大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞概念重组DNA分子体外构建完成后必需导入特定宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表示外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍现象，在细胞间转化是否发生，首先取决于供体菌和受体菌二者在进化过程中亲缘关系，其次还和受体菌是否处于一个感受状态有着很大关系。
所谓感受态：即指受体或宿主最易接收外源DNA片段并实现其转化一个生理状态，是由受体菌遗传性状所决定同时也受菌龄、外界环境因子影响。
cAMP能够使感受态水平提升一万倍，而Ca2+也可大大促进转化作用。
细胞感受态通常出现在对数生长久新鲜幼嫩细胞是制备感受态细胞和进行成功转化关键。
制备出感受态细胞临时不用时可加入占总体积15%无菌甘油或-70℃保留使用期6个月。
2、转化概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建重组DNA导入细菌体内使之取得新遗传特征一个方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域基础试验技术之一。
受体细胞经过部分特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜通透性发生改变，成为能许可外源DNA分子经过感受态细胞。
进入细胞DNA分子经过复制、表示实现遗传信息转移，使受体细胞出现新遗传性状。
大肠杆菌转化常见化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发觉。
其原理是细菌处于0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化细菌中重组子中基因得到表示，在选择性培养基平板上可选出所需转化子。
Ca2+处理感受态细胞其转化率通常能达成5×106~2×107转化子/ug质粒DNA能够满足通常基因克隆试验。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
分子生物学：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
可使用。也可加入总体积15％的甘油70℃长期 保存
实验步骤
转化 ➢ 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放
置30min ➢ 42℃水浴90S，迅速放回冰上放置2min ➢ 加入300μlLB液体培养基于37 ℃,180rpm培养1h ➢ 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 ➢ 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养14-18个小时，
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验Байду номын сангаас的
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞的实验技术。 2、掌握热激转化实验技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指外 源DNA导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗 溶液中，菌体细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择 性培养基中保温复苏一段时间，促使在转化过程中获得的新的 表型（如Amp）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨 苄青霉素的选择性培养基上，进行转化结果的筛选。
此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/
涂板菌液体积 转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）＝转化子总数/质粒
DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体
积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数/感受态细胞总数
然后观察结果
实验步骤
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它 操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌化转感受态制备
大肠杆菌化转感受态制备大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，具有广泛的生物学功能和应用价值。
化转感受态制备是一种常用的方法，通过改变大肠杆菌的遗传物质，使其表达特定的转基因产物。
本文将介绍大肠杆菌化转感受态制备的原理、方法以及应用。
一、大肠杆菌化转感受态制备的原理大肠杆菌化转感受态制备是利用大肠杆菌的自然特性和遗传工程技术，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并使其稳定表达。
大肠杆菌细胞通过自身的DNA复制和转录机制，将外源DNA整合到自身的基因组中，从而使外源基因在大肠杆菌中得以表达。
1. 质粒转化法：将质粒DNA与大肠杆菌细胞一起处理，使质粒DNA 进入大肠杆菌细胞内，并通过质粒DNA上的选择标记基因筛选转化成功的细胞。
2. 噬菌体转染法：利用噬菌体作为载体，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并通过噬菌体的复制和感染机制，使外源DNA稳定表达。
3. 电穿孔法：利用高压电脉冲使大肠杆菌细胞膜发生破裂，外源DNA得以进入细胞内，并通过细胞自身的修复机制，使外源DNA稳定表达。
4. 钙离子转化法：利用钙离子与外源DNA形成复合物，通过渗透作用使其进入大肠杆菌细胞内，并通过细胞自身的代谢机制使外源DNA稳定表达。
三、大肠杆菌化转感受态制备的应用1. 蛋白表达：通过将目的基因导入大肠杆菌细胞内，使其表达目的蛋白，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
2. DNA克隆：利用大肠杆菌的高效复制和转录机制，将目的DNA片段插入质粒中，并通过质粒在大肠杆菌中的复制和传递，实现DNA 的克隆和扩增。
3. 突变分析：通过外源DNA的插入、缺失或替换，研究大肠杆菌基因的功能和调控机制，为进一步研究生物学问题提供重要工具。
4. 基因敲除和敲入：通过将外源DNA的特定片段插入大肠杆菌基因组中，实现对目的基因的敲除或敲入，研究基因功能和调控网络。
5. 抗生素筛选：利用大肠杆菌对抗生素的敏感性，通过将目的基因导入大肠杆菌中，筛选抗生素抗性基因。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
分子生物学实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验大肠杆菌感受态细胞的制备实验原理：转化是将异源DNA分子引入另一细胞系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。
受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，经过CaCl2等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
经过转化的细胞在选择性培养基上，可以筛选出转化体，即带有外源DNA分子的受体细胞。
实验目的：学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。
实验内容：JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂大肠杆菌JM109或DH5α，LB固体/液体培养基，0.1mol/LCaCl2溶液。
二、主要设备台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液器、恒温摇床，等。
三实验方法1.受体菌的培养从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养（300rpm）12小时左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以1：100~1：50（V：V）的比例接种于100ml LB液体培养基，37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35～0.5左右。
2.感受态细胞的制备（1）在无菌条件下，将培养液转入预冷的1.5ml离心管中，冰上放置20min，使其停止生长。
（2）4℃下，4000rpm离心5min，弃去上清。
（3）加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000离心5min。
（4）弃去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，贮存于4℃备用。
或贮存于-70℃（加10-30%的甘油），可保存半年。
四.注意事项：1、整个实验都应在无菌的条件下操作。
2、整个操作均在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低。
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
E.coli DH5a
37℃振荡
2mL LB 过夜
菌液
1mL
100mlLB
37℃振荡 2-3hrs
菌液
无菌 预冷
弃上清 4℃,4100r/min 收集细胞
10min
冰浴 10min
50mL聚丙烯管
倒
mL 1min
置 30
0.1M CaCl2
重复2次
2ml 预冷 0.1M CaCl2
重悬细胞
悬浮细胞
200ul 1.5mlEP
分装
800μl ＬＢ ４２℃,９０s 水浴 １０μl 40ng DNA 转化
冰浴２min
混匀、冰浴３０min
３７℃ ４５min
涂平板(Ampr)３７℃,１２～１６hrs 观察结果
冻存-70℃
2 转化
实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因
的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含 重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在 生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目 的基因的产物，这是PCR体外扩增DNA所不能 替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同 目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生 产和生物发酵等领域。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组 子导入细菌的过程。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基— 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌 放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使 在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到 表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉 素的选择性培养基上。
三、实验步骤
1．从大肠杆菌DH5α 的平板上挑取一个单菌落接于
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
铵、氯化钠、硫酸钠等 .盐析时 ,溶液的 pH 在蛋白质的等电点处效果最好 .凡能与水以任意比
例混合的有机溶剂 ,如乙醇、甲醇、丙酮等 ,均可引起蛋白质沉淀 .2、电泳法 ：蛋白质分子在
高于或低于其 pI 的溶液中带净的负或正电荷 ,因此在电场中可以移动 .电泳迁移率的大小主要
取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小 .3、透析法 ：利用透析袋膜的超滤性质 ,可将大分
电泳 ,约 1h 后 ,loading buffer 条带跑到底 ,便可停止 . ⑸考马斯亮蓝染色 ① 将电泳后的 PAGE 胶取下放入容器中 ,加入 50ml 双蒸水或去离子 水 ,加热至沸腾后停止 ,
继续在脱色摇床上摇动 5min, 弃去水溶液 .
② 加上染色液 ,以浸没胶面为准 ,加热沸腾后保持状态 30-60s, 停止加热后继续在脱色摇床
-70 ℃冰箱保存。）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从 -70 ℃或 -20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 过多次转接， 及贮存在 4 ℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
经 5×107
个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的
DTT 3 μ l, urea 8M 18ml. 其余 buffer 均用 urea buffer 来配置 .
9.SDS-PAGE 的鉴定 ⑴配胶 (根据此蛋白的大小（ 55KD ） ,配置 12% 的胶 )
下 层 胶 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 层 胶 缓 冲 液 PH8.8
分子蛋白质不能进入孔内而径直流出 ,因此不同大小的蛋白质得以分离 .6、超速离心： 利用物 质密度的不同 ,经超速离心后 ,分布于不同的液层而分离 .超速离心也可用来测定蛋白质的分
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(板书)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备及转化的方法和技术。
二、实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。
其原理是细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA质粒。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上。
三、仪器、材料和试剂：（一）仪器：1.超净工作台2.离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅5.移液枪6.振荡器7.天平8.恒温水浴9.离心管10.锥形瓶（二）材料：1.大肠杆菌DH5α2.氯化钙3.胰蛋白胨4.氯化钠5.酵母提取物6.琼脂粉7.羧苄青霉素8.NaOH9.pUC-18质粒DNA（三）试剂：1. 0.1mol/l CaCl2溶液2. LB液体培养基3. LB固体培养基4. 50mg/ml羧苄青霉素。
5.70%酒精四、实验步骤：（一）大肠杆菌感受态的制备1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培养基的试管中，37℃震荡培养过夜。
2.取1 ml菌夜转接到一个含有50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养2-3h（此时，A600应在0.4-0.5之间，细胞数务必﹤108/ml，此为实验成功的关键）。
3.用移液枪取1ml菌液转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min。
（1000µl的枪，蓝色枪头，旋转不要太快，不能超过量程。
）（每组做两管）4.离心10min（4000r/min）。
（离心机，严禁空转和不平衡，使用之前用太平平衡，对称放。
上离心机之前，用卫生纸擦离心管。
不要贴标签。
用记号笔标记就可以。
盖紧离心管口。
盖好离心机内盖）5.倒出培养液，将管倒置1min，以使培养液流尽。
（在超净工作台中操作，在同一离心管中重复3-5步骤两次）6.用冰冷的0.1mol/l CaCl2200µl悬浮沉淀（用振荡器），立即放在冰上保温30min。
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）
感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
等化学试剂法）处理受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl
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后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
法），该法最先是由Cohen于1972大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl
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的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl
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形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109--1010转化子/闭环DNA。
因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细
胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD
600
控制。
对TG1
菌株，OD
600为 0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD
600
值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。
一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10--100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
⑶、试剂的质量
所用的CaCl
等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，
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最好分装保存于4℃。
⑷、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。