基因工程专题1：基因芯片和第二代测序技术简介

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1984： 30亿美元测定一个人类基因组 1984： 30亿美元测定一个人类基因组
1994： 亿美元测定一个人类基因组(1:10) 1994： 3亿美元测定一个人类基因组(1:10) 2004： 千万美元测定一个人类基因组(1:100) 2004：3千万美元测定一个人类基因组(1:100) 2006： 2006：1百50万美元测定一个人类基因组(1:2000) 50万美元测定一个人类基因组(1:2000) 万美元测定一个人类基因组 2008：50万美元测定一个人类基因组(1:6000) 2008：50万美元测定一个人类基因组(1:6000) 万美元测定一个人类基因组
Known Distance
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熊猫基因组测序使用10 、 熊猫基因组测序使用 kb、5 kb、2 kb片段分别建库测序 、 片段分别建库测序
Mme I site:
TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^ AGGRTGNNNNNNNNNNNNNNNNNN^NN
From Shendure et al
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表1.1 目前使用最广泛的三大第二代测序平台 测序能力统计信息（ 年年初数据） 测序能力统计信息（2010年年初数据） 年年初数据
厂商 技术 测序仪 序列数目（百万） 序列数目（百万） GS20 0.5 Roche 454 FLX 0.5 Ti 1.25 I 28 Illumina Solexa GA II 100 IIx 250 1 40 ABI SOLiD 2 115 3 320
纯粹依靠靠生物化学或者分子生物学技 术的实验室将会很难生存! 术的实验室将会很难生存 只懂生物化学和分子生物学的生物学家 将会很难生存！ 将会很难生存！ 每个学生物的学生都应该掌握生物信息 学和统计学！ 学和统计学！
• 原位合成芯片
光蚀刻原位合成法（Affymetrix）、电化学原位合 成法、喷墨式原位合成法
• 点样芯片
针点式点样法、喷墨式点样法
原位光刻合成基因芯片原理
光源 遮蔽板
芯片
探针合成
A 3×3 array
CG AC G AC ACG AG CG AG C
Nucleotide Deposition Sequence ACG
Paired End Reads are Important!
Known Distance Read 1 Read 2
Repetitive DNA Unique DNA
Paired read maps uniquely
Single read maps to multiple positions
Shendure et al 2005
一、基因芯片（gene chip）技简介 基因芯片（ ）
基本概念
生物芯片（ 生物芯片（biochip） ） 基因芯片（gene chip, DNA chip, or DNA microarry） 基因芯片（ ）
GeneChip主要是 用 Northern blotting的原理， 将 Northern Blotting的探 主要是 的原理， 的原理 的探 针固定在特定的固体基质上，而原来印记在膜上的目标RNA进行标记，然 进行标记， 针固定在特定的固体基质上，而原来印记在膜上的目标 进行标记 后进行的大规模的杂交。 后进行的大规模的杂交。
读长（ ） 读长（bp） 库序列长度（ ） 库序列长度（kb） 运行时间（ 运行时间（天） 通量（ ） 通量（Gb） 200 3.5 0.3 0.1 400 3.5 0.4 0.5
12个水稻基因组/天 10个水稻基因组/天
2×50 × 0.2 10 9 2×100 × 0.2 10 50 2×25 × 3 12 2 2×35 × 3 10 8 2×50 × 2 16 32 0.2 6 2
单末端测序（ 单末端测序（Single-end） ） 读长（ ） 读长（bp） 运行时间（天） 运行时间（ 通量（ ） 通量（Gb） 100 0.25 0.05 200 0.3 0.1 400 0.4 0.5 35 3 1 50 3 5 100 5 25 25 6 1 35 5 4 50 8 16
3个水稻基因组/天 配对末端测序（ 配对末端测序（Paired-end） ）
array probes
A
Mask 1
A A A A A
探针合成
A 3×3 array
CG AC G AC ACG AG CG AG C
Nucleotide Deposition Sequence ACG
array probes
C
Mask 2
A A A A A
探针合成
A 3×3 array
CG AC G AC ACG AG CG AG C
未来目标： 未来目标：1000/100 美元测定一个人类基因组
Solexa 测序技术原理介绍 （1） ）
Solexa 测序技术原理介绍 （2） ）
Solexa 测序技术原理介绍 （3） ）
Solexa 测序技术原理介Βιβλιοθήκη Baidu （4） ）
Paired End Reads
Fragments Jumping Library Contruction
Affymetrix GeneChip®
二、第二代测序技术简介 （Next-generation sequencing） ）
Key Genomics Technologies
1975 - Southern DNA hybridization technique 1977 - Sanger’s chain-termination and Maxam、 chainMaxam、 Gilbert’s chemical DNA sequencing methods 1980 - Automated in situ oligonucleotide synthesis instrument 1985 - Mullis’s discovery of PCR at Cetus 1992 - Affymetrix (Fodor’s group) first gene-chip gene1995 - ABI’s first automated DNA sequencer 2006 - 2nd generation DNA sequencer on market 2007 and beyond – Single molecule sequencing techniques
Solexa测序技术的特点
• 边合成边测序（sequencing by synthesis, SBS） • 大规模平行化（massively parrellel ）
新的测序技术会对生物科学的研究产生深远的影响， 新的测序技术会对生物科学的研究产生深远的影响，它会 产生海量的数据。 产生海量的数据。
Nucleotide Deposition Sequence ACG
G
Mask 3
完成的芯片
CG AC G AC ACG AG CG AG C
A A A A A
Cy3和Cy5
Cy3激发波长532nm
Cy5激发波长635nm
表达谱芯片实验流程
1、分离RNA（10µg） 2、标记 3、杂交 （预杂交） 4、洗片 5、扫描
测序技术的发展
• 双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法 测序法) – 1970s 同位素标记，手工 同位素标记， – 1980s 荧光标记，自动 荧光标记， – 1990s 毛细管电泳 • 合成测序法（第二代测序） 合成测序法（第二代测序） – 焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454） 焦磷酸测序（ ） – 合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） 合成测序（ ） – 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD） 连接测序（ ） • 单分子测序技术（第三代测序） 单分子测序技术（第三代测序） – Helicos – Pacific Biosciences – Oxford Nanopore
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Solexa和SOLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端 Solexa和SOLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端 配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍 差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。 差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。 SOLiD包含两张芯片 这里的数据是一张芯片的量。 包含两张芯片， ABI SOLiD包含两张芯片，这里的数据是一张芯片的量。
The Dimensions of a GeneChip
5” 5”
* * *
*
* *
5µm
5µm
Millions of identical probes/ probes / feature
1.28cm
Up to ~6,500,000 features/ features / chip
1.28cm
基因芯片的制作方法