大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
CaCl2法制备大肠杆菌感触感染态细胞[宝典]
![CaCl2法制备大肠杆菌感触感染态细胞[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/48c624a668dc5022aaea998fcc22bcd126ff4203.png)
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理：转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。
准备：1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；注：CaCl2必须为分析纯以上。
5.5492、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。
3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。
实验步骤：1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。
（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
分子生物学实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验大肠杆菌感受态细胞的制备实验原理：转化是将异源DNA分子引入另一细胞系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。
受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，经过CaCl2等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
经过转化的细胞在选择性培养基上，可以筛选出转化体，即带有外源DNA分子的受体细胞。
实验目的：学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。
实验内容：JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂大肠杆菌JM109或DH5α，LB固体/液体培养基，0.1mol/LCaCl2溶液。
二、主要设备台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液器、恒温摇床，等。
三实验方法1.受体菌的培养从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养（300rpm）12小时左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以1：100~1：50（V：V）的比例接种于100ml LB液体培养基，37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35～0.5左右。
2.感受态细胞的制备（1）在无菌条件下，将培养液转入预冷的1.5ml离心管中，冰上放置20min，使其停止生长。
（2）4℃下，4000rpm离心5min，弃去上清。
（3）加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000离心5min。
（4）弃去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，贮存于4℃备用。
或贮存于-70℃（加10-30%的甘油），可保存半年。
四.注意事项：1、整个实验都应在无菌的条件下操作。
2、整个操作均在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低。
大肠杆菌感受态制备
摇床
用于大肠杆菌的振 荡培养。
恒温振荡器
用于大肠杆菌的恒 温振荡培养。
03 实验步骤
细菌培养
01
02
03
培养基选择
选择适合大肠杆菌生长的 培养基，如LB培养基，以 保证细菌正常生长。
培养温度
将细菌培养在37℃恒温摇 床中，振荡培养至对数生 长期。
细菌密度
通过观察细菌的生长情况， 控制细菌密度，通常在 OD600值为0.6-0.8时进 行后续操作。
参考文献2
02
03
参考文献3
大肠杆菌感受态制备技术进展， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
大肠杆菌感受态制备实验指南， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
感谢您的观看
THANKS
实验原理
感受态
感受态是指细菌处于一种生理状态，能够接受外源DNA并与之结合， 进而发生转化。
转化过程
外源DNA通过细菌的细胞膜进入细胞内，并在DNA结合蛋白的作 用下与细菌染色体上的同源序列发生交换，从而实现基因的克隆和 表达。
影响因素
影响感受态形成的因素包括细菌生长状态、培养基成分、温度、渗透 压等。
转化子的筛选和验证
筛选方法
转化子可以通过抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法进行 筛选。
验证方法
验证转化子是否含有目的基因，可以通过PCR、酶切、 测序等方法进行。
注意事项
在筛选和验证过程中，需要注意避免假阳性或假阴性 的结果，确保实验结果的准确性。
优化实验条件
1 2 3
温度
感受态细胞的转化需要在一定的温度下进行，不 同的温度可能会影响转化效率，因此需要选择适 宜的温度进行实验。
实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备
三、实验材料
水浴锅、制冰机、离心机、超净工作台、恒温培养 箱、各式移液器、培养皿； 大肠杆菌DH5α； LB液体培养基、0.1M CaCl2溶液。
四、实验步骤
①挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃， 250r/min，过夜。 ②取150μl过夜培养物接种于15ml LB液体培养基中， 37 ℃，250r/min，培养至OD600 ≈0.375（一般为2h 左右，呈云雾状，使细菌处于对数早期或中期）。 ③将培养物1.5ml分装到预冷无菌的指形管中，冰上放 置5～10min。4 ℃，2000rpm，10min，弃上清。
实验六
大肠杆菌 感受态细胞的制备
一、实验目的
掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法
二、实验原理
Hale Waihona Puke 遗传物质的传递，一般常用接合转移、细胞融合、 转导、转染、转化等方法进行。 转化是指某一细胞由于接受了外源DNA，而导致其 原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传 型与表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的 DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为在细菌 生长对数期的后期是发展感受态的理想时期。
④沉淀用1ml冰冷的CaCl2溶液重悬， 4 ℃，2000rpm， 10min。 ⑤重复步骤④。 ⑥用200μl冰冷的CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min， 备用。
五、思考题
重组基因的导入方法有哪些?
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
实验四 感受态细胞的制备
分子生物学实验
思考题
1. 在制备感受态细胞的实验中要注意哪 些细节？
1、感受态细胞制备原理：受体细胞经过一些特 殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)处 理后，细菌会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为允许外源DNA分子进入的 感受态细胞(Compenent cells)。
（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞 外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域）
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器
超 净 工 作 台
离心设备 台式高速冷冻离心机
制冰机
实验试剂
分子生物学实验
1、实验材料：E. coli JM109。
2、实验试剂：
(1) LB液体培养基：称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 10 g，加双蒸水至总体积1L，高压下蒸气灭菌。
分子生物学实验
2. 感受态细胞的制备 (CaCl2 法，超净台内)
① 取2个1.5mL离心管，分别转入1mL菌液4℃ 12000 rpm，离心2 min。 ② 弃去上清，每管加入1mL预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶 液，悬浮细胞，冰上放置 30 min。 ③ 4℃ ，12000 rpm，离心2 min。
分子生物学实验
每人2管感受态细胞
注意事项
分子生物学实验
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４
℃的培养菌，最好从 -80℃甘油保存的菌种中直接转 接用于制备感受态细胞的菌液。
2. 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监
实验10、大肠杆菌感受态的制备
实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠，无水CaCl2，蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒【实验步骤】1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。
2 大肠杆菌超级感受态制备.
2014-5-7感受态细胞的制备1.取-80℃冻存的大肠杆菌菌株接种于100ml SOC培养基中，18℃过夜培养，直到OD600=0.6。
2.将培养物转移到50ml离心管中，冰浴15 min；4℃ 5,000rpm/min离心10min。
3.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
4.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入1/3体积的起始培养液的TB，冰浴10-15min，4℃ 5,000rpm/min离心10min。
5.弃上清，沉淀重悬于4ml TB，冰浴10min。
6.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀。
7.将菌液分装于1.5mL EP管中，每管50uL，液氮速冻，-80℃长期保存。
SOB的配制：蛋白胨20g酵母提取物5gNaCl 0.58gKCl 0.186g100×Mg++溶液10ml溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌100×Mg++溶液：MgCl2﹒6H2OMgSO4﹒7H2O溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌100mL SOB+1M gluocse 1mL，配制成SOCTB溶液的配制：1M KCl 5ml0.55M MnCl2 2ml0.5M CaCl2 0.6ml0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2mlddH2O 10.4mlTotal 20ml上述溶液混匀后过滤除菌，现配先用。
0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值Chilton et al., PNAS 1974。
实验六 感受态大肠杆菌细胞的制备
实验六感受态大肠杆菌细胞的制备一、实验目的1、了解什么是感受态细胞。
2、掌握利用CaCL2制备感受态大肠杆菌细胞的方法。
二、实验原理感受态细胞是经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
CaCl2法：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。
三、实验仪器及药品耗材1、主要仪器：冷冻离心机，超净工作台、酒精灯、打火机、制冰机、冰盒、液器、接种针、镊子等。
2、主要药品及耗材：大肠杆菌DH5a，酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉、Nacl、CaCl2、1.5 ml离心管、移液器吸头、无水乙醇及医用棉花。
四、实验步骤1、从-70℃冰箱取出大肠杆菌DH5a，用划线法涂于LB固体平板培养基，放于37℃过夜培养12-16小时。
2、在平板上挑起一个单菌落，接种于100ml液体LB培养基中，放于恒温摇床，37℃,150 rpm，培养4-5个小时。
3、检测菌液OD值变化，当菌液OD值A600在0.4-0.6之间时，将菌液放在冰中停止培养。
4、取1ml菌液，放于1.5ml离心管中，4 ℃,4000r/min,离心10分钟。
5、将管口倒置尽量去除上清液。
6、加入1 ml 在冰中预冷的0.1 mol/l CaCl2溶液，轻轻弹动离心管，使沉淀悬浮（禁止剧烈震荡）。
7、4 ℃,4000 r/min,离心10分钟。
8、将管口倒置尽量去除上清液。
9、加入1ml 在冰中预冷的0.1 mol/l CaCl2，轻轻弹动离心管，使沉淀悬浮，禁止剧烈震荡。
此细胞即为感受态细胞。
10、将感受态放于-70℃冰箱保存，备用。
注意：以上操作尽量在冰上进行。
大肠杆菌感受态细胞制备流程
大肠杆菌感受态细胞制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!大肠杆菌感受态细胞制备是分子生物学实验中常用的一种技术，用于将外源DNA转化到大肠杆菌中。
实验四 大肠杆感受态细胞的制备
三、材料
E. coli DH5α（或JM105）菌株：细胞生长 密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培
养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5
时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况 有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会 影响转化效率。 其它材料还有无菌1.5mL的eppendorf管
实验四 大肠杆菌感受态细 胞的制备
一、感受态细胞的作用
当实验室获得了一个新的质粒时，而 这个质粒并未转化到宿主菌内，则必须
以该技术使细菌细胞处于易接受质粒的
状态，以大量获得这一质粒。
二、原理
将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期） 置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会 造成细胞膨胀（形成原生质球），使细菌处于 容易吸收外源DNA的状态。
思考题： 1. 感受态细胞制备过程中应注意什么？ 2. 感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领 域？
４：用预冷的氯化钙（0.1M CaCl2， 300l）悬浮菌体，冰浴20min， 4000rpm, 离心1min,弃上清 ５：加入300 l预冷氯化钙悬浮菌体，放 置于冰浴，即得感受态细胞,此细胞可现 用,也可在4℃保存1周，或保存于-20 ℃ 或分装于无菌离心管中,投入液氮,快 速冷冻然后储于-70℃保存
四、试剂
1. LB固体和液体培养基： 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 5mol/L的NaOH调pH至7.0 2. 0.05mol/L CaCl2 （或0.1mol/L） 所有试剂均需高温高压灭菌。
五、操作步骤
１：从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌 落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养 12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基 中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。 ２：取1ml细菌培养物置于1.5mL的eppendorf管 中，冰浴15min，4000rpm,离心1min，弃上清， 冰浴放置 ３：用预冷的氯化钙（0.1M CaCl2，300l）悬浮 菌体，冰浴放置5min,4000rpm,离心1min.弃上清
大肠杆菌感受态细胞制备
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、实验目的1．了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点。
2．了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
二、实验原理在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术，外源 DNA感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。
的一种特殊生理状态。
大肠杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的大 肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会使细菌细胞膜的透性发生改变， 此时的细胞呈现出感受态。
制备好的大肠杆菌感受细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段 时间而不会对其转化效率有太大影响。
在 0℃下外源 DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，90 秒），诱导细胞吸收DNA。
转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养 1小时，可使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可 在含有相应抗生素的培养基上涂布生长。
而没有转化的细胞则无法生长。
三、实验仪器、材料和试剂1．仪器：超净工作台、冷冻高速离心机、灭菌锅、恒温摇床、冰箱、超低温冰箱(70 ℃)、50ml 离心管、1.5ml 离心管、试管、培养皿、冰浴、加样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管须在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15 分钟。
2．材料：大肠杆菌DH5a或其他菌株。
3．试剂：（1）LB 液体培养基：（见质粒DNA提取）（2）LB 固体培养基：15g/1L（琼脂粉 LB 液体培养基）（3）0.1 mol/L CaCl2（4）0.1 mol/L CaCl214%（v/v）甘油以上溶液均需灭菌后使用，灭菌条件同上。
（5）LB 固体培养基平板（LB plate）：培养基熔化后待其温度低于 50℃时加入氨苄青霉 素至终浓度为 100μg/ml，混匀后立即倒入培养皿（直径 9cm），待凝固后，于 4℃倒置保存。
化学生物学实验-感受态细胞制备-具体步骤
大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化（实验步骤）分组：每组同学分成2个小组，每个小组2-3位同学。
1. 感受态细胞的制备(1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期（老师做）。
(2) 将该菌悬液以1:50的比例重新接种于5ml LB液体培养基中（2组），37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
(3) 将5ml培养液转入3只1.5mL离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下5000r/min离心5分钟（每组3只）。
(4) 弃去上清，在每个离心管中用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟后，4℃下5000r/min离心5分钟。
(5) 弃去上清加入0 2ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。
将感受态细胞悬液分装成2份，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。
冰上放置备用（每组有6份感受态细胞）。
2. 铺平板将配好灭菌的LB固体培养基加热溶化，待冷却至60℃左右，加入卡那霉素储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。
3. 感受态细胞的转化(1) 将100μl感受态细胞悬浮液，置冰上5分钟，然后加入5ul pBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30分钟（每组做2份）。
(2) 42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
(3) 向管中加入400ul LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
(4) 将上述500ul菌液中取出200ul涂布于1块含卡那霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
（每组2块平板）(5) 同时做两个对照：对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
具体步骤
1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。
注意事项
1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。
为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散，从而使分光光度计读数得到标准化。
3. 对大多数大肠杆菌（MC106除外），采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。
Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明，细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h，在贮存的最初12-24 h内，转化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。
4. 克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板。
5. 菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6。
6. 低温处理的时间，做完后冰上保存12-24 h后分装，并保存于-80℃。
7. 试剂和用品，所有的用品（离心管、药瓶等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液。