KCM法转化大肠杆菌(我的方法)

大肠杆菌感受态

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。

本实验室一般用TSS 法制备感受态。

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

KCM法转化大肠杆菌(我的方法)

转化大肠杆菌（KCM法）
（1）试剂
TSS 配方：10% PEG8000；5% DMSO；20 mmol/L MgSO4或MgCl2；以上各成分溶于LB培养液中定容至100 mL，过滤除菌。

5×KCM溶液配方（配置数毫升分装成小管，-20 ℃保存，可反复冻融）：
0.5 M KCI，0.15 M CaCl2，0.25 M MgCl2
（2）大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备
A. 挑单菌落接于5 ml LB液体培养液过夜培养，按1%接种量接种于三角瓶中，培养菌至OD600 0.4～0.5；
B. 菌液冰浴1～2 min预冷细胞；
C. 用无菌预冷的离心管，4℃，5000 rpm离心5 min收集细胞；
D. 用20 ml冰浴的TSS重悬细胞；
E. 再次离心（5000 rpm离心5 min）沉淀细胞；
F. 用2.5ml预冷的TSS重悬细胞后分装至无菌Eppendorf管，-70℃保存。

（3）大肠杆菌转化
A. 将盛有感受态细胞的Eppendorf管置于冰上，使其缓慢融化；
B. 取一支Eppendorf管加入20 μl的5×KCM，5 μl 连接产物和75 μl ddH2O （质粒的话1-2μl，加ddH2O至80ul），混匀，放置冰上；
C. 向上述管中加入100 μl感受态细胞，混匀，冰上放置20 min；
D. 热激细胞（37℃5 min或42℃90S），加入1 ml 37℃预热的LB培养液，37℃震荡培养45min-1 h；
E. 取200 μl转化物在含有抗生素的LB培养基上涂板，剩余细胞离心沉淀后重悬，100 μl再次涂板，于37℃倒置培养过夜。

纯化大肠杆菌的方法

纯化大肠杆菌的方法
首先，准备工作是非常重要的。

在进行大肠杆菌的纯化前，需要准备好所需的实验器材和试剂，包括培养基、离心管、离心机、超声波破碎机等。

同时，要确保实验室环境的清洁和无菌操作。

其次，进行大肠杆菌的培养和收获。

首先将大肠杆菌接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。

培养时间和条件根据具体实验而定，一般需要在37摄氏度下培养12-16小时。

培养后，使用离心机将培养液进行离心，收集细菌沉淀。

接下来是大肠杆菌的破碎和裂解。

将收集到的细菌沉淀用适当的缓冲液进行悬浮，然后使用超声波破碎机进行破碎和裂解。

这一步是为了破坏细菌细胞壁，释放细胞内的目标蛋白。

然后进行蛋白的纯化和分离。

通过离心、过滤、层析等方法，将目标蛋白从混合物中分离出来，得到较纯的蛋白样品。

这一步需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等。

最后是对纯化后的蛋白进行检测和分析。

使用SDS-PAGE凝胶电
泳、Western blotting等方法对纯化后的蛋白进行检测和鉴定，确
保蛋白的纯度和活性。

通过以上步骤，可以得到较为纯净和活性较高的大肠杆菌蛋白
样品。

这种方法不仅适用于纯化大肠杆菌蛋白，也可以根据具体情
况进行相应的改进和优化，以满足不同实验的需求。

总之，纯化大肠杆菌的方法是一个复杂而又重要的过程，需要
仔细操作和科学设计。

只有通过严格的实验操作和精准的技术手段，才能得到理想的纯化效果。

希望本文介绍的方法对您有所帮助，谢
谢阅读。

RACE步骤

1）RNA 提取采用试剂Trizol Reagent (购自invitrogen 公司)2）氯仿；异丙醇；70 % 乙醇；0.1 % DEPC；DEPC 处理的超纯水(2) 聚合酶链式反应（PCR）、核酸电泳试剂1) Tris-硼酸储存（5×TBE）缓冲液：54g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶于1000 ml 水。

2) 溴化乙啶（10 mg/ml）:100 ml 水中加入1 g 溴化乙啶，磁力搅拌数小时至溶解，避光保存3）点样缓冲液Loading buffer(10×): 0.25 %溴酚蓝，40 %甘油。

4）Ex Taq DNA Polymerase（TaKaRa），琼脂糖DNA 胶回收试剂盒(北京天根生物公司)5）DNA Makers：DL2000，DNA Maker Ⅲ6) 特异引物（上海生工合成）7) 5'RACE 试剂盒购置大连宝生物工程有限公司(3) 目的基因鉴定、培养基及培养液1）液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0g，调pH 至7.0，定容至1L，高压灭菌。

2）固体培养基：加琼脂15g/L，高压灭菌。

3）氨苄50μg/mL；IPTG 25 mg/mL；X-Gal 25 mg/mL 溶于DMF 中4）5×KCM 溶液3.73 g KCl，2.21 g CaCl2，5.08 g MgCl2，定容至100 ml。

总RNA 的提取实验用品的处理：离心管、枪头等塑料制品用0.1 % DEPC于37 ℃浸泡2h，和0.1 %的DEPC 水高压灭菌30min，研体、剪刀、镊子、容量瓶等180℃烘烤6h。

1）称取100 mg小麦叶片，液氮研磨至粉末状，迅速转入含1mL Trizol的1.5 ml离心管中，混匀，室温下静置5 min。

2）加0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 sec，20 ℃静置3 min。

简述大肠杆菌转化法的原理

简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。

其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。

质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。

2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。

这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。

3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。

这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。

4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。

5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。

这些菌落会在培养基中形成可见的生长。

通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。

这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。

质粒DNA转化大肠杆

3）转化操作：受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。对于Ca2+ 诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12-24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。 4）试剂纯度与器皿的洁净度：转化过程中，所用的试剂（CaCl2，甘油，水）必须是高纯度的。所用器皿尽量酸洗后乙醇洗涤，超声后用超纯水淋洗。
1970年Mandel和Higa发现用CaCl2 处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，Cohen等人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序为： 1）将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态； 2）此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；
（6）弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用30ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液轻轻混匀洗涤一次。（7）4℃，6 000转/分离心10min。（8）弃尽上清液，将沉淀用1ml预冷的CaCl2-甘油混合液重新轻轻悬浮。（ 9 ）200µl/ 管分装至预冷的 EP管中（冰水浴中操作），迅速置–80℃冰箱冷冻保藏。
3. 试剂与器材 1. 材料：p1300-TaSTK质粒、DH5a大肠杆菌感受态菌液 2. 试剂：LB液体培养基、含有100µg/ml Kan抗生素的LB固体培养基、20mg/ml IPTG, 20mg/ml X-Gal(二甲基甲酰胺DMF配制，避光保存) 3. 仪器：摇床、培养箱、超净工作台、超低温冰箱、水浴锅 4. 其他：涂棒、微量移液器

大肠转化步骤

细菌（大肠）转化一．实验目的1 ．以pGLO 质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。

2 ．验证DNA 是遗传物质，加深对中心法则的理解。

二．实验原理转化（transformation ）是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。

目前常用的转化方法有CaCl 2 法( 化学转化法) 和电转化法。

本实验是用pGLO 细菌转化试剂盒中提供的pGLO 质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl 2 转化法。

pGLO 质粒：pGLO 质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白(GFP) 的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。

此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。

转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。

三．实验材料受体菌：E.coli K12 HB101质粒：pGLO plasmid转化液（CaCl2 ）氨苄青霉素（amp ）阿拉伯糖（ara ）培养基：固体LB 、液体LB接种环、移液器等四．实验步骤1. 准备平板：每组：1 块LB 平板，2 块LB/amp 平板，1 块LB/amp/ara 平板2. 准备感受态细胞：用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。

3. 活化受体细胞：挑取1 环E.coli K12 HB101 菌液，于LB 培养基上37 ℃活化16-24h 。

4. 转化：。

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。

实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。

二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。

在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。

三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。

将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。

若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。

四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。

目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。

大肠杆菌的转化、扩增及一些基础的实验前准备

A．大肠杆菌的转化（热击法）1. 从-80℃超低温冰柜中取出一管感受态大肠菌（BL21），立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

从冰箱中拿出含目标基因片段的质粒一管，也插入冰中，冰浴5~10 min，待融化。

2. 往上述大肠菌中加入5 μl(一般大肠菌50ul,质粒5ul)连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。

同时，将恒温水浴的温度调到42℃。

顺便把质粒管放回原处。

(移液器枪头可能要用贴有白色标的那种).(有时大肠菌为10UL，质粒1~2UL。

比例在10:1左右)3. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5~10 min。

这样质粒就被导入了。

4. 在超净工作台中向上述引入质粒的大肠杆菌管中加入500 μl LB培养液（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床弹簧架上37℃震荡0.5h。

5. 同时将含合适抗菌素（AMP）的固体LB平板培养皿，放入烘箱37℃下烘0.5h。

这样可以防止大肠菌因为较大温差而死亡。

6. 在超净工作台中取上述转化混合液（即导入质粒的大肠菌）150 μl，滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过（防止杂菌）的玻璃涂布棒涂布均匀，注意涂布棒不可烧后直接涂，要降温。

将多余的转化混合液倒入废液缸，管子投入指定地点。

7. 倒置培养基，在培养皿上做上标记，放置在37℃恒温培养箱中培养箱过夜（约12-15小时）。

9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，整理。

B．大肠杆菌扩增用的“营养肉汤培养液”的配制酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，NaOH溶液等按照实验室写的来，加1L超净水。

配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子，然后120度20分钟灭菌。

写上标签。

有些需要灭菌的器材都可以在此时灭菌。

C1．大肠杆菌扩增（在2*TY培养基上）1.实验前先对双手消毒。

实验时也要注意对器材在火上烧一下如镊子，移液器，试管口，试管盖，使用前后的竹签。

大肠杆菌转化实验(热击法)——【感受态细胞的制备及其转化技术】

大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。

1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。

4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。

1（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

去乙酰组蛋白

组蛋白去乙酰化酶Ⅰ的ShRNA真核表达质粒构建Construction of shRNA eucharyotic expression plasmid targeted HDACⅠ姜雪莲1、李潇婷1、胡倩倩1、郭志义2（1.河北联合大学生命科学院０８生物和０９生物河北唐山 0630002. 指导教师河北联合大学医学实验研究中心）摘要[目的] 构建HDACⅠ的shRNA真核表达质粒。

[方法] 应用逆转录PCR方法，检测肺癌A549细胞系HDACⅠ的表达情况。

设计寡聚核苷酸片段，应用分子生物学技术构建HDACⅠ的shRNA表达质粒，测序确认。

通过转染A549细胞，应用实时荧光定量逆转录PCR方法检测其抑制效果。

[结果] A549细胞HDACⅠ有表达。

构建四个shRNA 质粒，测序正确。

抑制效率分别为：76%, 88%, 76%, 90%。

[结论] 我们构建了高效HDACⅠ的ShRNA表达质粒。

关键词：组蛋白去乙酰化酶Ⅰ；shRNA；质粒Abstract: [Objective] To construct shRNA eucharyotic expression plasmid targeted HDACⅠ. [Methods] the abundance of HDACⅠ mRNA level was detected by RT-PCR in A549 cells. The plasmid was constructed by molecular techniques with the designed oligonucleotide. The plasmid was identified by endoenzyme digestion and PCR, confirmed by DNA sequencing. The inhibitory efficiency was validated by RealTime RT-PCR. [Results]there are expression of HDACⅠmRNA in A549 cell line. Endoenzyme digestion and PCR analysis showed that the patterns and size length of the fragment met the design expectation. The sequence was confirmed by DNA sequencing. RealTime RT-PCR analysis showed that the inhibitory efficiency were76%, 88%, 76%, 90% .[Conclusion] The shRNA plasmids targeted HDACⅠwere constructed successfully.Key words: HDACⅠ; shRNA; plasmid组蛋白乙酰化修饰是染色质重塑机制之一，在真核基因表达调控中起着重要作用[1]。

大肠杆菌的转化

大肠杆菌转化
1.准备冰，照超净台。

2.感受态放冰上融化，取2ul质粒加到100ul感受态中，混匀。

【如果是转构建
好的载体，取5ul载体到25ul买的感受态中】
3.冰浴30min,此时打开水浴锅
4.42℃水浴热激45s 。

(勿振动)
5.冰浴1min 。

(勿振动)
6.加800ul液体SOC，轻轻混匀。

37℃摇床（斜放），200rpm,1h
7.重悬（用枪轻轻吹打混匀），吸取200ul加入已加相应抗生素的平板中，玻璃
珠涂板。

8.37℃倒置培养14h—16h
注：如果是转化构建好的载体，第二步取5ul的质粒加到25ul买的感受态中。

第六步加200ul液体SOC。

第七步将所有菌液涂到平板上。

其他步骤同上。

挑菌
1.液体LB培养基中加抗生素，每个三角瓶/试管中加10ml培养基。

2.用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，放入三角瓶/试管中。

3.封口,37℃摇床，200rpm过夜。

大肠杆菌发酵生产糖化酶分离纯化工艺流程

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