CaCl2法制备感受态细胞
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤⏹1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；⏹ 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；⏹ 3、培养物于冰上放置20min；⏹ 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；⏹5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；⏹ 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；⏹ 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
CaCl2法制备感受态
准备：1，1L或0.5L大三角瓶（氧气充分，利于细菌生长），装入100mlLB液体培养基培养基中加100ul 4MNaOH2，50ml干净（最好较新）塑料离心管3，1ml枪头和200ul枪头足够数量4，足够数量的分装用1.5mlEp管5，80mMMgCl2+20mMCaCl2以上灭菌，1室温放置，2-5冷冻储藏制备：1，活化菌种，5mlLB不加抗生素，1：100接菌，37度振荡培养过夜，同时接一管加抗生素的看是否长菌（让菌复苏，进入对数期的早中期。
此时更容易制得感受态细胞）1：500-1000转接入100ml培养基中，培养2-3h（减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
）2，无菌台中将菌液转移到冰预冷的50ml离心管中，冰浴10’，4度4000rpm 10’，超净台中弃上清，（使细菌的生长停止，代谢减慢。
因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡）3，用10ml冰预冷的5液体重悬100ml菌液所得菌体（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱），冰浴10’（细菌处于00C，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA，经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。
）4，4度4000rpm 10’收菌每100ml菌体用4ml冰预冷的0.1MCaCl2+10%甘油重悬（除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。
防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）5，）6，4度放置5hr7，分装100ul/冰预冷的1.5EP，-80度保存8，取两支分别转质粒和不转验证。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
CaCl2法制备感受态细胞-1
CaCl2法制备感受态细胞1）从新划线的平皿上挑取一个单菌落接种到10ml的LB培养基中于37℃过夜培养2）吸取500μl上述过夜培养的新鲜菌液，接种到一个盛有50ml LB的锥形瓶中，在37℃，200rpm条件下振荡培养直至菌浓度达到5×107个/ml，对大多数大肠杆菌菌株来说这时的OD600值为0.4~0.5。
一般从转接到达到此OD值约需2.5―3小时。
3）将培养液转至一灭菌并已预冷的50ml离心管（聚丙烯管）中于冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
4）然后于4℃以3000 rpm离心10min沉淀细胞，小心地弃去上清液，并倒转管子将残余的液体沥干。
5）将细胞悬浮在10ml冷的0.1mol/lCaCl2中，置冰上10min。
重复第4步操作，以沉淀菌体细胞。
6）收集菌体，加入1.5ml预冷的0.1mol/lCaCl2,小心悬浮，分装于200ul/管，若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为10%的灭菌甘油，置于-70℃保存小刚论文：大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备挑取新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种于5ml LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；培养物按1%接种量接种于100ml LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5。
培养物冰上放置10分钟，然后于4℃，4000r/min 离心收集菌体（无菌离心管）；将菌体用10ml冰冷的0.1M CaCl2洗一次；4℃，4000r/min 离心收集菌体，用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min；4℃，4000r/min 离心收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液，即制备成大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
质粒转化过程操作步骤（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5 10min。
（3）加入5–10 μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上30min。
cacl2制备感受态细胞的原理
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用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
感受态细胞的制备
CaCl2法Ecoli DH5α感受态细胞的制备及转化试剂：LB液体培养基LB/Amp(100ug/ml) 固体培养皿/15%甘油。
灭菌0.1mol/l 氯化钙，去离子水，灭菌Ep管，灭菌0.1MCacl2步骤：1.取DH5α菌划线，过夜培养。
(划线方法：用100μL枪头在菌液中蘸一下，在平板上划S形，第二次从第一次一个角开始划，分一下，第三次从第二次划线一个角分一下，逐渐降低菌液浓度)。
2.用灭菌枪头挑圆形菌落于LB液体培养基中（试管中5ml），37℃，200rpm，振荡培养12h左右，直至对数生长期。
（小摇）3.将菌种接种在锥形瓶LB液体培养基中（1ml/100ml），37度200r/min,振荡培养2-3h,至OD600=0.4左右。
（可透过锥形瓶中菌液看报纸上的字，模糊可见即可）。
（大摇）4A.分装到2个50ml离心管中，4℃，3000g，离心10min（离心前，离心机4℃预冷），弃上清。
5A.加10ml 凉的0.1MCacl于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀10min。
26A.4℃，3000g，离心10min,弃上清（从离心机取出时离心管尽量不要摇动）。
于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀30min。
7A.加10ml 凉的0.1MCacl28A.4℃，3000g，离心10min,弃上清。
/15%甘油于50ml离心管中，轻9A.加入2ml（2ml/50ml初始菌液量）0.1MCacl2轻摇匀。
10A.分装，在每个灭过菌的Ep管中装50μL～200μL，-80℃保存。
4B. 在Ep管中加入1.5ml菌液（2管）冰上10分钟，0～4度4000r/min ,2min 弃上清。
5B. 加入0.1mol/l氯化钙0.6ml，缓和悬菌，冰上10 分钟，4000r/min 10min,弃上清。
6B.加入冰氯化钙0.2ml缓和悬菌，分四管，冰上待用（-20度保存）。
转化1. 具有抗生素抗性的质粒0.5～2μL放入100μL感受态细胞中，冰上30min.2. 42℃热激90s,不要摇动管，立即放在冰上，冰上1～2分钟。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2法）及转化方法感受态细胞的制备：方案一：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；4）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min；5）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）方案二：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）将培养物连至锥形瓶至于冰上冰浴30min;4）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；5）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）热击转化步骤：1）在制备好的感受态细胞100 μL中，加入10 μl连接产物或1μl 质粒（依照质粒浓度而定）混匀，冰上放置30 min；2) 42 ℃温浴90 s（或者45℃温浴45 s）后迅速置入冰上1 min，加入800 μL LB培养基，37 ℃，180 r/min培养45min-1 h；3) 将孵化好的菌液涂布在相应的抗性平板上倒置，37 ℃培养过夜，PCR鉴定阳性转化子。
感受态细胞的制备与转化
化转：1.大肠杆菌W3110的感受态制备及转化（CaCl2法）（1）将保存的大肠杆菌菌种在2*YT固体平板上四区划线接种，30℃培养过夜，直至长出个体均一大小合适的单菌落。
（2）挑取一个单菌落接种至装有3 ml 2*YT液体培养基的试管中，放在30℃摇床中200 rpm 培养过夜。
（3）按照1:100比例（v/v)转接种子至装有80 ml 新鲜2*YT液体培养基的三角瓶中，于30℃摇床中200 rpm培养至OD600约为0.4（2h）。
注意：此处菌体浓度要严格控制，菌体太浓或者太稀都会对转化效率产生影响。
（4）将培养物分装至50 ml 预冷的离心管中，冰上放置10 min。
（5）将离心管放入事先预冷的离心机中（4 ℃），4000 rpm 离心10 min。
（6）小心倒掉上清，加入15 ml预冷的0.1 M的CaCl2溶液悬浮菌体，然后冰上放置15~30min。
（7）4000 rpm 4 ℃离心10 min。
（8）小心倒掉上清，加入2 ml含有15%甘油的预冷的0.1 M的CaCl2溶液重新悬浮菌体，分装成100 μl/管，-70 ℃冻存。
2.大肠杆菌W3110的感受态细胞的转化（1）将-70 ℃冻存的感受态细胞取出，放于手掌中融化。
（2）向管中加入2 μl 质粒DNA（pKD46），食指轻弹混匀，放置冰上15min。
（3）将微量离心管放到预先加温至42 ℃的水浴锅中，热激90 s，然后快速将微量离心管转移到冰上放置2 min。
（4）每管加800 μl 2*YT 液体培养基，然后将离心管置于30 ℃摇床上，170 rpm温育45min 使菌体复苏。
（5）将转化有目的DNA的感受态细胞涂布在添加了相应抗生素（Amp）的2*YT固体培养基上，于30 ℃烘箱培养12-16h后即可观察到菌落。
电转：3.大肠杆菌W3110的电击感受态制备及转化（1）挑取一个W3110（pKD46）单菌落接种至装有3 ml 2*YT液体培养基的试管中，放在30℃摇床中200 rpm培养过夜。
感受态细胞的制备
CaCl2法Ecoli DH5α感受态细胞的制备及转化试剂：LB液体培养基 LB/Amp(100ug/ml) 固体培养皿灭菌0.1mol/l 氯化钙，去离子水，灭菌Ep管，灭菌0.1MCacl2/15%甘油。
步骤：1.取DH5α菌划线，过夜培养。
(划线方法：用100μL枪头在菌液中蘸一下，在平板上划S 形，第二次从第一次一个角开始划，分一下，第三次从第二次划线一个角分一下，逐渐降低菌液浓度)。
2.用灭菌枪头挑圆形菌落于LB液体培养基中（试管中5ml），37℃，200rpm，振荡培养12h左右，直至对数生长期。
（小摇）3.将菌种接种在锥形瓶LB液体培养基中（1ml/100ml），37度200r/min,振荡培养2-3h,至OD600=0.4左右。
（可透过锥形瓶中菌液看报纸上的字，模糊可见即可）。
（大摇）4A. 分装到2个50ml离心管中，4℃，3000g，离心10min（离心前，离心机4℃预冷），弃上清。
5A. 加10ml 凉的0.1MCacl2于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀10min。
6A. 4℃，3000g，离心10min,弃上清（从离心机取出时离心管尽量不要摇动）。
7A. 加10ml 凉的0.1MCacl2于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀30min。
8A. 4℃，3000g，离心10min,弃上清。
9A.加入2ml（2ml/50ml初始菌液量）0.1MCacl2/15%甘油于50ml离心管中，轻轻摇匀。
10A. 分装，在每个灭过菌的Ep管中装50μL～200μL，-80℃保存。
4B. 在Ep管中加入1.5ml菌液（2管）冰上10分钟，0～4度4000r/min ,2min弃上清。
5B.加入0.1mol/l氯化钙0.6ml，缓和悬菌，冰上10 分钟，4000r/min 10min,弃上清。
6B. 加入冰氯化钙0.2ml缓和悬菌，分四管，冰上待用（-20度保存）。
转化：1. 具有抗生素抗性的质粒0.5～2μL放入100μL感受态细胞中，冰上30min.2. 42℃热激90s，不要摇动管，立即放在冰上，冰上1～2分钟。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理：转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。
准备：1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；注：CaCl2必须为分析纯以上。
5.5492、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。
3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。
实验步骤：1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。
（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。
CaCl2法制备感受态细胞
E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）一、准备工作1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。
甘油灭菌。
10ml移液管3支。
高温灭菌1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
2．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
3．配置1M KOH 和0.2 M醋酸以调节pH用。
4．制备针式过滤器2个，50ml、20ml 一次性注射器各一个。
5．冷冻离心机换50ml转子。
6．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照下表配制TFB1和TFB2工作液，化学药品现称量，再调pH值，过滤除菌，放在冰上或冷后4℃储存。
当天现配现用。
100 ml菌液用30 ml TFB1工作液和4 ml TFB2工作液，按此比例类推。
二、操作步骤：全过程冰上操作，4℃离心，无菌操作。
第一天：划板。
挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
第二天：1、从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
第三天：2、按1：100将1ml培养物接种到100毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、0℃（冰上）预冷15分钟。
4、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置90分钟。
准备高温灭菌过的1.5毫升离心管若干个，-80℃冰箱预冷。
(先用3ml的F1振荡悬浮再加入剩下的12ml)5、4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。
弃上清，用2ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。
冰上放置15分钟。
6、按50ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，扔入液氮速冻再拿出来转入-80℃冰箱储存。
20CaCl2法感受态制备
CaCl2法感受态制备
实验准备：灭菌0.1M CaCl2溶液(0.05mol/L CaCl2也可以)、含40%灭菌甘油，灭菌50mL离心管
实验步骤（以下提到的LB培养基均含有对应抗生素）
1.菌种的活化：以感受态细胞在LB的平板上进行划线分离。
2.菌种的前培养：从LB平板上挑取单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，37℃振荡
培养过夜至对数生长中后期。
3.菌种的准备：将该菌悬液以1:100的比例分别接种于100mlLB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养大约2.5小时至OD=0.4~0.5。
5.感受态细胞的制备：
①把上述的锥形瓶放到冰水浴20min使其冷却。
把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
②弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
③弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用移液枪轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min，在4℃、3000转每分钟，离心10min。
④弃去上清液，加入1.5mL 0.1M CaCl2溶液，1.5mL 40%甘油，用移液枪轻轻吹打
使沉淀混匀，并分装到灭菌1.5mL离心管，放置在冰盒上。
⑤准备好液氮盒子，在冰盒上摆放好0.5ml离心管，将感受态细胞悬液分装成100µl
或200µl每管。
⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。
1.CaCl2法制备感受态细胞(分子克隆)
2007-4-19 健康科学研究所 B细胞与自身抗体研究组 刘占杰CaCl2法制备感受态细胞1、划线（无选择性LB-Agar平板），37℃培养16-20h；2、挑单菌落到2ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜；；3、取1ml过夜菌液到100ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3hr，检测OD600nm about 0.44、将菌液转移到50ml BD管中，冰上放置10min；5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置1min；6、用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2,20mmol/l CaCl2）溶液30ml重悬细胞沉淀,冰上30min；7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置1min；8、用2ml预冷0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μl／管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃。
附：0.1mol/l CaCl2： 100ml(1.1g 无水CaCl2＋100mlddH2O)高压除菌；0.1mol/l CaCl2-MgCl2: 150ml(2.439g MgCl2·6H2O, 0.333g 无水CaCl2＋150mlddH2O) 高压除菌；转 化1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入1μl（50ng）待转化质粒；2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min3、加入SOC或LB培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；4、取200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养14-18h，观察菌落；质粒小抽(Beyotime)1、挑单菌落到3ml 选择性LB培养液中，37℃，225rpm，14-18h；2、收菌液到1.5ml EP管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一次，每管收集3ml菌液）3、用250ul溶液I预冷（保证P1已加RNase），Vortex重悬细胞；4、加溶液II 250ul，颠倒混匀4-6次，室温3min；5、加入350ul溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生;6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心60秒，倒弃收集管内液体；在质粒纯化柱内加入750ul溶液IV，最高速离心60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;8、将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50ul溶液V至管内柱面上(中央)，放置1min; 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。
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大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化
实验原理
处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂
(1)0.1mol/L CaCl2溶液
(2)LB液体培养基
(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备
(1)超净工作台
(2)冷冻离心机
(3)恒温摇床
(4)－70℃冰箱
(5)10mL移液管
(6)吸耳球
(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）
(8)50mL 离心管
(9)1.5mL离心管
实验材料
(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）
实验步骤
（一）受体菌的培养
(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。
）
(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2)在4℃下，4000r/min离心10min。
弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。
(4)0～4℃ 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。
（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。
（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。
）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。