物病毒载体等
pEGFP-N2-PPARγ
pEGFP-N2载 体片段 PPARγ基因 片段
pGL4-PPRE4-luc
PGL4-luc载体片段
PPRE4基因片段
接种
菌液
DNA限制性内切酶 DNA连接酶 100μl
4.目的基因的分离与制备
⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因
5.目的基因的体外重组
DNA分子的体外重组:是DNA分 子之间的连接过程。这是一个DNA 连接酶催化的生物化学反应 。
6.重组子导入宿主细胞
体外重组生成的重组子必须导入到 合适的宿主细胞中才能进行复制、 扩增和表达。
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß—内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因， 常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗 四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因 (Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体
的位点在抗药性基因之外，不导致抗药 性基因的插入失活，仍能编码抗药性基 因，这种含有重组子的转化细胞能够在 含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。
（1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。
（2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。
是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌 体内，这种内切酶可以分解外源性的 DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的 DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基 化所保护。
➢转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 ➢转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
➢转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
重组DNA的筛选与鉴定方法 平板筛选（插入失活、蓝白筛选）
1 2
3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
2.分子克隆中常用工具酶：
分子克隆
（一）基本概念:
• 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。
• 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分 子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分 子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获 得新得遗传特征的过程。
TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)中， 能以DNA为模板，从结合在模板上的引物 出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式， 从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA 聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活
性，随着温度的降低，酶活性明显下降。 同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无 校正功能。
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录 逆转录酶 AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增