我们实验室用的银染方法
银染方法总汇及注意事项
ptotocol是这样的，请看哪里不妥：蛋白银染步骤步骤溶液时间固定甲醇100ml冰醋酸25ml加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次敏化甲醇75ml戊二醛（25%w/）1.25ml硫代硫酸钠(5%w/) 10ml醋酸钠（17g）加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至250ml 20min冲洗双蒸水2次显色碳酸钠(6.25g)甲醛(37%w/) 0.05ml加双蒸水至250ml2-5min终止EDTA-Na22H2O(3.65g)加双蒸水至250ml 10min冲洗双蒸水3次建议使用silia的方法！！简单，快！本人的银染方法：1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。
以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。
谢谢！！！5.2.2.3 银染色1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％甲醇500ml 冰醋酸120ml2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02%无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）染色步骤：1 银染液1 洗2次，每次5分钟2 银染液2 洗1次，每次30分钟3 超纯水洗2次，每次1分钟4 0.5%硝酸银洗30分钟5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。
双向电泳凝胶银染操作流程.
2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸） 六、（补充）：脱色
快速银染银染步骤及相关药品配制
快速银染银染步骤及相关药品配制银染步骤及相关药品配制一．银染基本步骤1．洗板和擦板电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5分钟后用配制的剥离硅烷（repel）溶液涂抹均匀。
放置15－30分钟玻板（用过的玻板先用NaOH溶液浸泡，直至废胶脱落）先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的亲和硅烷（binding）溶液涂抹均匀。
放置15－30分钟2．装板玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近)，对齐后，用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。
3．灌胶用针筒吸取6％的聚丙烯酰胺凝胶溶液，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子。
凝胶需要1－2个小时。
4．预电泳取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300ml左右，注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管。
80W衡功率电泳半小时。
5．点样用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。
6．电泳80W衡功率电泳1小时左右。
7．银染将玻板放入配制好的银染液中，银染半小时左右10．显影从银染液中拿出玻板快速水洗3－5秒，然后放入新鲜配制的显影液中，室温显影，直至条带清晰11．用自来水轻轻冲洗板子正反面几次，洗净残余的NaOH。
二．药品配制1．6%聚丙烯酰胺凝胶（PA）：Urea: 420.42gAcr: 60g 丙烯酰胺Bis: 3.16g10×TBE: 50ml加超纯水定容至 1L8% 聚丙烯酰胺PA：尿素 420.42gAcr： 80gBis: 4.212g10*TBE: 100ml加超纯水定容至 1L2. 10×TBETris-base: 216g硼酸：110gEDTA-Na2：14.88g3. binding（亲和硅烷）无水乙醇：2mlBinding原液：8ul冰醋酸：8ul4．Repel （剥离硅烷）三氯甲烷：100mlRepel：2ml5．Loading buffer：甲酰氨：49ml10mM EDTA（PH=8.0）：1ml溴酚蓝：0.125g二甲苯青：0.125g7．银染液蒸馏水：1500ml无水乙醇：150ml硝酸银溶液（1g/ml）：1500ul 8．显影液蒸馏水：1500ml氢氧化钠：30g甲醛：6ml硫代硫酸钠（10mg/ml）：300ul。
银染
银染操作步骤1.固定：电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。
固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml 固定液，可大量配制室温存放。
2. 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30% 乙醇。
3.水洗涤：（洗2次）弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
4.增敏：（辅染）现配现用弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。
银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。
银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。
5.水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
6.银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。
银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。
银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。
银染方法
银染方法1.搪瓷盘中倒入2000ml左右70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定15min2.回收乙醇(可重复用3-5次)，蒸馏水洗2遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净3.190ml蒸馏水中加入3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml混匀配成染色液。
倒入染色液，染色30min。
4.倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净5.200ml蒸馏水中加入1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul混匀配成显色液。
倒入显色液显色至清晰。
6.倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍测序板的硅化处理1:每块玻璃板的面都需硅化处理，以防止凝胶与两块玻璃板紧贴并减少电泳完毕后从胶模中取出凝胶时凝胶发生破裂的可能性。
硅化方法为；将拟硅化的玻璃板置于通风橱中，并戴手套操作，在拟硅化板面上加2-3ml 5％二氯二甲基硅烷(二氯二甲基硅烷5％溶于氯仿中)，用纸巾将硅化液涂布均匀，然后用去离子水洗净玻璃板,再用乙醇冲洗后晾干。
如需要从玻璃板上去除原有的硅，可用KOH-甲醇擦拭之。
KOH-甲醇配制为100ml甲醇中加5g片状KOH即可。
测序板的硅化处理2:1.浓度：4%二氯二甲基硅烷2.成分：二氯二甲基硅烷，三氯甲烷4.用途：制备聚丙稀酰胺凝胶时，可用Repel-silane处理小玻板，使凝胶易于剥离。
5.使用方法：测序用玻璃板必须彻底洗净。
先用温水和洗涤剂洗净，用水洗掉洗涤剂,再用去离子水冲洗干净。
最后用乙醇洗板。
1）长玻璃板的处理每次铺胶前均需用亲和硅烷对长玻璃板进行处理。
1、用镜头纸蘸取亲和硅烷溶液少许（1ml左右），涂在长玻璃板上。
要将整块板都涂满、涂匀。
2、4~5分钟后，用95%乙醇洗长玻璃板三次，以去除多余的亲和硅烷。
2）短玻璃板的处理每次铺胶前均需用剥离硅烷对短玻璃板进行硅化处理。
1、处理短玻璃板前先更换手套，以防与亲和硅烷交叉污染。
2、用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（1.5ml左右），涂在短玻璃板上。
我们实验室用的银染方法
我们实验室用的银染方法1.50%甲醇浸泡15分钟(置于摇摆床上,以下省略,本步骤两次,每15分钟更换一次)2.10%甲醇浸泡10分钟3.水漂洗3次,每次数秒4.2μM DTT溶液浸泡20分钟5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟6.水漂洗3次,每次不超过15秒(每次约150ML)7.显色液漂洗3次,每次不超过15秒(每次约100ML)8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带(约200ML)9.10G柠檬酸定影显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水,用前加入250μL福尔马林搅拌均匀水用双蒸水就可以,纯度越高越好,其他试剂用分析纯,据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏此方法出自冷泉港蛋白质技术指南(实际上是其蛋白质技术会议的总结)灵敏度稍低于分子克隆上老方法,但是非常方便,也比其他方法快速,只需要1.5小时,我染出来的胶非常漂亮,有需要的话可以上传给大家看看一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。
固定、银染之后均需充分的漂洗。
其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。
固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白1.取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。
液体的量一般是胶体积的5倍，比如13×13×0.1cm的胶，用一百ml一定够，80也行。
银染方法总结
银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。
大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。
这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。
染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间100ml 乙醇（40% 乙醇）25ml冰醋酸（10% 冰醋酸）加水到250ml致敏：30min75ml 乙醇（30% 乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min银染：20min0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml终止：10min3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250ml保存：1% 冰醋酸，4 ℃注意事项：1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
5．银染液和显色液需要预冷。
银染电泳实验方法
一、实验名称：银染法-电泳检测目标条带
二、实验目的：测定样品中蛋白组成
三、实验材料
1.主要试剂耗材
名称厂家/品牌
30%丙烯酰胺SIGMA
三羟甲基氨基甲烷Amresco
十二烷基硫酸钠（SDS）北京新经科生物技术有限公司
氯化钠北京化工厂
四、实验内容：
A.加样量计算
B.样品定量，浓度计算，吸取等量的待测样品至各EP管中，向管中加入适当体积的5×SDS凝胶加样
缓冲液，100℃加热5min，使蛋白变性。
C.小心拔出上样梳，按预定的顺序加样，上样量根据所选板子的厚度而定，在预留的一个上样孔中
加入分子量Maker
D.样品煮沸10分钟，13000rpm离心5分钟，取上清。
E.开始电泳，电压150V 跑70min。
F.结束电泳，将15%胶拆开固定15min—水洗6min—致敏5min—水洗1min—银染15min—水洗5s—
显色至条带清晰—终止1min后换水保存。
DGGE银染溶液配制、银染步骤及切胶回收解读
溶液配制固定液：乙醇90ml，冰醋酸4.5ml，定容至900ml（各组分含量：10%乙醇，0.5%冰醋酸）注：如果显影完后不进行终止显影，那么固定液可以回收使用。
染色液：AgNO3 1.4g，甲醛600μl，加入去离子水700ml，振荡混匀，甲醛在使用前加入。
每次使用需新鲜配制，在固定步骤快结束时配制即可。
显色液：NaOH 9g，甲醛1200μl，加去离子水600ml。
显影液的配制可以先配成NaOH溶液放入4℃冰箱贮存，待要用时取出再加入甲醛并混匀。
预冷的显影液可以让条带显影更漂亮清晰，但是显影速度会变慢一些。
银染步骤1.固定将胶放入固定液中，摇床振荡15min。
摇床速度无需很快，小档即可。
2.银染固定液中取出胶，去离子水快速清洗两次，固定液此时可回收。
将胶放入配制好的染色液中，摇床振荡20min。
尽量在通风橱中进行并避光。
有时候胶会飘在水面导致染色结果不好，可调整摇床速度使染色液没过胶。
3.显影染色液中将胶取出，去离子水快速清洗一到两次，尽量迅速！放入预冷过的显影液中显影，并马上迅速振荡容器，使胶周围的银离子扩散均匀，待溶液颜色均匀不变，摇床开小档振荡直至条带显色完全。
4.终止显影将胶取出清洗两次，放入固定液中，即可终止显影，但固定液不可回收了。
如果不需要保存胶的话，这一步可以省略。
5.拍照将胶放在白光透射仪上，轻轻抚去底下的气泡，铺平摆正胶，数码相机拍照。
注意：银染全程，手指不可碰到胶，尤其是染色~显影这一段步骤，摸一下胶就会留下手印。
切胶回收步骤在白光透射仪上用干净的手术刀片切胶，放入灭菌的0.5ml离心管中，加入灭菌水50μl后，用黄枪头捣碎，离心后60~65℃水浴3~6h，取出离心后可以进行PCR实验，如果时间不能安排马上做PCR也可放4℃过夜，第二天做PCR。
SDS-PAGE 银染步骤
1. 电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。
2. 固定：将凝胶浸泡在 25 ml 的固定液中，固定液充分覆盖胶。
放于摇床上室温摇动 15 分钟。
更换固定液，重复一次。
固定液的配制：超纯水：乙醇：冰醋酸=6:3:1.3. 固定完成后，配制 10%乙醇，洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。
4. 再用超纯水洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。
5. 配制银染增敏工作液：取 50 ul Silver Stain Sensitizer（500×）加入到 25 ml 超纯水中，混匀。
6. 将步骤 4 洗好的凝胶置于银染增敏工作液中，室温下准确孵育 1 分钟（这里时间可以适当延长的），之后用超纯水洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒。
7. 弃去超纯水，将凝胶置于 Silver Stain 中孵育 30 分钟（我做的时候是孵育45min-1h）。
8. 配制终止液：5%冰醋酸。
9. 用超纯水快速洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒（时间不用很准确）。
10. 立即将洗好的凝胶浸没在 Silver Stain Developer 中，室温孵育 2-3 分钟，直至蛋白条带显示清晰（我做的时候室温孵育时间比较长，因为我也是为了找到差异条带打质谱的，10分钟甚至更长都是可以的，建议最好一直在旁边看着，直至出现满意的结果）。
11. 用终止液洗去凝胶上的 Silver Stain Developer 后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应10 分钟。
(注：孵育是摇床速度调到最小，洗涤时速度要加快，和western洗膜的速度一样就行)用一般的SDS-PAGE胶就可以。
1. 分离胶(12%)配制所需试剂所需体积分离胶(12％) 30％丙烯酰胺 6.0 ml1.5 mol/l Tris-HCl 3.8 ml10%SDS 150 μl10%过硫酸铵 150 μlTEMED 6 μl蒸馏水 4.9 ml2. 浓缩胶(5%)配制所需试剂所需体积浓缩胶(5％) 30％丙烯酰胺 1.3 ml1.5 mol/l Tris-HCl 1.0 ml10%SDS 80 μl10%过硫酸铵 80 μlTEMED 8 μl蒸馏水 5.5 ml3. 分离胶缓冲液(pH8.9)配制所需试剂所需体积分离胶缓冲液Tris 36.6 g1 mol/l HCl 48 ml蒸馏水补足至100 ml4. 浓缩胶缓冲液(pH6.7)配制所需试剂所需体积浓缩胶缓冲液（pH6.7）Tris 5.98 g1 mol/l HCl 48 ml蒸馏水补足至100 ml5. 30%丙烯酰胺(pH≤7.0)配制所需试剂所需体积30%丙烯酰胺（pH≤7.0）丙烯酰胺29 g甲叉-双丙烯酰胺 1 g蒸馏水补足至100 ml6. 10%过硫酸铵(W/V)：1g过硫酸铵溶于10ml水中，4℃保存数周，尽量现用现配。
PAGE银染方法
TA钠盐或者1g甘氨酸加去离子水到终体积250ml。 浸泡凝胶10min。 9．保存 1%冰醋酸，4℃。 1．银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.7
5mm）可以提高灵敏度。 2．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶 太脆而破碎。 3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液 变混浊时换一份显色液，显色
由于其成本低，所用试剂安全、快速、灵敏度高 而被广泛应用。银染的原理是银离子在碱性pH环 境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而 显色。由于银染的灵敏度很高，可染
出凝胶上低于1ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝 胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。 这里介绍的是一种实验室常用的银染方法，主要 是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋
．室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果， 恒温水浴可以解决这个问题。 14．当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会 奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以
改进染色效果。 15．据称戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色 提高40倍。在染色效果不佳的情况下可以考虑。 16．银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带 会变浅
，而背景会加深。 17．不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性 蛋白染色效果差。因此不宜用银染测定不同蛋白 的比例。
上海坤肯生物化工有限公司主营分子生物学
试剂、免疫试剂、细胞培养基、生化试剂、实验 室耗材及仪器。公司以专业的技术支持，和周到 快捷的服务，努力成为生物化工领域的领头羊。 公司的经营理念：以专业的产品、专业
致在60KDa或67KDa处出现两条水平线。减少巯 基乙醇的用量即可避免。。 8．染色、水洗等过程中，缓慢的振荡是必要的， 一般选择40-60rpm。没有设备，用
手推轻晃亦可。 9．凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面 干燥所致，所以全程操作中都应带手套。 10．凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起 的，所以溶液的配
银染步骤及注意事项
银染步骤及注意事项银染步骤及注意事项银染色步骤为1次固定10分钟冰醋酸2用双蒸水洗涤凝胶，每次1分钟3染色液1g硝酸银。
5mL37甲醛1L双蒸水现在匹配染色30分钟。
4.快速清洗并清洗凝胶数次。
5开发30克碳酸钠1.5毫升37甲醛200微升10毫克/升硫代硫酸钠显影直到出现清晰的条纹银染色成功的关键因素包括:1 .用超纯水，如纳米纯水或Milli-Q或双蒸水进行银染色的纯化2.使用提供的碳酸钠或ACS试剂级碳酸钠染色后用于水洗的时间长度非常重要。
清洗胶水，然后将其放入通常浸泡在水中的显色溶液中，只需5-10秒钟。
4使用前及时向显色液中加入甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml5.使用前及时配制染液银染方法有很多种，目前文献报道有100多种。
然而，确切的染色机理还不是特别清楚。
一般原理是银离子在碱性酸碱度环境下还原成金属银，沉淀在蛋白质表面形成颜色。
银染色广泛用于2D凝胶分析和垂直凝胶，用于极低蛋白质含量的测定，因为它对低于1纳克/蛋白质斑点的染色凝胶具有高灵敏度。
本文介绍了我们实验室成功使用的银染色法，以补充关键操作和要求。
主要用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测，如内源GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究。
银染色程序用于检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白质带上的硝酸银和银离子还原成金属银，在蛋白质带上沉积银颗粒。
染色程度与蛋白质中某些特殊基团的有关。
不含或很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时会被染色。
银染的详细机制尚不十分清楚。
试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或乙二胺四乙酸。
Na2.2H2O，甲醛实验程序固定30分钟或更长时间100毫升乙醇40毫升乙醇25毫升冰醋酸10毫升冰醋酸加水250毫升敏化30分钟75毫升乙醇30毫升乙醇17克醋酸钠28.2克三水醋酸钠0.5克硫代硫酸钠加水250毫升水洗涤3×10毫升银染料20分钟0.625克硝酸银100微升37甲醛加水至最终体积250毫升使用前用水冲洗2×1min注意掌握时间水冲洗时间长颜色慢点是黄色发展取决于情况o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37甲醛添加o 水至最终体积2使用前50ml终止10 min o 3.65 g EDTA、na 2.2h2o 或1g甘氨酸o加水至最终体积250ml保存1冰醋酸4℃注意事项1如果固定时间较长，加一步水洗30分钟以避免胶水太脆而破裂。
蛋白质银染原理与方法
原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。
① SDS-PAGE电泳。
注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。
否则难以得到清晰的电泳分辨率。
②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。
加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在固定液中。
③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在保育液中。
④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。
⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。
⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。
显色时间不要过长，否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。
弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
PAGE银染方法
一、实验原理银染是一种重要的PAGE染色方法，由于其成本低，所用试剂安全、快速、灵敏度高而被广泛应用。
银染的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高，可染出凝胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。
这里介绍的是一种实验室常用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测。
二、实验试剂1. 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA钠盐、去离子水、甲醛。
三、实验步骤1. 固定量取100ml 乙醇，25ml 冰醋酸加去离子水到250ml(视胶板大小情况，适当等比例配制，增加固定液量，以下相同。
)，使其终浓度达到 40% 乙醇，10% 冰醋酸。
将凝胶板浸入固定液中，固定30min以上。
2. 水洗去离子水浸泡。
3x 10 min。
2. 致敏生物科研提醒：量取75ml 乙醇，17g 乙酸钠或28.2g三水乙酸钠，0.5g硫代硫酸钠加去离子水到体积250ml。
将固定后的凝胶板拿起，浸入致敏液中，浸泡30 min。
4. 水洗去离子水浸泡。
3x 10 min。
5．银染0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积250ml。
将胶板浸入银染液中，浸泡30 min。
6．水洗去离子水浸泡。
3x 20 sec。
注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色。
水洗不充分，背景较深。
7．显色6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积250ml。
2-15min，显色时间视凝胶大小、厚薄情况而定。
看到各条带，即可将凝胶捞出。
8．终止3.65g EDTA钠盐或者1g 甘氨酸加去离子水到终体积250ml。
浸泡凝胶10 min。
9．保存1% 冰醋酸，4 ℃。
四、注意事项1．银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。
银染步骤及注意事项
银染步骤是1 固定10冰乙酸min。
2 清洗双蒸水冲洗凝胶次每次1min。
3 染色染色液1g硝酸银.5mL37甲醛1L双蒸水。
现配染色30min。
4 清洗迅速洗凝胶次。
5 显影30g 碳酸钠1.5mL37甲醛200uL 10mg/L硫代硫酸钠。
显影至清晰带纹出现。
成功银染的关键因素包括 1 用超纯水比如NANOpure或Milli-Q纯化或者是双蒸水作银染。
2 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。
3 在染色后水清洗所用时间的长短很重要用不超过5-10秒的时间清洗胶然后放入显色溶液中一般在水里浸一下就好。
4 甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml在使用前及时加入到显色液中。
5 在使用前及时配染色液。
银染的方法种类很多目前有文献报道的就有100 多种。
但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。
大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高可染出胶上低于1 ng/蛋白质点故广泛的用在2D 凝胶分析上及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。
这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法对关键操作及要求做了补充主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测如内源性GST-Pulldown、Co-IP 等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
实验原理在碱性条件下用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子还原成金属银以使银颗粒沉积在蛋白带上。
染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
银染的详细机制还不是非常清楚。
试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序固定30min或者更长时间o 100ml 乙醇40 乙醇o 25ml冰醋酸10 冰醋酸o 加水到250ml 致敏30min o 75ml 乙醇30 乙醇o 17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠o 0.5g硫代硫酸钠o 加水到终体积250ml 水洗3 x10min 银染20min o 0.625g AgNO3 o 100 ul 37甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 水洗2 x 1 min 注意把握时间水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色显色视情况而定o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37 甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 终止10min o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸o 加水到终体积250ml 保存1 冰醋酸4 ℃注意事项1固定时间较长则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。
蛋白质银染原理与方法
蛋白质银染原理与方法 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是 2～／蛋白条带。
① SDS-PAGE电泳。
注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。
否则难以得到清晰的电泳分辨率。
②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。
加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在固定液中。
③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在保育液中。
④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。
⑤准备：取 10XSilvering Solution, 加入水，混匀后使用。
⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。
显色时间不要过长，否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。
弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. % 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
银染
银染步骤及相关药品配制快速银染步骤1．洗板和擦板电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5分钟后用配制的剥离硅烷（repel，4度保存）--（使电泳槽与胶分离）溶液涂抹均匀。
放置15－30分钟玻板（用过的玻板先用NaOH溶液（1瓶加约25L水，可反复使用）浸泡1-2（30min）天，直至废胶脱落）先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的溶液【亲和硅烷（binding）8ul+冰乙酸8ul+无水乙醇至2.0ＥＰ管满】【配方二：200ul binding原液+50ml 蒸馏水，可久存】涂抹均匀。
放置15－30分钟2．装板玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近)，对齐后，用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。
3．灌胶用针筒吸取凝胶混合液【配方一：50ml 6％的聚丙烯酰胺凝胶溶液+100ul APS（即10%的过硫酸铵：超纯过硫酸铵2g+18ml超纯水）+200ul TEMED】【配方二：50ml 6％的聚丙烯酰胺凝胶溶液+350ul APS（即10%的过硫酸铵：超纯过硫酸铵2g+18ml超纯水）+28ul TEMED，该溶液很快就凝固，需快速灌胶】缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子。
凝胶需要1－2（30min）个小时。
4．预电泳（主要是使凝胶的温度达到一定高度）取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300ml左右，上下槽用一样的缓冲液（即1×TBE）注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管。
80W衡功率电泳半小时。
5．点样用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，再用吸管将每个梳孔吹干净，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。
6．电泳80W衡功率电泳1小时左右（电压可能达到1100V-2000V，若太高则有可能配错，将功率调低，以免温度过高，玻璃板裂开）。
gomori银染色法
Gomori银染色法1. 简介Gomori银染色法是一种常用于组织学研究中的染色技术，用于观察和分析细胞和组织中的特定结构和成分。
该方法利用化学反应将目标物质转化为可见的颜色，从而使其在显微镜下更容易观察和分析。
2. 原理Gomori银染色法的原理基于物质与还原剂之间的化学反应。
在染色过程中，还原剂（如氨水）与目标物质（如核酸或蛋白质）发生反应，生成可见的沉淀物。
这种沉淀物具有黑褐色至棕褐色的颜色，可以在显微镜下清晰地观察到。
3. 步骤Gomori银染色法通常包括以下步骤：3.1 样本制备首先，需要准备待染色的组织样本。
样本可以是活体组织切片、固定组织切片或细胞悬液等。
3.2 固定样本对于活体组织切片，需要先进行固定以保持其形态和结构。
常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。
3.3 去脂化接下来，需要将样本进行去脂化处理以去除细胞和组织中的脂肪物质。
这可以通过浸泡样本于氯仿、醇或氨水等溶液中来实现。
3.4 银染色在样本去脂化后，开始进行银染色步骤。
具体操作如下：1.将样本浸泡于含有还原剂（如氨水）的染色溶液中，使其与目标物质发生反应。
2.在适当的时间内（通常为几分钟至几小时），观察目标物质是否已经被还原并形成沉淀物。
3.如果需要增强染色效果，可以重复上述步骤。
4.染色完成后，用水洗涤样本以去除多余的染料和化学试剂。
3.5 固定和封片最后，为了保护和保存已染色的样本，需要进行固定和封片处理。
这通常包括使用透明胶片或覆盖玻璃将样本封装，并使用合适的固定剂固定样本。
4. 应用Gomori银染色法在生物医学研究中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：4.1 组织学研究Gomori银染色法可以用于观察和分析组织的形态、结构和成分。
它可以帮助研究人员了解组织中不同类型的细胞、细胞器和其他结构之间的关系，并揭示出一些特定病理变化。
4.2 神经科学研究在神经科学领域，Gomori银染色法常被用来染色神经元和神经突起。
电泳银染原理
电泳银染原理电泳银染原理1. 介绍电泳银染是一种常用的蛋白质分析技术，可用于检测和定量蛋白质。
本文将从基本原理、操作步骤以及优缺点等方面进行介绍。
2. 基本原理电泳银染基于电泳分离原理，通过电场的作用将蛋白质分离成不同电荷的带点，并利用银离子与蛋白质结合形成可见的银颗粒，从而使分离出的蛋白质区域显现出染色。
3. 操作步骤电泳银染的操作步骤主要包括准备样品、电泳分离、固定蛋白质和银染。
准备样品首先，需要将待分析的蛋白质样品进行制备。
通常包括提取蛋白质、测定蛋白质浓度、标记蛋白质等步骤，确保样品浓度适宜且能与电泳介质配合良好。
电泳分离将准备好的样品加载到准备好的电泳介质中，通常是聚丙烯酰胺凝胶。
施加电场后，蛋白质根据其大小和电荷差异在凝胶中移动，实现分离作用。
固定蛋白质为了增强染色效果，需要将分离出的蛋白质固定在凝胶上。
使用甲醛等试剂固定蛋白质，使其与凝胶交联，以防止后续步骤中的蛋白质流失。
银染银染是电泳银染的核心步骤。
首先，将固定的蛋白质与银离子接触，银离子会与蛋白质中含有的亲银基团发生反应，形成可见的银颗粒。
然后，通过一系列洗涤、显色和停止反应的步骤，实现对银颗粒的增强和可视化。
4. 优缺点电泳银染作为一种常用的蛋白质分析方法，具有以下优点和缺点：优点•灵敏度高，可以检测低浓度的蛋白质。
•分辨率高，能够准确分离不同大小和电荷的蛋白质。
•操作相对简单，不需要使用昂贵的设备。
缺点•染色过程相对复杂，需要掌握一定的技术。
•染色结果呈现一定的变异性，不同实验条件下结果可能有差异。
•对于一些特殊的蛋白质，可能出现较大的染色偏差。
5. 结论电泳银染是一种可靠的蛋白质分析技术，以其高灵敏度和高分辨率备受广大科研人员的青睐。
虽然操作过程相对复杂，但掌握正确的操作步骤和技巧，能够得到准确的结果。
此外，对于染色结果的解读和分析也需要结合实验设计和其他技术手段进行综合评估。
6. 拓展应用除了在蛋白质分析领域，电泳银染还有一些其他的拓展应用。
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我们实验室用的银染方法1.50%甲醇浸泡15分钟（置于摇摆床上，以下省略，本步骤两次，每15分钟更换一次）2.10%甲醇浸泡10分钟3.水漂洗3次，每次数秒4.2 gM DTT溶液浸泡20分钟5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟6.水漂洗3次，每次不超过15秒（每次约150ML）7.显色液漂洗3次，每次不超过15秒（每次约100ML）8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带（约200ML）9.10G柠檬酸定影显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水，用前加入250 g L福尔马林搅拌均匀水用双蒸水就可以，纯度越高越好，其他试剂用分析纯，据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏此方法岀自冷泉港蛋白质技术指南（实际上是其蛋白质技术会议的总结）灵敏度稍低于分子克隆上老方法，但是非常方便，也比其他方法快速，只需要1.5小时，我染岀来的胶非常漂亮，有需要的话可以上传给大家看看一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。
固定、银染之后均需充分的漂洗。
其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。
固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白1.取下凝胶，蒸馏水冼胶30秒.2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液，蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒，换用新的显色液，显清条带为止.显色液配方：10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液，定溶到500ml.这个染色方法挺好的，我用过.注意染色时间不能长材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。
液体的量一般是胶体积的5倍，比如13X13X 0.1cm的胶，用一百ml 一定够，80也行我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液，蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒，换用新的显色液，显清条带为止.不要试图将所有的条带都显岀来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
我的做法是这样的，染色效果还可以10%的乙醇固定10分钟，ddH2O洗一次，2分钟。
1%的硝酸脱色4分钟，ddH2O洗两次，每次1分钟。
0.2%AgNO3染色20分钟，ddH2O洗三次，每次1分钟。
NaCO3 -甲醛显色至条带出现。
我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3 -甲醛得质量很关键，我们有一次换了试剂，效果非常差银染法分以下几个程序：1、固定2、敏化3、银育4、显影5、停显此外，其间还有数步的漂洗程序。
在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。
银染法还可分为碱性银染和酸性银染法，为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。
二胺法可是指此络和物为二铵盐？您这里的胺”应为铵”。
至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还是不用的好，因为对背景不利。
对于银染的研究在80年代的electrophoresis杂志中多有报道。
小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以10度左右为宜，高则易显影过度，背景深，低则显影时间长。
请兔子兄将您的大作上传，大家学习学习有人建议在显色液中加0.02%的硫代硫酸钠来降低背景，我还未实践，不知牛兄和兔兄有无此经验?----- 还有灌胶用的玻璃板是否已经洗干净。
染色液:1g硝酸银、1升水显影液：20g氢氧化钠、0.4g碳酸钠、4ml甲醛、1升水步骤：1、将要染的胶板用水清洗10—15s2、放入染色液中摇床轻摇8—10min3、用水清洗10 —15s，再加入少许显影液摇10 —15s4、放入显影液中摇床轻摇5min左右直至条带清晰。
此种方法染岀的胶底色淡黄，带清晰。
不足之处就是不易保存，在胶干透之前最好拍照或扫描。
固定：10 %乙醇+ 0 .5 %冰醋酸3分钟染色：0 .2 % A gNO3 + 10% 乙醇+0.5% 冰醋酸12分钟清水漂洗10-15s显色：3% NaOH + 0.5% 甲醛（用时加）10min左右对比以后觉得比那个用Na2CO3显色的方法好多了，无论是花费的时间还是银染的效果。
呵，传张胶的照片佐证啊！顺便请教一下各位，为什么我跑电泳的时候靠近电极的一端总是比另一端慢呢？电压太高？你这样显色是不规范的，具体显色步骤如下：1.2.5.3 银染（1 ）固定：将粘胶的玻璃板（胶面向上）置于固定/终止液（10%冰醋酸溶液），振荡20分钟左右至指示剂颜色脱掉为止。
（2）清洗：用蒸馏水振荡洗涤凝胶3次，每次5分钟，凝胶板从水中取出后，竖直控水15秒。
（3）染色：将胶板移至染色液（1gAgNO 3溶于1L水，加入37%甲醛1.5ml （用时加）），轻摇35 分钟。
(4)显影：将染色后的凝胶板放入蒸馏水中2-3秒，迅速取出并竖直控水，随后把胶板放入预冷的显影液中(30g无水Na2CO3溶于1L水中，放在4 'C预冷，使用时加入1.5ml 37 %甲醛和200ul硫代硫酸钠(10mg/ml))。
振荡显影至条带颜色深浅合适。
(5)定影：将胶板放入第一步反应的固定/终止液中，轻摇7-8分钟。
(6)清洗：用蒸馏水清洗几分钟，取出晾干。
(7)扫描胶，找岀差异带，并进行条带统计甲醛在银染当中的作用，求教各位大侠在此发表自己的一点拙见：1,关于甲醛在银染中的作用：在显色步骤(developing)中：甲醛的作用是充当还原剂，反应式如下：HCH 0+ 2 0H -——HCOO H + H 20+2 e-，失电子而A g+ 得电子在银染步骤中(impregnation)中，其作用主要是增敏原理偶不是非常清楚，应该是加速与蛋白质结合的A g+的还原。
有文献讲到过(很老的了，找不到了，应该是ELECTROPHORESIS上8 0年代的文章，上世纪)，低浓度甲醛与蛋白质的结合是可逆的，其并不阻止蛋白质氨基酸残基与A g+结合；而高浓度甲醛与蛋白质的结合不可逆，而且造成蛋白质广范围交联(是不是有点类似于戊二醛？)，并抑制Ag+与蛋白质的结合，同时甲醛不能被释放出来用于还原。
至于究竟具体是什么机制造成与质谱不兼容，偶也不知道(不好意思的说)想说的一点是，既然两种方法都已经证明optimized for maldi-tof ，那么应该都没有问题，如果您还有狐疑, 那么，用amersham 的方法吧，毕竟人的心态都更倾向于保险硫代硫酸钠：增敏时形成潜像硝酸银：形成显色的像素点甲醛：还原剂，将银离子还原为零价银。
终止液：一种配方中的EDTA将银螯合，另一种配方的HAc改变pH，使甲醛在酸性pH下的还原能力降低, (个人经验：HAc终止反应不是很彻底，有一次我用HAc终止反应，但没有更换buffer，结果过夜放置后胶变黑了)一点看法，抛砖引玉。
一个高灵敏度的质谱相容性银染法这种方法不用戊二醛，所以是质谱相容的，而且由于甲醛用量很低，其质谱相容性高于其它的相容性银染方法；灵敏度可以与双胺法银染相近，但比双胺法稳定，基本上没有负染现象，值得一试！for 1mm SDS PAGE :固定: 50%甲醇，5%乙酸20min醇洗：50%甲醇10min水洗：ddH2O 10min敏化：0.02%硫代硫酸钠1min水洗：ddH2O 2X1min银染：冰冷的0.1%AgNO3 20min (4 °C)(我是把它扔到冰箱里染的)水洗：ddH2O 2 1min X显影：0.04% 37% 甲醛，2%无水碳酸钠显影至蛋白点清晰这一步要注意在液体变黄时及时更换新鲜的溶液，一般要换四次左右，头几次很快，第一次可能只要几秒就黄了停显：5%乙酸保存：1%乙酸对于1.5mm的胶：固定：50%甲醇，5%乙酸20min醇洗：50% 甲醇10min水洗：ddH2O 2 10min X敏化：0.02%硫代硫酸钠2min水洗：ddH2O 3X1min银染：冰冷的0.1%AgNO3 30min (4 C)(我是把它扔到冰箱里染的)水洗：ddH2O 3 1min X显影：0.04% 37% 甲醛，2%无水碳酸钠显影至蛋白点清晰约十分钟，期间注意及更换新鲜溶液, 保持溶液不变黄！停显：5%乙酸保存：1%乙酸除了银染外，全过程均需摇动。
是我用过最好的银染法，我用过双胺法，安玛西亚的方法，还有其它的一些，安玛西亚的方法加戊二醛时的灵敏度只与此方法相当，约为考染的50 - 100倍，胶体考染的10倍，锌负染的两倍。
希望大家都能重视它，多试多使用我们实验银染的方法很简单，好象大家做的效果都很好！你也可以试试。
1.50%的甲醇摇30分钟2.5%的甲醇摇10分钟3.用水快速洗3次4.用10 uMde DTT 浸泡20分钟5.用0.1%的AgNO3浸泡20分钟6.用水快速洗1次。
用显影液（取15g的无水Naco3，溶于500ml水中，临用前加250uml的37%的甲醛）洗2次，每次不超过15秒。
7.在显影液中浸泡数分钟，直至蛋白带岀现。
8.加柠檬酸终止我用的是这种方法：1.Fix gel in 50% MeOH, 5% HAc for 20 mins.2.Wash gel in 50% MeOH for 10 mins.3.Wash gel in H2O for 2 hrs.Additional washing over night will reduce backgroundstaining.4.Sensitize gel in 0.02% Na2S2O3 for 1 min.5.Wash gel in H2O for 1 min.6.Wash gel in H2O for 1 min.7.Incubate gel in cold 0.1% AgNO3 for 20 mins.8.Wash gel in H2O for 1 min.9.Change gel chamber10.Wash the gel in H2O for 1 min.11.Develop gel in 0.04% formalin, 2% Na2CO3Observe the color and change solution when the developerturns yellow. Terminate when the staining is sufficient.12.Terminate staining in 5% HAcChange the solution a couple of times13.Leave the gel at 4oC in 1% HAc前1,2,3步的时间可以延长或者缩短.我觉得以前失败的原因可能是没有掌握水洗的时间，以及与水的纯度可能有关我也做过两次，效果不好.虽然有带，但带感觉是透明的，孔道和背景是暗的.楼主，祝贺你！多指教呀!水的质量也是比较重要的，不然背景会很深的，银染时间太长的话，背景也会很深。