CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

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感受态菌的制备原理、仪器试剂和操作步骤

感受态菌的制备原理、仪器试剂和操作步骤1．目的学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

2．原理细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。

4．试剂E. coli XL1-Blue，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌ddH2O5．实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌ddH2O，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。

6．操作步骤（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。

（2）从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上。

在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD600为0.375（<0.4~0.6，细胞数<108/ml，此为关键参数！）。

以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10m in，然后于4℃，5000rpm离心 10min。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。

大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化

大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化准备工作：1、LB琼脂平板若干。

2、50mL离心管若干，加满超纯水后于121℃20分钟灭菌备用。

3、含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶若干，121℃20分钟灭菌烘干。

4、1.5mL离心管若干，121℃20分钟灭菌烘干。

5、22﹪灭菌甘油溶液：22mL甘油加入78mL超纯水，121℃20分钟灭菌，保存于4℃。

试剂：1、100mL1mol/LCaCl2溶液：14.7gCaCl2.2H2O用超纯水配制成100mL贮存液，灭菌备用，保存于4℃冰箱。

2、100mL0.1mol/LCaCl2溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL灭菌超纯水混匀，保存于4℃冰箱。

3、100mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL22﹪的灭菌甘油溶液，混匀，保存于4℃冰箱。

感受态细胞制备：1、晚上从－70℃冰箱活化大肠杆菌（如DH5α或JM109），划LB平板，37℃培养过夜。

2、晚上从培养平板上挑取单菌落接种到一支3mLLB液体培养基试管，37℃培养过夜。

3、早上按1：100比例将过夜培养菌液接种到含有50mLLB液体培养基的250mL 三角瓶中，200rpm，37℃培养1-2hr左右，测OD600到0.2-0.3时，转到50mL离心管，冰浴10分钟左右。

4、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。

5、去上清，用0.1mol/L10mLCaCl2溶液重悬菌体，水浴20分钟左右。

6、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。

7、去上清，将收集的菌体用1mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液重悬，分装成100μl每个离心管，与－70℃保存。

8、必要时以浓度已知的标准质粒转化制备的感受态细胞以估计效率。

转化：1、从－70℃冰箱取出含有感受态细胞的离心管，在超净台上冰浴，待其融化后，加入连接产物或对照质粒，冰浴30分钟。

2、将离心管从冰浴取出并迅速转到42℃水浴热激90s，然后转冰浴2分钟。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞

氯化钙法制备感受态细胞下面的方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。

该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且快速，重复性更好。

该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。

１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。

为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。

在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各浓度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。

２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。

切记：下述所有步骤均需无菌操作。

３）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。

４）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。

５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。

制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。

对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。

６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。

感受态细胞制备与转化

Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞（大肠杆菌）①挑取37℃培养16-20h的单菌落（直径2-3mm）于含有100mlLB或SOB的500或1000ml 的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2-0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD 值为0.2-0.4时，约含109个菌/ml；②转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。

将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；③将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；④弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑤用30ml冰冷MgCl2-CaCl2溶液（80mM MgCl2和20mM CaCl2）漩涡振荡重悬菌体沉淀，置于冰上10min；⑥将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；/⑦弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑧用2ml冰冷0.1MCaCl2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl2/50ml原初培养物）漩涡振荡重悬菌体沉淀；⑨放于4℃冰箱14-20h。

获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%（7:3,7是菌液，3是甘油），分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。

感受态细胞的冻存制备①每4ml重悬细胞中添加140μlDMSO，轻摇混匀，冰上放置重悬物15min；②另外每管重悬物中再添加140μlDMSO，轻摇混匀，重新放于冰浴中；③迅速将重悬物分装于冷的、无菌小管内，将小管浸入液氮中瞬时冰冻感受态细胞，将小管存于-70℃冰箱。

Ⅱ、大肠杆菌转化①CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞Luria-Bertani（LB）培养基（1L）：胰蛋白胨（10g），酵母提取物（5g），NaCl（10g）pH7.5/NaOH，dH2O至1L，灭菌LB平板：LB培养基（500ml），Agar（7g），灭菌。

冷却55-65℃倒平板。

实验四感受态细胞的制备和连接产物的转化

实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化一、实验原理与目的法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；学习CaCl2掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。

感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发处展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。

用CaCl2理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。

冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。

二、材料与试剂0.1mol/L CaCl2溶液:称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

含15%甘油的0.1mol/L CaCl2: 称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

1.5ml EP管、灭菌枪头、移液枪、冰盒、低温离心机、涂布棒、大肠杆菌DH5a、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、氨苄青霉素三、实验方法1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl法）21）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌DH5a菌液30μl（过夜菌液约16小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过夜。

2）将过夜培养的菌液1ml移入100ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm），至OD=0.4—0.6（约2小时）；冰上30min。

3）取10ml培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000g离心10分钟。

4）弃去上清,用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下4000g离心10分钟。

5）弃去上清,加入2ml预冷的含20%甘油的0.1mol/L的CaCl2 溶液重悬,即成感受态细胞悬液。

CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤

⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
重组
目的：
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略
一种挑取重组子克隆的简易方法
凡经过体外DNA重组以后,都要通过挑取重组子克隆的方法将改变以后的DNA序列固定下来。通常挑取克隆是一项十分繁琐费时的工作,特别对于连结效率较低、自连机率高的情况,通过碱裂解法或煮沸法提取质粒常常是事倍功半;另外一种情况是重组质粒向农杆菌转化后的检测过程中,由于提取农杆菌的质粒通常获得的质粒量很少,且背景不干净,因此难以对酶切结果作出判断。针对上述情况,我们在实践中使用了PCR方法挑取重组子克
1. 4转化菌落的备份及菌落PCR反应物的制备
将B21, 32葡聚糖酶基因与植物表达载体pB in438的连接产物转化大肠杆菌DH5A感受态细胞,并涂布于含卡那霉素(50 Lg·m l- 1)的LB培养基上, 37℃培养过夜,待菌落长至1～2mm时,用灭菌的牙签沾取全部菌落先在预先分格并标记数字的另一块平皿上轻沾一下,然后在PCR反应混合液(PCR反应缓冲液、dN TP、引物、Taq DNA聚合酶、dH2O )中同样轻洗一下,依次将需挑取的克隆全部在另一块平皿上备份,并将剩余菌洗入对应的PCR
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞

实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。

实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。

大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。

菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。

由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。

此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。

常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。

目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。

用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。

因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。

甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。

贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。

甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。

在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。

复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。

氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。

本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。

由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。

能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。

转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。

二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。

三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。

1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。

一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法

一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。

传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。

本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。

二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。

（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。

（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。

（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。

（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。

（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。

（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。

（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。

（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。

（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。

为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。

（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。

研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。

大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。

若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。

从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。

将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。

转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。

大肠杆菌感受态细胞制备

E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。

二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。

注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。

三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。

此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。

四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。

转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。

在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。

注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。

培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。

五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。

2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。

3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。

大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)

大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。

1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养3 h。

一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。

2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。

4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。

7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

CaCl2法制备大肠杆菌感受态

CaCl2法制备大肠杆菌感受态转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。

一. 材料E. c oli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。

二. 试剂1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。

2.Amp母液：配方见第一章。

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。

在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。

实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。

通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。

实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。

2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。

3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。

4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。

5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。

实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。

在37摄氏度下孵育过夜。

2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。

3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。

将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。

然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。

4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。

在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。

结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。

在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。

通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。

这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。

大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。

CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤

Ca2处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2、Co2）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞.向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg.