原核表达和真核表达

原核表达和真核表达

原核表达的步骤和主要试剂

1、获得目的基因；

2、构建重组表达载体；

3、获得含重组表达质粒的表达菌种；

4、诱导表达；

5、包涵体的分离。

获得目的基因 PCR法钓基因

引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu

酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶

（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)

RT-PCR法获取基因

Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其他进分），

Rnase抑制剂（MBI），M-MLV/AMV（Fermentas）或

M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、

Axygen、Omega）

构建重组表达载体 内切酶（Fermentas），载体（捷瑞，Fermentas），琼脂糖（西班牙），T4连接酶（Fermentas，promega），测序

获得含重组表达质粒的表达菌种 菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），抗生素（捷瑞，Amresco，sigma），测序（伟沃）

诱导表达 IPTG（捷瑞，Amresco，sigma），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）

包涵体的分离 Triton X -100（捷瑞，进分），PMSF(sigma)，DTT （Amresco，进分），尿素（Amresco，进分，sigma）,还原型谷胱甘肽（Amresco，进分，sigma）

真核表达

蛋白质在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录加工系统获得具有一定构象和生物活性的蛋白质。真核表达现在主要有毕赤酵母表达体系、杆状病毒昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系。

各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。

毕赤酵母表达体系步骤及试剂

1、目的基因的获取；

2、构建表达质粒载体；

3、表达质粒的转化；

4、转化子的鉴定；

5、表达产物的鉴定。

目的基因的获取 基因组DNA提取 酚/氯仿法

蛋白酶K（Merk和Amresco），饱和酚（捷瑞），

氯仿﹕异戊醇（24﹕1）（捷瑞）

试剂盒法

血液/动物/植物/微生物基因组DNA提取试剂盒

（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）

RNA的提取 Trizol法

Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其

他进分），Rnase抑制剂（MBI）

试剂盒法 高纯总RNA快速提取试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）

第一链cDNA的合成 M-MLV/AMV（Fermentas）或M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）

PCR技术 PCR 引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)

产物纯化 PCR产物纯化试剂盒（捷瑞，Axygen）

构建表达质粒载体 Vector（捷瑞，Fermentas）,菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），限制内切酶（Fermentas），T4连接酶（Fermentas，promega），测序

表达质粒的转化 毕赤酵母菌株（Invitrogen），高效感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），限制内切酶（Fermentas），MD或MGY培养基：YNB（进分），生物素（sigma，捷瑞，进分），各种氨基酸（国产，进分），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）

转化子的鉴

定 基因组水平的鉴

定

PCR法

引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）

/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶

（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)，琼

脂糖（西班牙原装），Gold view（国产），Tris

（Biosharp），硼酸（Biosharp），DNA marker(捷

瑞，Fermentas)

转录水平的鉴定 RT-PCR法

Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其

他进分），Rnase抑制剂（MBI），琼脂糖（西班

牙原装），Gold view（国产），Tris（Biosharp），

硼酸（Biosharp），DNA marker(捷瑞，Fermentas)

表达产物的

鉴定 SDS-PAGE法

SDS（Amresco，进分，捷瑞），单丙稀酰胺/甲

叉双丙稀酰胺（Amresco，进分，捷瑞），Tris

（Amresco，进分，捷瑞），甘氨酸（Amresco，

进分，捷瑞），TEMED/APS（进分），蛋白Marker

（MBI，捷瑞），考马斯亮蓝R-250（Amresco，

进分，捷瑞）

Western blot

考马斯亮蓝R-250（Amresco，进分，捷瑞），Tris

（Amresco，进分，捷瑞），甘氨酸（Amresco，

进分，捷瑞），甲醇（国产），NC膜（Millipore，

GE），Tween-20（Amresco，进分，捷瑞），Nacl

（国产），脱脂奶粉（Bio-Rad），一抗（Santa

Cruze，Abcam等），HRP标记的二抗（凯基，碧

云天或其他国产），DAB（Amresco，sigma，捷

瑞，进分）