问答题整理(带答案)

1.PCR反应体系包括哪些内容？基本反应过程是什么？
内容：模板、引物、TaqDNA聚合酶、原料、Mg2+、缓冲液、双蒸水
基本反映过程：变性——退火——延伸——检测
DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 退火（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳
以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

检测
2.限制性内切酶的活性受什么因素的影响？
①DNA分子的纯度
②限制酶的浓度
③DNA分子的构型
④DNA分子的甲基化程度
⑤酶切反应的时间与温度
⑥缓冲液的选择
3.作为基因工程载体的条件是什么？
1)具有一个或多个限制酶切点,以供外源基因插入其中;
2)具有标记基因,以鉴定重组是否进入受体细胞;
3)能自我复制,否则可能导致重组丢失;
4)对受体细胞无害;
5)大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大不便操作.
4.基因工程诞生的理论基础是什么？、
20世纪中三个基础理论的重大突破,是基因工程的诞生的理论基础.
1、DNA是遗传物质的证明.
2、DNA双螺旋结构和中心法则的确立.
3、遗传密码的破译.
技术上的三大发明*（3酶2体）
1.限制性核酸内切酶的发现与DNA切割
2.DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
3.载体的研究与应用
5.构建载体的一般过程是什么？
A目的基因的分析1.开放阅读框分析2.酶切位点分析
B载体的选择与分析1.多克隆位点分析2.标记基因分析3.启动子及其他筛选标记分析
C连接体系与连接时间的确定
6.大肠杆菌作为基因工程受体菌的优点与缺点？
优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子生物学等方面背景知识清楚。

并且大肠杆菌已经发展成为一种安全的基因工程试验体系，易于批量生产。

缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;细菌不具有对真核基因的蛋白进行修饰的机制，导致真核基因表达出的蛋白无法表现活
性；外源真核基因表达的蛋白往往被细菌当作异己给降解掉
7.如何有效提高外源基因的表达效率？
提高外源基因表达效率的途径有很多，可以归纳如下：
⑴提高启动子强度。

⑵缩短启动子同克隆基因间距离。

⑶高效的翻译起始序列。

⑷高效的转录终止区。

⑸提高质粒拷贝数及稳定性。

⑹用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离；②用点突变
的方法改变某些碱基；③增加mRNA的稳定性的。

⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达；②表达载体的诱导复制。

⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白；②采用某种突变菌株；③表达分泌蛋白质。

8.RACE技术原理与方法
RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，利用锚式PCR，快速扩增cDNA末端从而获得已知mRNA内一段小序列与3‘或5’的cDNA序列技术。

9.3’RACE技术原理与方法
利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART 寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。

然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。

10.5’RACE技术原理与方法
先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。

利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5' 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。

然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM （universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。

11. 理想质粒载体的必备条件
①能在宿主细胞中进行独立和稳定的自我复制
②具有合适的限制性酶切位点
③具有合适的选择标记基因
1.有较小的分子质量与较高的拷贝数
2.具有两种以上的选择标记基因
3.缺失MOB基因（不懂）
4.插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞进行自我复制和表达12.核酸操作的基本技术有哪些？
①核酸的提取与纯化
②核酸的检测与保存
③核酸的凝胶电泳
④核酸的分子杂交
13.合成cDNA第二链的主要策略有哪些？
①自身引导合成法
②置换合成法
③PCR合成法
④RT-PCR
⑤cDNA与载体连接
14.PCR技术主要应用在哪些领域？
①核酸基础研究
②基因测序
③检测基因表达
④转基因检测
⑤研究未知DNA片段
15.真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍?
①真核基因缺乏SD序列不能直接在大肠杆菌内部翻译
②细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;细菌不具有对真核基因的蛋白
进行修饰的机制，导致真核基因表达出的蛋白无法表现活性
③外源真核基因表达的蛋白往往被细菌当作异己给降解掉
16.限制性核酸内切酶的命名原则？
一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)
17.影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？
①DNA分子的纯度
②DNA分子的构型
③DNA分子的甲基化程度
④酶切反应的时间与温度
⑤缓冲液的选择
18.什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有何作用？
Klenow 酶KlenowFragment，又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I的大片断。

保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。

由于其失去了降解5’端引物的活性，所以在基因工程中更有用
1.修复反应，制备平末端
2.制备3’标记探针
19.若已知某基因的功能及其相应的蛋白质核苷酸序列，可通过哪些办法克隆该
基因？
可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库中筛选。

或利用相应抗体从cDNA文库中克隆
20.YAC载体有什么样的功能性序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。

YAC能容纳长达几百KB的外源DNA。

大片段的插入更有可能包含完整的基因，增大染色体的步移距离，减少所需克隆数目
21.什么是western印迹，其与southern印迹又何不同？
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异的抗体进行检测。

他与southern的不同在于探针性质的不同，在western中使用的探针为抗体（蛋白质）
22.什么是蓝白斑筛选法？
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。

野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。

5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。

突变型大肠杆菌缺少完整的β-半乳糖苷酶，在含有互补片段质粒作用下，可形成完整的β-半乳糖苷酶，插入外源基因的质粒则破坏了半乳糖苷酶的编码，从而通过颜色变化筛选重组子。

这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。

主要是在λ载体的非必要区段插入一个自带有大肠杆菌β半乳糖苷酶的基因片段，携带有LAC基因片段的λ载体转入宿主后·，在含有X-gal平板上形成浅蓝色噬菌斑。

外源基因插入LAC 后，丧失分解Xgal的能力，形成白色噬菌斑。

便于筛选
23.粘性末端链接法的不足
①载体易自身环化
②难插入特定基因
③大片段DNA重组率低
④同一种限制酶产生的黏性末端不易定向克隆
24.什么是同聚物加尾连接法？有哪些优缺点？
同聚物加尾法是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏粒末端，DNA与载体间要加上互补的dT
优点①不易自身环化
②链接效率高，因为是互补的黏性末端任何一种方法制备的DNA都可用
此法连接
缺点①繁琐②尾巴影响基因表达
25.重粗DNA技术有哪些基本步骤？
①获得目的基因
②与克隆载体连接
③转化
④对转化子筛选与鉴定
⑤培养或的产物
26.获得目的基因常用的方法有哪些？
①从基因文库中提取
②PCR技术
③人工合成
27.常用的抗生素标记有哪些？
氨苄青霉素抗性基因ampr 四环素抗性基因tetr 氯霉素抗性基因cmr 卡那霉素和新霉素抗性基因kanr
28.琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？
DNA电泳常用的支持介质有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶.
琼脂糖凝胶的凝胶孔径大，适合大分子DNA电泳和需要快速简单分析的DNA电泳，电泳方式一般采用水平潜水电泳。

优点是快速简单，但分辨率不是很高，对于差异较小的 DNA片段难以分辨。

聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.
一般说来，分离鉴定小于1000个核苷酸的核酸片段可用聚丙烯酰胺电泳，分离鉴定0.1-50kb的DNA片段可用恒场常规琼脂糖电泳，而分离鉴定大于50kb的
DNA片段则需采用脉冲场琼脂糖电泳。

29.构建cDNA文库的一般步骤
①mRNA的分离纯化
②cDNA的合成
③cDNA与载体连接
④噬菌体颗粒包装及导入宿主细胞中繁殖
30.DNA双脱氧链终止测序法的基本步骤
原理：双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2’和3'碳上都没有了羟基基团，而在天然分子中糖环的3'碳上有一个羟基。

在DNA复制过程中，新掺入的碱基按碱基互补配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的5'-α-P同生长链的前一个核苷酸的3'羟基连接。

但是，若进入的核苷酸是双脱氧的，则由于3'没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形成，导致DNA复制终止。

方法：将待测序的单链DNA的模板、引物、四种单脱氧碱基和DNA聚合酶分成四管，在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3'端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

[考点]双脱氧链终止法的原理和方法。

英国剑桥大学分子生物学实验室的F.Sanger在1977年发明了用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定DNA的序列的方法。

由于这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种适当的DNA引物，因此也被称为引物合成法或酶催引物合成法。

31.什么是包涵体，以及以此方式表达蛋白的优点
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

（1）异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击；
（2）包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题；
（3）包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离；
（4）有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达；
（5）对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。

32.32.大肠杆菌载体表达系统
①DNA复制及载体选择系统
②外源目的基因的转录系统
③蛋白质的翻译系统
LAC与TAC表达系统：以LAC操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统
PL与PR表达系统：以噬菌体早期转录启动子PL与PR构建的表达系统
T7表达系统：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统构建的表达系统
33.天然质粒的性质
质粒的组成与构型：可自我复制并传代
线性、环形（环形双链RNA/环形双链DNA）、其他
质粒的大小：1~200kb
选择性
质粒的DNA复制：松弛、严紧
质粒的不亲和性
显性质粒隐性质粒
34.外源基因在大肠杆菌的表达形式
分为可溶性蛋白与不溶性蛋白两种
不溶性：包涵体（在大肠杆菌细胞质中）
可溶性：融合蛋白寡聚型外源蛋白和整合性蛋白
35.构建λ噬菌体克隆载体的基本技术路线
去除λ噬菌体的非必需区
标记基因
建立包装体系
36.限制性核酸内切酶有哪几种？常用的是哪一种并简述其特点
Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型核酸内切酶
常用的为Ⅱ型酶
分子量较小
反应只需Mg2+的存在
识别位点有回文对称结构
很多酶切割后都会产生粘性末端
37.目的基因片段酶切后，链接到载体的过程用到哪些酶，简述这些酶的性质
38.限制性核酸内切酶、DNA连接酶（E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶、TAQDNA
连接酶）
39.简述酶切反应体系及条件
酶、底物、反应缓冲液、反应时间、反应温度
一、底物DNA(纯度、DNA分子构型、识别序列两侧)
二、限制酶用量
三、缓冲液
四、反应温度
五、操作步骤及方法
六、星活性。