大肠杆菌感受态细胞的转化方法
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
20008
分 子实
1
生验
0
物
学
注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
2
20008
1
0
分 子实 生验
物 学
转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
2
20008
实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
热激法转化大肠杆菌感受态细胞流程
热激法转化大肠杆菌感受态细胞流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
PART A 分子生物学实验实验五大肠杆菌感受态细胞的制备和转化内容提要采用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞，并用质粒pUC19进行转化，利用抗生素来筛选转化子。
本实验要求：1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。
2、能够计算感受态细胞的转化效率。
原理将质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞内的过程叫转化(Transformation)。
受体细胞经过一系列处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许质粒分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
与电击法等其它方法相比，CaCl2制备法不但简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，若制备出的感受态细胞暂时不用时，即可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存半年以上，因此CaCl2法是分子生物学研究中最受欢迎的方法。
本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞，采用CaCl2法制备感受态细胞，并将pUC19 质粒转化至感受态细胞。
进入受体细胞的质粒通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC19，则在含Amp 的培养基上不能生长。
能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）说明已导入了pUC19。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切、测序等进一步鉴定。
一、主要仪器、材料和试剂1. 仪器移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
2. 实验材料大肠杆菌E.coli DH5a 菌株，pUC19经实验1提取。
3. 试剂⑴. 1 mol/L CaCl217.9g CaCl2·2H2O溶于100ml水中。
⑵. 100mg/ml 氨苄青霉素（ampicillin）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。
传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。
本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。
二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。
（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。
（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。
（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。
（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。
（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。
（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。
（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。
（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。
（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。
为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。
（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin Quan-Wen Lab at XMU)一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中，可以准备两管。
37︒C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。
第二天：1．取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 = 0,03-0,05。
37︒C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.4时，停止培养。
2．将菌液在冰上预冷30分钟。
同时，开启离心机，预冷至4︒C。
3．随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中，4︒C，4000rpm离心15分钟。
4．弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。
4︒C，4000rpm离心15分钟。
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。
4︒C，4000rpm，离心15分钟。
6．弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。
4︒C, 4000rpm, 离心10min。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml 10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。
8．将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70︒C冰箱中保存。
9．检测转化效率：取100μl新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10μl (1%)和100μl (10%)涂板，估测转化效率。
大肠杆菌感受态细胞制备与转化
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
实验原理：带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
细胞在低温，低渗CaCl2（0.1M）作用下，会发生膨胀，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过。
实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2 (0.1M)等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等实验步骤：1、取-70℃冰冻大肠杆菌DH5α菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。
2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
3、次日取菌液30 μL接种至含有3 ml LB培养基的试管中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。
4、当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试管取出放置冰上10~15分钟。
在无菌条件下，取1ml菌液装入1.5ml离心管中。
4℃,5000rpm离心5min。
弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
4、当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试管取出放置冰上10~15分钟。
在无菌条件下，取1ml菌液装入1.5ml离心管中。
4℃,5000rpm离心5min。
弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
制备感受态1、加200 μL冰预冷的0.1M CaCl2到离心管中，振荡混匀，使菌体悬浮，冰浴30min。
2、4℃，5000 rpm离心5分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上，吸干残留液体。
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。
三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
大肠杆菌感受态制备及转化
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
1
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
2
对照组
实验结果
B
A
C
写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
实验原理
实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pCT74质粒共保温，实现转化。 pCT74质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
4000rpm离心5 min,弃上清
加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
感受态细胞制备
实验步骤
实验步骤
转化 9． 取目的DNA（稀释好的pCT74质粒50μl）加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10． 于42℃水浴90S 11． 冰上放置2min 12． 加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 13． 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14． 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果
实验一 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化
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neb10beta 化转方法
neb10beta 化转方法
NEB 10-beta感受态细胞是一种大肠杆菌感受态细胞，可用于DNA 的化学转化。
以下是使用NEB 10-beta感受态细胞进行转化的一般步骤：
1.将NEB 10-beta感受态细胞保存在-70℃的冰箱中，使用
前需要将感受态细胞恢复到室温。
2.将适量的DNA片段和适量的NEB 10-beta感受态细胞混
合在一起，轻轻旋转混匀。
3.将混合物在冰上放置30分钟，使DNA充分进入感受态
细胞。
4.将混合物转移到预热的电击杯中，进行电击转化。
具体
的电击参数需要根据实验条件进行调整。
5.在电击转化后，将混合物迅速转移到冰上放置5分钟，
以降低细胞的温度并促进DNA的整合。
6.在冰上放置5分钟后，将混合物转移到选择性培养基上，
培养基中含有适合大肠杆菌生长的条件和抗生素。
7.将培养基在37℃的恒温培养箱中培养1-2小时，使细胞
生长并表达所需的蛋白质。
8.培养结束后，挑选单克隆菌落进行进一步鉴定和筛选。
需要注意的是，以上步骤仅供参考，具体的操作需要根据实验条件进行调整。
此外，在使用感受态细胞进行转化时，需要注意防止污
染和交叉污染，确保实验结果的准确性和可靠性。
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一、概述
大肠杆菌是一种常见的微生物细菌，广泛存在于自然界中。
而大肠杆菌感受态细胞的转化方法，是一项重要的研究课题。
本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法，以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。
二、大肠杆菌感受态细胞的定义
大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。
在细菌转化的过程中，外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内，并且在某种条件下，使其获得新的遗传信息，从而表现出与原有菌株不同的性状。
三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法
1. 热激转化方法
热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养，利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛，使外源DNA能够顺利进入细胞内。
然后在低温下将其复性，并引起DNA与细胞的内合作用，最终实现外源DNA的转化。
2. 电穿孔法
电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中，在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂，从而使外源DNA顺利进入细胞内，实现转化。
3. 化学法
化学法是使用化学物质（如钙离子、聚乙二醇等）处理大肠杆菌感受
态细胞，使细胞膜通透性提高，从而使外源DNA得以顺利进入细胞内，实现转化。
4. 冷冻法
冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养，利用冰冻条件下细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内，最终实现转化。
5. 基因枪法
基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式，直接送入大肠杆菌感受态细胞内，从而实现转化。
6. 瞬时脉冲法
瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内，通过瞬时压力使细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内，实现转化。
四、大肠杆菌感受态细胞的转化效率影响因素
1. 外源DNA的浓度
外源DNA的浓度对大肠杆菌感受态细胞的转化效率有重要影响。
过高
或者过低的外源DNA浓度都会降低转化效率。
2. 细胞状态
大肠杆菌感受态细胞的生长状态和健康程度对转化效率有直接影响。
生长状态良好、健康的细胞转化效率较高。
3. 质粒DNA的来源
质粒DNA的来源也会对转化效率有一定的影响。
不同来源的质粒DNA可能对大肠杆菌感受态细胞的转化效率产生影响。
4. 转化条件的选择
不同的转化条件（如温度、压力、时间等）选择也会对大肠杆菌感受
态细胞的转化效率产生影响。
五、大肠杆菌感受态细胞的转化应用
1. 合成生物学
大肠杆菌感受态细胞的转化在合成生物学领域有广泛应用，可以用于
构建和调控基因电路、生物传感器的构建等。
2. 蛋白表达
大肠杆菌感受态细胞的转化可以用于蛋白表达系统的构建和蛋白表达。
3. 基因工程
大肠杆菌感受态细胞的转化可以用于基因工程领域中对细菌进行突变、重组、改造等研究应用。
六、总结
大肠杆菌感受态细胞的转化方法是目前微生物学领域的研究热点之一，不同的转化方法具有各自特点和适用范围。
通过合理选择转化方法和
控制影响因素，可以有效提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率，为相
关应用研究提供有力支持。
希望本文的内容能够为相关学者和研究人
员在大肠杆菌感受态细胞的转化方法领域提供参考和帮助。