大肠杆菌感受态细胞的制备与转化课件
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大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 5、将上述菌液以3000 rpm离心20秒，弃大部分上 清，用剩余的100μl上清重悬菌体，涂布于含Amp 的筛选平板上（已涂布IPTG 7µl和X-Gal 40 µl）， 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
• 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其 它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素 的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 附录：
• LB液体培养基：胰蛋白胨1％ 酵母提取物0.5％
NaCl 1％ 用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。
• 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基
高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终 浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体 细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生 物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本 实验技术。其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液 中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形 成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面， 经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合 物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现 遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【设备、材料与试剂】
• 一、 设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机， 无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。
• 二、 材料 E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pUCmT质粒DNA: 购自上海生工生物工程有限公司。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 三、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离 心管中，置冰上。 2、加入连接产物10μl，轻轻摇匀，冰上放置60分 钟。 3、42℃水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上 冷却2分钟。 4、向管中加入800 µl SOC液体培养基(不含Amp)， 混匀后37℃振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生 长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。（其间可以将IPTG 7µl和X-Gal 40 µl涂布 于预制的Amp平板上）。
接种于20 ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基 中,37℃振荡培养1-2小时至OD600wk.baidu.com＝0.5左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟， 然后于4℃下5000 rpm离心10分钟。 2、 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30ml 轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4℃下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。 3、每50 ml初始培养物用200 µl预冷的0.1 mol/L 的CaCl2 溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟， 即成感受态细胞悬液。
【注意事项】
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素： 1、细胞生长状态和密度：最好从－70℃或-20℃ 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞 的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过 高或不足均会影响转化效率。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 三、试剂
1. LB固体和液体培养基 2. Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【实验步骤】
• 一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,
• 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细 菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体 细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂 法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Compenent cells)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺 陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的 突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内 并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛 选培养基中培养，即可筛选出转化子 (Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 与转化
【实验目的】 • 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技
术。 • 学习大肠杆菌转化的原理与技术。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【实验原理】
• 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转 移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般 缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完 成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
• CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便 易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求, 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处 理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体） 共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青 霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转 化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的 受体细胞（转化子）肯定已导入了pUCmT。转化 子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、 酶切等进一步鉴定。
• 5、将上述菌液以3000 rpm离心20秒，弃大部分上 清，用剩余的100μl上清重悬菌体，涂布于含Amp 的筛选平板上（已涂布IPTG 7µl和X-Gal 40 µl）， 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
• 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其 它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素 的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 附录：
• LB液体培养基：胰蛋白胨1％ 酵母提取物0.5％
NaCl 1％ 用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。
• 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基
高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终 浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体 细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生 物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本 实验技术。其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液 中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形 成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面， 经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合 物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现 遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【设备、材料与试剂】
• 一、 设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机， 无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。
• 二、 材料 E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pUCmT质粒DNA: 购自上海生工生物工程有限公司。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 三、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离 心管中，置冰上。 2、加入连接产物10μl，轻轻摇匀，冰上放置60分 钟。 3、42℃水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上 冷却2分钟。 4、向管中加入800 µl SOC液体培养基(不含Amp)， 混匀后37℃振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生 长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。（其间可以将IPTG 7µl和X-Gal 40 µl涂布 于预制的Amp平板上）。
接种于20 ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基 中,37℃振荡培养1-2小时至OD600wk.baidu.com＝0.5左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟， 然后于4℃下5000 rpm离心10分钟。 2、 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30ml 轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4℃下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。 3、每50 ml初始培养物用200 µl预冷的0.1 mol/L 的CaCl2 溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟， 即成感受态细胞悬液。
【注意事项】
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素： 1、细胞生长状态和密度：最好从－70℃或-20℃ 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞 的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过 高或不足均会影响转化效率。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 三、试剂
1. LB固体和液体培养基 2. Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【实验步骤】
• 一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,
• 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细 菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体 细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂 法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Compenent cells)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺 陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的 突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内 并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛 选培养基中培养，即可筛选出转化子 (Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 与转化
【实验目的】 • 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技
术。 • 学习大肠杆菌转化的原理与技术。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
【实验原理】
• 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转 移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般 缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完 成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
• CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便 易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求, 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处 理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体） 共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青 霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转 化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的 受体细胞（转化子）肯定已导入了pUCmT。转化 子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、 酶切等进一步鉴定。