在兔动脉粥样硬化模型中生长素抑制动脉粥样硬化斑块血管生成和促进斑块的稳定性

在兔动脉粥样硬化模型中生长素抑制动脉粥样硬化斑块血管生成和促进斑块的稳定性摘要斑块内血管生成与动脉粥样硬化斑块的不稳定性有关。

在目前的研究中，我们调查了在家兔动脉粥样硬化模型中，生长素在斑块内血管生成和斑块不稳定性中的作用。

家兔被随机的划分为三组，即，对照组、动脉粥样硬化模型组和生长素治疗组，每组持续治疗4周。

我们发现，在生长素治疗组的家兔内膜与中膜的厚度比明显低于动脉粥样硬化组的家兔。

生长素治疗组家兔的新生血管，血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的数量，比动脉粥样硬化模型组减少的更明显。

在家兔动脉粥样硬化模型中，生长素明显减少斑块巨噬细胞，基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的含量。

此外，生长素治疗组家兔的促炎因子单核趋化蛋白（MCP）-1，比动脉粥样硬化模型组家兔明显降低。

总之，生长素可以通过下调VEGF和VEGFR2的表达，来抑制斑块内血管生成和促进斑块的稳定性，在家兔动脉粥样硬化晚期抑制斑块巨噬细胞的含量和减少MCP-1的表达。

1.介绍心血管疾病（CVD）是致死的原因之一，全球每年有1730万人口患病。

动脉粥样硬化斑块破裂是急性心血管事件的主要原因，包括急性冠脉综合征（ACS），心脏损伤和中风。

病理研究显示脂质积累，基质降解和炎症与斑块的不稳定性和破裂有关。

新血管的生产时斑块不稳定性的另一个重要因素。

在动脉粥样硬化损伤中，新血管的生产可能会促进斑块的扩大，斑块内出血和破裂，这在动脉粥样硬化损伤的进展和易损性中起着关键的作用。

抑制斑块内血管生成可能在提高斑块的稳定性，预防和治疗动脉粥样硬化心血管疾病（ASCVD）中发挥潜在的作用。

生长素，一种28氨基酸酰化肽，主要从胃中释放，是一种生长激素促分泌素受体（GHSR）的内源性配体。

生长素和GHSR在心血管系统和内皮细胞中表达，并且在心血管系统中产生保护作用。

先前的研究证实，生长素可以抑制动脉粥样硬化损伤的发展。

此外，生长素在人类冠状动脉粥样硬化中上调了3-4倍，表明生长素在动脉粥样硬化斑块的发展中起关键的作用。

同样重要的是，生长素被认为是血管生成的内源性调节因子并且可能抑制血管的生成。

然而，生长素对斑块内血管生成的作用和它的作用机制还没有被展开研究。

在当前的研究中，我们在体内实验中检测生长素在斑块内血管生成和斑块的不稳定性中的作用。

我们的数据证实，在家兔晚期动脉粥样硬化中，生长素通过下调VEGF和VEGFR2的表达，抑制斑块中巨噬细胞、MMP-2、MMP-9的含量，减少MCP-1的表达，来抑制新血管的生成和促进斑块的稳定性。

2.材料和方法2.1动物模型动物使用严格的在重庆医科大学伦理机构委员会和中国国家科学技术委员会的批准下，按照实验动物的保护和使用指南进行。

36只雄性新西兰大白兔，体重2.5-3.5kg（3个月大），随机的划分为3组：对照组（n=12），动脉粥样硬化模型组（n=10），生长素治疗组（n=11）。

动脉粥样硬化模型组和生长素治疗组在前两周和腹主动脉球囊损伤后7周喂1%胆固醇饮食（120-140g/day）。

兔子通过戊巴比妥钠麻醉（30mg/kg），腹主动脉球囊损伤通过3.5F的球囊管从右侧股动脉到胸主动脉产生。

此后，气球膨胀在10-12atm （1atm=101.325Pa），导管轻轻的朝着髂骨动脉回缩。

每只兔子进行这步操作3次，确保腹主动脉被适当的损伤。

在9周末，兔子转变为正常饮食。

对照组接受正常饮食和不接受手术干预。

然后，对照组不接受额外的治疗，动脉粥样硬化模型组通过静脉注射无菌性生理盐水（NS），生长素治疗组通过静脉注射鼠生长素（25μg/kg/d）。

注射4周，每天一次。

在13周末，给兔子安乐死，收集组织做病理分析。

2.2血脂分析在实验开始（0周），生长素治疗前（9周），生长素治疗后（13周）从禁食过夜的兔子中收集血液。

血清样品收集并且储存-80℃中，直到实验。

总胆固醇（TC）的血清水平，甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），使用商用试剂盒通过酶促实验进行测量。

2.3组织学染色如前所述，兔子被过量的戊巴比妥钠静脉注射而安乐死。

从每只兔子中，将腹主动脉切成3cm的片段，4%的多聚甲醛固定过夜，然后再切成两个相等的片段。

一个片段用石蜡包埋，组织块被切成5μm厚，用苏木精，曙红和天狼星红染色。

另一片段用冰冻切割，组织被切成5μm厚的薄皮，用油红O染色。

2.4免疫组化染色石蜡包埋的腹主动脉切片浸入10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）并且通过热的微波照射。

将切片在3%的过氧化氢中孵育15分钟，抑制内生过氧化物酶活性。

在脱蜡和复水后，切片与兔抗兔CD31抗体（1:500），鼠抗兔巨噬细胞（1:1000），兔抗兔MMP-2（1:500），MMP-9（1:500），兔抗兔MCP-1（1:500）4℃孵育过夜。

非特异性位置用5%BSA封闭。

这些切片然后和羊抗兔IgG（1:50）或羊抗鼠IgG（1:50）一起孵育。

一抗被磷酸缓冲液所取代，作为阴性对照。

2.5组织学分析组织病理学参数通过ImageProPlus6.0软件进行分析。

检测对于分析器来说是盲化的。

动脉肌中层，在动脉横截面积中提供了一个参考点，从动脉外膜中分离内膜。

一个大的坏死核心，薄的纤维帽，丰富的巨噬细胞，稀疏的胶原和平滑肌细胞（SMCs）是易损斑块的特征。

通过油红O，天狼星红，巨噬细胞，MMP-2，MMP-9和MCP-1抗体阳性染色面积，在至少5个大功率视野中（X200），通过腹主动脉的斑块区域划分染色面积的百分比，作为表达着色面积的百分比。

微血管密度（MVD）的确定根据田等人的标准。

简单的说，在X40放大倍率和然后计数在X200放大倍率的10个随机视野中观察，CD31阳性血管的最高密度的斑块面积。

在每个视野中微血管的平均数量被确定和表达作为MVD。

2.6荧光定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）通过提取试剂盒试剂从腹主动脉中提取总RNA，cDNA的产生用PrimeScript RT试剂盒，根据操作说明进行。

cDNA作为荧光定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）的模板，使用的引物如下：VEGF (198 bp)5–CCTCGTTTCCTTCCTCATTCC–3(有义链) 和 5–GGCTTGTTCCTCCTTCTTGCTC–3 (反义链);VEGFR2 (148 bp) 5–TGGCAACCTGTCCAACTACCT–3(有义链) 和 5–GCTGCTGGTGACGCT GTCTA–3 (反义链).β-actin (122 bp), 引物 5–GCAGTCGTTGGAGCGAGCAT–3 (有义链)和5–ATGGCATCTCACGATAT TTGGA–3 (反义链).引物由Shinegene Biotechnological有限公司合成。

Bio-Rad（USA）荧光qRT-PCR检测系统用于扩增。

SYBR绿色荧光定量PCR试剂盒用于定量检测目标基因。

每种反应包括2μl的cDNA，0.5μl的每种目标基因引物（10μM），0.15μl的TaqDNA聚合酶，12.5μl的2xSYBR mix包含4mM镁离子，加双蒸水到25μl。

对于扩增，最初变性94℃2分钟，随后变性94℃10s，退火61℃15s，扩增72℃30s 40个循环。

β-actin作为原始对照。

读取循环阈值，用相对比的方法计算。

绘制标准曲线，扩增曲线和溶解曲线。

2.7Western blot分析蛋白质在冰上被从腹主动脉中分离。

BCA实验用于定量蛋白质的含量。

蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后转膜到PVDF膜上。

VEGF，VEGFR2和β-actin的水平，用鼠抗兔多克隆抗体针对抗VEGF（1:200），抗VEGFR2（1:200）,抗β-actin（1:500）检测。

MMP-2，MMP-9，MCP-1的水平，用兔抗兔多克隆抗体针对抗MMP-2（1:100），抗MMP-9（1:100），抗MCP-1（1:100）检测。

这些膜用过氧化物酶结合羊抗兔IgG（1:1000）或羊抗鼠IgG（1:5000）孵育。

免疫反应性蛋白通过增强化学发光而可视化。

光密度定量通过Quantity One软件进行。

2.8统计学分析用spss17.0软件进行统计学分析。

用于社会科学的统计软件包。

所有的数据都用均数±标准误的形式表示。

对照组，动脉粥样硬化模型组和生长素治疗组数据通过ANOVA分析，接着用SNK或Dunnett检验。

均值p＜0.05被认为与另一个有统计学差异。

3.结果3.1体重和血脂的改变在0周时，所有组中的体重和血脂没有明显的差异（P>0.05）。

在9周和13周末，动脉粥样硬化组和生长素治疗组的兔子体重，TC和LDL-C水平相对于对照组兔子而言明显升高（P<0.05）。

然而，在动脉粥样硬化组和生长素治疗组的兔子间体重和血脂没有明显差异（P>0.05,表1）3.2生长素对动脉粥样硬化损伤的影响横截面用苏木精和曙红染色，用于组织学分析。

在对照组中兔子的动脉壁是完整的，没有动脉粥样硬化斑块可见（图1A）。

建立动脉粥样硬化动物模型，兔子给予高胆固醇饮食然后经球囊损伤9周。

如图1B所示，动脉粥样硬化模型组在腹主动脉中有动脉粥样硬化损伤，内中膜明显增厚。

与生长素治疗组（图1C）兔子相比，在动脉粥样硬化模型组的兔子内中膜没有明显不同。

然而，内膜与中膜的厚度比在统计学上比动脉粥样硬化组兔要低（P<0.05，表2）。

3.3生长素在斑块内血管生成的作用研究生长素对斑块血管生成作用的影响，抗体抗CD31被用于免疫组化。

如图2A所示，CD31在对照组兔子的动脉粥样硬化斑块中若表达。

与对照组相比，动脉粥样硬化组和生长素组斑块内新生血管有大幅增加。

血管的数量被量化（图2B）。

在生长素治疗组兔子的腹主动脉的斑块中，微血管CD31阳性着色的数量比动脉粥样硬化组有所降低。

我们接下来检测VEGF和VEGFR2在各组的表达水平。

在动脉粥样硬化组中VEGF和VEGFR2的表达水平比对照组明显增加（图3A-C）。

然而，生长素显著的抑制动脉粥样硬化组兔子的VEGF 和VEGFR2表达水平。

3.4生长素在斑块稳定性中的作用在动脉粥样硬化斑块内，可见脂质核胶原纤维，横截面积分别被染油红O和天狼猩红染成红色。

在对照组兔子中，内膜中有少量的脂质，这与动脉粥样硬化斑块无关。

然而，在动脉粥样硬化模型组兔子中，动脉内膜有大量的脂质，伴随有胶原含量的减少，这将会导致不稳定斑块的形成。

在生长素治疗后，动脉内膜中脂质含量有所减少，并且斑块胶原的含量也比动脉粥样硬化模型组有明显的增加（图4，表3）。

然后，我们检测巨噬细胞的聚集，和斑块内容物中MMP-2和MMP-9的表达水平。