PCR引物设计基本思路
如何更好的设计出PCR引物
PCR引物设计PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
pcr引物设计的基本理念 -回复
pcr引物设计的基本理念-回复PCR引物设计的基本理念PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列。
在PCR过程中，引物起着至关重要的作用，引物的设计质量直接影响PCR反应的效果。
因此，正确的PCR引物设计是成功进行PCR实验的基本前提。
本文将介绍PCR引物设计的基本理念，并分步回答如何设计合适的PCR 引物。
第一步：确认目标序列PCR实验通常是为了扩增某个特定的DNA序列，因此首先需要确定所需扩增的目标序列。
这个目标序列可以是基因片段、特定的DNA结构、启动子区域等。
在确认目标序列时，需要注意目标序列的长度和特异性，确保其能准确而特异地被引物扩增。
第二步：确定引物的长度引物通常由20到30个核苷酸组成，过短的引物可能不稳定，无法正确与模板DNA特异性结合，过长的引物则可能导致PCR产物过多的副产物。
因此，一般情况下引物长度约为18到24个核苷酸，适当选择引物长度有利于PCR的优化。
第三步：评估引物的理化性质引物的理化特性包括引物的GC含量、熔解温度（Tm）和自身引物结合能力。
高GC含量的引物更稳定，但也更难设计；Tm值表征了引物与模板DNA杂交的稳定性，通常理想的Tm值为50-65；自身引物结合能力的评估可以避免引物之间的非特异性结合。
多种软件可用于计算引物的理化性质，并为引物设计提供参考。
第四步：检查引物的特异性引物的特异性是PCR引物设计的关键点之一。
为了确保引物仅扩增目标序列，没有互补的序列存在于其他地方，可以使用引物设计软件进行特异性检查。
软件可以检查引物在基因组中的互补性和互补的副产物，以确保引物只扩增目标序列。
第五步：考虑引物间的配对引物在PCR反应中需要与目标序列的两端结合，因此两个引物（前向引物和反向引物）需要在目标序列上互补配对。
在设计引物时，需要确保两个引物的Tm值相近，以避免一个引物过早或过晚离开DNA链。
此外，还需要考虑引物之间的距离和可能的PCR产物长度，以确定引物的相对位置。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理PCR引物设计原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术手段之一。
而PCR引物设计是PCR技术成功实施的关键，合理的引物设计可以保证PCR反应的准确性和高效性。
本文将介绍PCR引物设计的原理和关键要点。
1. 引物的选择。
在PCR反应中，引物是起到扩增目的DNA片段的作用，因此引物的选择非常重要。
引物通常是由20-30个碱基组成的寡核苷酸，它们分别位于目的DNA片段的两端。
在选择引物时，需要注意以下几点：引物的长度，引物的长度通常在18-25个碱基之间，过长的引物可能会导致非特异性扩增，而过短的引物可能会导致特异性不足。
引物的碱基组成，引物的碱基组成需要符合一定的比例，其中GC含量在40%-60%之间为宜，这样可以保证引物在反应温度下的稳定性和特异性。
引物的特异性，引物需要与目的DNA片段的序列完全匹配，以确保扩增的特异性。
2. 引物的设计。
引物的设计通常是通过计算机软件进行，常用的软件有Primer3、Oligo等。
在设计引物时，需要输入目的DNA片段的序列，软件会根据一定的算法和规则自动生成合适的引物。
在引物设计过程中，需要注意以下几点：引物之间的配对，引物对之间的碱基配对需要避免形成二聚体或者内聚体，这样可以避免引物之间的相互作用影响PCR反应的效果。
引物的位置，引物需要位于目的DNA片段的两端，同时需要避开重复序列或者其他干扰因素，以确保扩增的特异性和准确性。
3. 引物的验证。
设计好引物之后，需要进行一定的验证工作，以确保引物的质量和特异性。
常用的验证方法包括：电泳分析，通过电泳分析引物扩增产物的大小和特异性，可以初步判断引物的质量和特异性。
序列分析，对引物扩增产物进行测序分析，可以确保引物扩增的是目的DNA 片段，而不是其他非特异性产物。
4. 引物的优化。
在实际应用中，有时候设计的引物可能并不能满足要求，需要进行一定的优化工作。
PCR引物设计基本思路
PCR引物设计基本思路PCR（聚合酶链反应）引物设计是一项非常重要的实验技术，它是基因分析和遗传工程等领域中广泛应用的技术手段之一、PCR引物设计的基本思路主要包括以下几个方面：1.确定目标序列：首先需要确定目标序列，即希望通过PCR扩增的DNA片段。
这个目标序列可以是基因、片段、启动子、转录因子结合位点等。
可以通过数据库或文献等途径获取目标序列的信息。
2.序列分析：对目标序列进行序列分析，包括序列长度、碱基组成、GC含量、特殊结构等。
这些信息有助于设计合适的引物和优化PCR反应条件。
3.引物设计：设计引物是PCR实验中的关键步骤。
引物是PCR扩增的起始和终止点，它们应该与目标序列的两个相对互补的部分序列相匹配。
引物设计时需要遵循以下几点原则：(1)引物长度：通常引物的长度为18-30个核苷酸，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物可能导致扩增效率低。
(2)引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物设计时需要考虑的一个重要参数，它表示引物在反应中解离的温度。
引物的Tm应该在50-65摄氏度之间，引物间的Tm值差异不应超过5摄氏度，以保证PCR反应的特异性。
(3)引物末端：引物的末端需要避免引入无法拓展的结构或序列，如酶切位点、重复结构等。
(4)引物互补性：引物之间的互补性需要避免，避免引物间形成二聚体或别构体，会影响PCR反应的特异性和效率。
(5)引物的特异性：引物应该与目标序列特异性地匹配，避免与其他DNA序列发生不特异性结合，可以通过引物序列的BLAST分析来评估引物的特异性。
(6)引物GC含量：引物的GC含量会影响引物的稳定性和Tm值，通常引物的GC含量应在40-60%之间。
4.引物修饰：在设计引物时还可以考虑引入一些修饰，如引物末端的磷酸化、荧光标记或化学修饰物等，用以增加PCR扩增产品的检测灵敏度或特异性。
5.设计控制实验：为了验证PCR扩增实验的结果，应设计相应的对照实验。
比如设计阳性对照，使用已知的模板DNA进行PCR扩增，用以验证PCR反应的可靠性和灵敏性。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。
PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。
因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。
以下是PCR引物设计的原理及原则。
一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。
引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。
较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。
引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。
此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。
引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。
4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。
引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。
二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。
在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。
2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。
3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。
4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于复制和扩增特定的DNA序列。
PCR引物是在PCR反应中使
用的两个短的单链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端
相互互补。
引物的设计是PCR的关键步骤之一。
引物设计的原理考虑了目标DNA序列的多个因素，包括长度、GC含量、互补性和特异性等。
以下是PCR引物设计的一般原理：
1. 引物长度：引物通常由18-30个碱基对组成，这个长度范围
有助于在PCR反应中实现高效的扩增。
过短的引物可能无法
准确地与目标DNA序列的特定区域结合，而过长的引物可能
导致PCR反应较低的产物产量。
2. GC含量：为了确保引物的稳定性和特异性结合，引物的
GC含量应在40-60%之间。
这是因为GC碱基对比AT碱基对
具有更高的结合能力，能够增加引物与目标DNA序列的互补性。
3. 互补性：PCR引物的两个引物应该互补，并形成稳定的引
物-模板DNA复合物。
引物之间的相互互补性可以通过计算引物序列之间的互补碱基数来评估，以确保引物之间没有太多的自身互补性或与其他引物的互补性。
4. 特异性：引物设计还需要确保引物与目标DNA序列具有高
度特异性的互补性。
这意味着引物与目标DNA序列的其他非
目标区域不应该有太多的互补性，以避免非特异性扩增。
引物设计可以使用基因组和引物设计软件来辅助完成。
这些软件基于目标DNA序列的输入，在计算上述因素的基础上，为PCR反应提供最佳的引物设计。
一旦引物设计完毕，它们可以被合成和纯化，并用于PCR扩增特定的DNA序列。
PCR引物的设计
PCR引物的设计PCR引物设计是体现PCR技术的关键步骤之一，对于PCR反应的成功与否起到决定性的作用。
引物设计的好坏直接影响PCR反应的特异性、灵敏度和效率。
合理设计的引物可以确保所需基因片段的特异扩增，并可以避免非特异扩增或PCR产物的假阳性结果。
下面将从引物设计的基本原则、引物的性质、引物设计的策略以及引物设计的软件工具等方面进行详细阐述。
引物设计的基本原则包括：正反引物要在目标DNA序列上配对，引物长度应在20-30个碱基对之间，GC含量应在40-60%，引物5'端不应含有GC二聚体，引物特异性要求至少在最末3个碱基对与DNA序列完全匹配。
此外，引物之间的距离和长度应与目标序列相关，以满足所需扩增的目的。
引物的性质是影响引物设计和PCR扩增结果的重要因素。
引物的性质包括引物的长度、GC含量、距离和Tm值等。
引物的长度通常在20-30个碱基对之间，以确保特异性和较高的扩增效率。
引物的GC含量应在40-60%，高GC含量可以增加引物与靶序列的结合性，但是过高或过低的GC含量都会影响引物的扩增效率和特异性。
引物之间的距离应在100-300碱基对之间，以确保引物的特异性和稳定性。
引物的Tm值应相似，通常要求差异在±2℃以内，以确保引物都在同一温度下反应。
引物设计的策略有多种。
其中一种常用的策略是根据目标基因的序列设计引物。
首先，从目标序列中选择一个适当的区域，要求该区域具有足够的变异度和特异性。
然后使用引物设计软件根据目标序列设计出一对近似匹配但不相交的引物。
此外，还可以使用引物设计软件目标序列周围的同源序列，多个同源序列用于设计同一基因的特异性引物。
另外一种常用的策略是通过引物库设计引物。
可以从已有的引物库中选择合适的引物，这些引物可能已经在实验中被证实具有优秀的扩增性能。
此外，还可以通过进行引物库筛选，使用特异性引物选择和筛除目标序列来设计引物。
引物设计的软件工具也是PCR引物设计的重要辅助工具。
PCR中如何设计引物
PCR中如何设计引物引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA片段。
设计合适的引物是PCR反应成功的关键。
本文将介绍PCR中如何设计引物的一般原则和方法。
引物设计的原则引物设计应遵循以下原则：1.引物长度：引物长度通常在18到30个碱基对之间，较短的引物可能导致非特异性扩增，而较长的引物则可能增加非特异性结合的风险。
2.Tm值：引物的熔解温度（Tm值）应该相似，通常要在50°C到65°C之间。
这样能够确保引物在PCR反应的温度范围内稳定结合到DNA模板上。
3.特异性：引物应与目标DNA序列保持高度特异性的碱基互补配对，以避免非特异性扩增。
可以使用序列比对软件来确保引物的特异性。
4.无自身互补和剩余互补：引物自身及与它们自身或其他引物的互补序列不应该存在，避免引物形成二聚体或非特异性扩增的可能性。
5.区段选择：引物的选择应基于目标DNA序列上的特定区段，通常位于基因的保守区域或功能位点上。
引物设计的步骤以下是PCR引物设计的一般步骤：步骤一：目标序列分析对于需要扩增的目标DNA序列，首先进行详细的分析。
包括确定目标DNA序列的起始和终止位置，以及预测目标DNA序列的理论大小。
步骤二：引物设计软件的选择选择一种引物设计软件，常见的有Primer3、Primer-BLAST等。
这些软件可以根据一些参数，如Tm值、引物长度等，自动生成一组可能的引物序列。
步骤三：引物选择与比对使用引物设计软件生成的引物序列，根据上述引物设计的原则，选择一组最佳的引物。
然后，使用引物设计软件进行序列比对，确保引物的特异性。
步骤四：引物合成购买选定的引物序列，并选择可靠的引物合成商进行合成。
结论合理设计的引物对PCR反应的成功非常重要。
在PCR中设计引物时，需要考虑引物长度、Tm值、特异性、互补性等原则，并通过引物设计软件进行分析和比对，最终选择最佳的引物序列。
这样可以确保PCR反应的特异性和可靠性。
《2024年PCR引物设计及软件使用技巧》范文
《PCR引物设计及软件使用技巧》篇一一、引言聚合酶链式反应（PCR）是现代生物学研究中常用的一种技术，而引物设计则是PCR反应成功的关键。
本文将详细介绍PCR 引物设计的基本原理、方法和注意事项，同时介绍几款常用的引物设计软件及其使用技巧。
二、PCR引物设计的基本原理和方法1. 引物设计的基本原理PCR引物是一段人工合成的寡核苷酸序列，作为PCR反应的起始点。
引物设计的核心思想是寻找合适的序列，使得引物能够有效地与模板DNA结合，从而在PCR反应中扩增出目标DNA 片段。
2. 引物设计的方法（1）选择合适的模板DNA：根据研究目的选择合适的模板DNA，确保其包含目标DNA片段。
（2）确定引物位置：根据目标DNA片段的序列信息，确定引物的位置。
通常，引物应位于目标DNA片段的两侧，且应避免位于重复序列或复杂区域。
（3）确定引物长度和碱基组成：引物的长度一般在18-25bp 之间，GC含量应适中，且碱基组成应具有随机性，以增加引物的特异性。
（4）避免形成二级结构：引物序列中应避免形成发夹结构、二聚体等二级结构，以免影响PCR反应的进行。
（5）设计内外引物：为了提高PCR反应的特异性和灵敏度，常需要设计内外两对引物。
内引物位于目标DNA片段内部，用于提高扩增的准确性；外引物则用于起始PCR反应。
三、PCR引物设计软件及使用技巧1. Oligo软件Oligo是一款常用的PCR引物设计软件，具有操作简便、功能强大等特点。
使用Oligo进行引物设计时，需注意以下几点：（1）输入目标DNA序列：将目标DNA序列导入Oligo软件中。
（2）设置参数：根据需要设置引物长度、GC含量、退火温度等参数。
（3）寻找引物：软件将自动在目标DNA序列中寻找符合条件的引物。
（4）评估引物：对找到的引物进行评估，包括二级结构预测、特异性分析等。
（5）保存并使用引物：将选定的引物保存并用于PCR反应。
2. Primer Premier 5软件Primer Premier 5是一款功能强大的引物设计软件，具有直观的操作界面和丰富的功能。
PCR反应引物设计方法及原理
PCR反应引物设计方法及原理（一）设计引物前应的准备工作：1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’1．两个酶切位点2．酶切位点的保护碱基3．5’端保护碱基4．3’端保护碱基5．引物配对区（三）设计引物所要考虑的问题1．酶切位点两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。
因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。
且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
2．酶的选择最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。
3．Tm的计算。
Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。
简单的计算公式可以用2+4的公式。
若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。
引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。
自己可以再估计一下。
如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。
PCR引物设计基本思路
PCR引物设计基本思路PCR（聚合酶链反应）引物设计是PCR实验中一个非常重要的步骤，其目的是选择特异性高、稳定性好的引物，以确保PCR反应的准确性和可重复性。
PCR引物分为前向引物和反向引物，它们是在目标DNA序列上的两个互补链的起始序列。
1.选择PCR引物的起始序列：引物的起始序列应位于目标DNA序列的两端，并且与目标序列完全互补。
通常情况下，引物的长度在18-25个碱基对之间，引物之间的距离应尽可能长（通常大于100bp），以提高PCR产物的长度。
2.引物的核苷酸组成和GC含量：引物的核苷酸组成应平衡，避免碱基偏好性或配对能力的影响。
GC 含量应在40-60%之间，以确保PCR反应的稳定性和特异性。
在设计引物时，可以根据每个引物的碱基组成和GC含量进行计算和优化。
3.避免引物的剪切位点和二次结构：在选择引物时，避免引物含有酶切位点和二次结构形成位点，以防止PCR反应中的非特异性扩增和引物降解。
此外，合适的盐浓度和温度条件也可以帮助消除二次结构的影响。
4.引物的特异性检查：在设计引物时，应使用引物设计软件或数据库对引物的特异性进行检查。
特异性检查可以通过比对引物序列与已知基因组数据库或其他相关序列数据库中的序列进行比对来实现。
特异性检查还可以检查引物是否有可能扩增非目标序列。
5.引物的交叉反应检查：如果PCR反应中存在多个引物，应考虑它们之间的交叉反应情况。
交叉反应可能导致非特异性扩增或产物重组，影响PCR反应的结果。
因此，在引物设计时，应尽量减少引物之间的相同区域，避免引物间的非特异性扩增。
6.引物的修饰和标记：总之，PCR引物设计是PCR实验中的重要一步，其设计的合理与否直接影响PCR实验结果的准确性和可重复性。
在引物设计过程中，需要考虑引物的特异性、起始序列、核苷酸组成和GC含量、引物间的交叉反应、避免引物的剪切位点和二次结构等因素，以确保PCR反应的成功进行。
PCR引物设计基本思路 优化
PCR引物设计基本思路1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS 149..153/gene="eryF"CDS 158..1372/gene="eryF"1 ggatcccgat cgtgtcggag g aa gaggcc a agtcgcgccg ccc cgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acga cgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t ga gcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctg ttcg ggcacagcat g ggcgcg ttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。
PCR引物设计方法和原理
实验试错法是一种相对原始的引物设计方法，通过实验尝试和调整来找到最佳的引物序列。该方法适用于实验条 件不明确或缺乏先验知识的情况，通过反复实验和调整来获得最佳的引物组合。虽然实验试错法效率较低，但对 于探索新领域和未知情况具有一定的价值。
04 pcr引物设计的原理
引物的特异性原理
引物的特异性原理是指引物与模板DNA的结合具有严格的特 异性和专一性。在PCR扩增过程中，引物与模板DNA的结合 位点是特定的，只有当引物的序列与模板DNA完全互补时， 引物才能与模板结合，进行有效的扩增。
为确保引物的特异性，通常要求引物在3'端具有18-20个与模 板DNA互补的序列，以形成稳定的氢键，同时要求引物之间 不存在互补性，以避免形成引物二聚体。
引物的长度和浓度原理
引物的长度和浓度是影响PCR扩增的重要因素。引物的长 度通常在18-30个核苷酸之间，过短可能无法有效结合模 板，过长则可能导致结合不稳定。
引物的浓度也需进行优化，过高可能导致非特异性结合，过 低则可能影响扩增效率。根据经验，一般将引物浓度设定在 0.1-0.5μM之间，具体浓度根据引物的长度和序列特性进行 适当调整。
引物的温度和平衡原理
引物的温度和平衡原理是指在PCR扩增过程中，需要选择合适的温度使引物与模板DNA结合，并保持引物与模板之间的平衡 状态。
详细描述
计算机辅助设计法利用专业的引物设计软件，根据输入的目标序列和实验条件，自动筛 选出符合要求的引物序列。该方法能够大大提高引物设计的效率和准确性，减少人工误
差和实验时间。常用的引物设计软件包括Primer3、Oligo等。
实验试错法
总结词
通过实验尝试和调整来找到最佳引物的方法，适用于未知情况和新领域。
PCR引物设计基本思路
PCR引物设计基本思路1. 根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区） ncbi网站查询RBS 149..153/gene="eryF"CDS 158..1372/gene="eryF"1 ggatcccgat cgtgtcggag g aa gaggcc a agtcgcgccgccc cgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t ga gcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctg ttcg ggcacagcat g ggcgcg ttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcggacggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。
2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。
PCR引物流程设计详解
PCR引物流程设计详解PCR（Polymerase Chain Reaction）引物流程设计是在进行PCR反应过程中引物的设计。
PCR反应是一种体外的DNA复制技术，可在短时间内扩增特定DNA序列。
引物在PCR反应中起到了至关重要的作用，因此设计合适的引物是成功进行PCR反应的关键。
1.目标序列选择：首先需要明确PCR反应的目标序列，即要扩增的特定DNA序列。
选定目标序列后，需要使用相应的软件分析该序列的特性，如GC含量、碱基组成、互补性等。
这些特性将有助于引物的设计和优化。
2. 引物长度：引物的长度通常在18-30bp之间。
较短的引物能提高PCR反应的特异性，但较长的引物能提高PCR反应的特异性和效率。
引物长度不宜超过30bp，以免在PCR反应过程中产生副产物。
3. 引物序列设计：PCR反应通常需要设计两个引物，一个称为前向引物（forward primer），另一个称为反向引物（reverse primer）。
两个引物应该在目标序列两侧的互补区域上设计，以确保引物能够结合在目标序列的两端。
为了提高特异性，引物的3'端应尽可能与目标序列互补，而5'端则可根据需要进行一定的修改，如添加限制性酶切位点、引入Tm值调整等。
4.引物Tm值计算：Tm值可用于估计引物与目标序列结合的稳定性。
Tm值是引物在PCR反应中的解链温度，通常在50-60°C之间。
使用软件计算引物的Tm值时需要考虑引物的长度、碱基组成和浓度等因素，确保引物的Tm值相近。
5.引物特异性检验：根据引物设计的序列，使用引物设计软件进行特异性检验，确保引物只结合在目标序列上而不结合在其他非特定序列上。
特异性检验可通过引物序列的BLAST分析和二聚体结构预测等方法进行。
6.引物修饰：在一些情况下，可以根据需要对引物进行特定的修饰，以增强PCR反应的效果。
常见的修饰方法包括添加引物标记（如荧光标记）、引物末端修饰（如磷酸化）等。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，避免与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应避免高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）避免二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应避免引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）避免引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应避免以上情况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要考虑，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以方便后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以采用多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简单易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
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PCR引物设计基本思路1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS 149..153/gene="eryF"CDS 158..1372/gene="eryF"1 ggatcccgat cgtgtcggag g aa gaggcc a agtcgcgccg ccc cgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t ga gcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctg ttcg ggcacagcat g ggcgcg ttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。
所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。
这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。
并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generuner分析）。
3.初步确定设计的引物长度。
一般为15～30bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。
如果扩增产物≤500bp，引物长度为16～18bp即可。
若扩增产物为4～5kb，引物最好不要少于24bp。
引物3’末端应含有所研究基因特异序列中的17～30bp。
4.5正向引物的设计：4.1 酶切位点的位置选择。
一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。
A：扩增的DNA用于表达时：（1）自身有启动子。
如：LOCUS VITVHBA 689 bp DNA linear BCT 26-APR-1993 DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.ACCESSION M30794 M31721 X13516VERSION M30794.1 GI:155319KEYWORDS hemoglobin; promoter region.SOURCE Vitreoscilla sp.ORGANISM Vitreoscilla sp.Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales;Neisseriaceae; Vitreoscilla.REFERENCE 1 (bases 42 to 689)AUTHORS Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coliJOURNAL Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)MEDLINE 89143453PUBMED 3067078REFERENCE 2 (bases 1 to 210)AUTHORS Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE Characterization of the oxygen-dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia coliJOURNAL J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)COMMENT Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.SWISS-PROT; P04252; BAHG$VITSP.FEATURES Location/Qualifierssource 1..689/organism="Vitreoscilla sp."/mol_type="genomic DNA"/db_xref="taxon:60"misc_signal 33..40/note="promoter 2"-35_signal 55..61-10_signal 73..79misc_signal 86..92/note="promoter 1"RBS 130..133/note="putative ribosome binding site; putative"CDS 142..582/note="hemoglobin"/codon_start=1/transl_table=11/protein_id="AAA27585.1"/db_xref="GI:155320"/translation="MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQELLGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVE"ORIGIN1 aagcttaca g gacgc tgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga61 ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga121 atgaactta a gga agaccct c atg ttagac cagcaaacca ttaacatcat caaagccact181 gttcctgtat tgaaggagca tggcgttacc attaccacga ctttttataa aaacttgttt241 gccaaacacc ctgaagtacg tcctttgttt gatatgggtc gccaagaatc tttggagcag301 cctaaggctt tggcgatgac ggtattggcg gcagcgcaaa acattgaaaa tttgccagct361 attttgcctg cggtcaaaaa aattgcagtc aaacattgtc aagcaggcgt ggcagcagcg421 cattatccga ttgtcggtca agaattgttg ggtgcgatta aagaagtatt gggcgatgcc481 gcaaccgatg acattttgga cgcgtggggc aaggcttatg gcgtgattgc agatgtgttt541 attcaagtgg aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaa t aa agtttcag gccgctttca601 ggacataaaa aacgcaccat aaggtggtct ttttacgtct gatatttaca cagcagtttg661 gctgttgcca aaacttggga caaatattg①扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。