质粒构建流程
质粒的构建
② -半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 -半乳糖苷酶 Xgal 半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
③ lacZ的肽互补 1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸）。 N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
（2）长度
4363bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点
24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
（5）pBR322的筛选 ①双抗菌素抗性选择标记
在EcoRⅠ和HindⅠ酶剪切位点之间插入外源基因
（2）长度
（3）克隆位点
约2.7kb
10个连续的单一限制酶切位 点，位于lacZ’基因的5’端。
ห้องสมุดไป่ตู้
pUC18/19
选择标记 Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白 斑）相结合。 筛选方法
选用带有含有ampicillin和X-gal的培养基 受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）
受体菌lacZ突变（lacZ∆M15） 受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的 氨基端有缺失（缺失肽），不能形成 4聚体的活性酶，不能分解Xgal 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、 XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、 MV1184、DH5a
质粒载体生物学特征
分类 按复制类型可分为：松弛型 严紧性 按转移性可分为转移型和非转移型
质粒构建流程范文
质粒构建流程范文质粒是在分子生物学研究中常用的载体，用于将外源基因导入到真核或原核细胞中。
质粒构建是将所需基因插入质粒中的过程，通常包括以下几个步骤：选择适当的质粒骨架、获得目标基因、PCR扩增目标基因、消除酶切位点、连接、转化宿主细胞和筛选等。
下面将详细介绍质粒构建的流程。
第一步：选择适当的质粒骨架质粒骨架是质粒的基本结构，包括起始子、终止子、选择性标志物和多个酶切位点，用于插入目标基因。
在选择质粒骨架时，需要考虑质粒复制起源、复制调节元件和基因表达调节元件等因素。
第二步：获得目标基因目标基因是要插入到质粒中的外源基因，可以是从生物体中提取的DNA或通过合成DNA获得的。
在获得目标基因时，需要考虑基因的大小、序列特征和功能等因素。
第三步：PCR扩增目标基因PCR（聚合酶链反应）是一种常用的DNA扩增技术，可以通过引物在DNA模板上进行反复扩增，得到大量的目标基因的DNA片段。
在PCR扩增目标基因时，需要选择适当的引物和反应条件，并进行反应优化和扩增验证。
第四步：消除酶切位点在插入目标基因之前，需要消除质粒骨架内的酶切位点，避免再次被酶切产生的片段。
可以通过点突变、限制性内切酶切除和引物设计等方法消除酶切位点。
第五步：连接将PCR扩增的目标基因与质粒骨架连接，通常可以通过限制性内切酶切除和连接、引物设计和T4DNA连接酶等方法实现。
在连接时，需要考虑连接位点的互补性和酶切位点的匹配等因素。
第六步：转化宿主细胞质粒构建完成后，需要将其转化到适当的宿主细胞中，使其在细胞内复制和表达。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。
第七步：筛选转化后的宿主细胞需要进行筛选，以获得携带目标基因的阳性克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR鉴定等。
质粒构建是一项复杂而精细的实验技术，需要熟练的实验操作和严密的实验设计。
在实验过程中，需要注意反应体系的优化、质粒构建产物的验证和质粒的稳定性等因素。
稳转细胞系构建流程
稳转细胞系构建流程英文回答：Stable cell line generation workflow.Stable cell line generation is a crucial technique in cell biology and biotechnology. It involves introducing genetic material into a host cell to create a cell linethat stably expresses the desired gene product. This approach allows for the production of therapeutic proteins, industrial enzymes, and other valuable products.The workflow for stable cell line generation typically includes the following steps:1. Plasmid construction: The gene of interest is cloned into an expression vector, which contains elements necessary for gene expression, such as a promoter, transcription termination signal, and selection marker.2. Transfection or transduction: The expression vectoris introduced into the host cell using a variety of methods, including transfection with chemical reagents or electroporation and transduction with viral vectors.3. Selection: Cells that successfully take up and express the expression vector are selected using a suitable selection marker, such as antibiotic resistance or fluorescence.4. Clonal expansion: Individual cells are isolated and expanded to establish clonal cell lines.5. Characterization: Clonal cell lines arecharacterized for their expression levels, stability, and other relevant properties to identify those with thedesired characteristics.Stable cell lines are essential tools for basic research, drug discovery, and industrial biotechnology.They offer several advantages over transient expression systems, including sustained and high-level production ofthe desired gene product, genetic stability, andscalability for large-scale production.中文回答：稳转细胞系构建流程。
CRISPR实验流程
CRISPR/Cas9 实验流程一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1 确定待敲除基因的靶位点1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）1.3 构建表达sgRNA的质粒1.4 sgRNA活性检测1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。
1.3、构建可表达sgRNA的质粒（Precut SgRNA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒）将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
20170814 质粒构建流程
20170814质粒构建流程武汉大学Angelo一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pMSCV，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取方法一：1. RNA提取2. RNA反转录获得目的片段方法二：从韩家淮实验室索取（通常采用）具体流程：1、PCR扩增PCR程序：95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸（根据基因片段大小设定时间）35cycle 72℃5min 22℃保存注：可根据不同基因调节退火温度，延伸时间，循环数。
2、PCR产物纯化1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。
② 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65℃水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④ 弃废液，加500μl washing buffer，离心12000rpm，1min ⑤ 弃废液，加500μl PW washing buffer，离心12000rpm，1min ⑥ 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP 管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上基因名称，日期⑧电泳检测三、载体和片段双酶切（分开酶切）20μl 反应体系如下片段：PCR纯化产物16μl FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h 加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择载体：载体质粒大于1.5ug并补ddH2O至16ul FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h或以上加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择四、载体酶切产物回收和纯化片段一般不进行胶回收，只进行回收柱纯化1）一般配制1%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳20-30min（琼脂糖凝胶配制：琼脂糖凝胶（1%）30ml 琼脂糖粉0.3g 1×TAE 30ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料或溴化乙锭（有毒），混匀，倒板，插梭子。
6分钟提取质粒
6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。
提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。
以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。
2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。
3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。
4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。
5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。
6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。
7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。
8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。
9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。
10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。
这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。
实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。
vigs载体构建的基本流程
vigs载体构建的基本流程1.首先准备vigs载体构建所需的质粒。
Firstly, prepare the plasmid required for vigs vector construction.2.将目标基因插入到质粒的多克隆位点中。
Insert the target gene into the multicloning sites of the plasmid.3.通过PCR扩增目标基因。
Amplify the target gene by PCR.4.将PCR产物纯化和酶切。
Purify and digest the PCR product.5.选择合适的酶切位点和vigs载体进行连接。
Chooseappropriate restriction enzyme cutting sites and connect them with the vigs vector.6.进行连接反应。
Perform ligation reaction.7.转化大肠杆菌，分离获得重组质粒。
Transform E. coli and isolate the recombinant plasmid.8.进行PCR验证所得质粒。
Perform PCR verification of the obtained plasmid.9.测序确认目标基因已正确插入。
Sequencing to confirm the correct insertion of the target gene.10.提取质粒，获得高质量的vigs载体。
Extract the plasmid to obtain high-quality vigs vector.11.通过限制性内切酶消化鉴定重组质粒。
Identify the recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion.12.进行质粒的DNA测序。
构建质粒的基本步骤
（lnc2为例，lnc2分三段连接，GTP1、GTP2、GTP3(具体见文档“lncRNA4构建质粒的基本步骤：和lncRNA2的实验说明”中lnc2的部分)）基本流程：设计三个片段的引物（设计时注意载体pcDNA3.1的酶切位点）普通PCR 琼脂糖凝胶电泳后胶回收酶切电泳后胶回收酶连转化涂板挑单菌落（10管）摇菌提质粒酶切初步鉴定测序具体步骤：1、设计引物2、先将GTP1进行普通PCR(三个片段的模板分别为单独连接有该片段的质粒)，扩增条件聚合酶的说明书上有，50μl体系。
3、制胶（琼脂糖凝胶），将PCR产物全部上样，电泳（电泳液要新配置）45min左右后放紫外灯下，用干净刀片切出目的片段放置干净EP管，紫外灯每次照射时间不能太长。
4、用胶回收试剂盒回收，具体步骤见说明书。
5、胶回收后，用Nhe I，Kpn I两种酶将胶回收产物和载体pcDNA3.1进行双酶切5小时。
6、制胶，将酶切产物全部上样，跑电泳，胶回收（同步骤3、4）7、配酶连体系（见文档“分子生物学反应体系”），反应条件见连接酶说明书。
一般4℃过夜8、转化，（具体步骤见文档“分子生物学反应体系”）9、挑单菌落，10管，在加有氨苄的LB的试管中培养12~16h,37℃,140rpm.10、小提质粒（具体步骤见质粒提取试剂盒说明书）11、根据片段设计相关酶进行酶切鉴定，刷选出目的质粒，送去测序12、GTP1连上去后，GTP2、GTP3也与上述方法一样进行操作，只是GTP2的载体变为pcDNA3.1-- GTP1，GTP3的载体变为pcDNA3.1-- GTP1-- GTP2，同时相关的双酶切的酶也不同，GTP2片段时用Kpn I，BamHI。
GTP3片段时用BamHI，Xho I。
构建质粒原理
构建质粒原理
质粒原理是指质粒的特性和功能原理，质粒作为一种圆环状的DNA分子，常存在于细菌和其他一些生物体中。
质粒含有自
我复制的基因序列，通常可以独立于细菌染色体复制和遗传。
质粒的构建主要包括以下几个步骤：
1. DNA提取：从某个生物体中提取目标DNA序列，可以通过PCR扩增等方法得到所需基因片段。
2. 寻找适合的质粒：根据目标基因片段的大小、复制起始位点以及所需表达的细菌菌株等条件，选择合适的质粒。
3. 质粒预处理：将质粒以及目标DNA片段进行酶切，选择适
当的限制酶将目标DNA片段插入到质粒的多克隆位点上。
4. 连接：通过DNA连接酶将目标DNA插入到质粒上，得到
重组质粒。
5. 质粒转化：将重组质粒导入到一种适合的宿主细菌中，通过热激冷冻法、电穿孔法等方法使质粒在细菌中稳定复制。
6. 表达：通过适当的诱导剂或选择性培养基，促使质粒在细菌中大量复制和表达目标基因。
通过质粒构建，可以实现目标基因的研究和表达。
质粒原理的核心是质粒的自主复制和传递，通过构建重组质粒，可以将外源基因有效地导入到宿主细菌中，实现目标基因的放大和表达。
phage1质粒构建流程
phage1质粒构建流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!Phage1质粒构建的详细流程解析Phage1质粒构建是一项在分子生物学中常见的技术，主要用于基因操作和表达。
质粒构建流程
质粒构建流程质粒构建是分子生物学实验中常见的一项重要技术，它可以用于基因克隆、蛋白表达、基因编辑等多个领域。
在本文中，我们将介绍质粒构建的基本流程，希望能够帮助大家更好地理解和掌握这一技术。
第一步，设计引物。
质粒构建的第一步是设计引物。
引物是一小段单链DNA，它们的序列与目标DNA的两端相互补。
在构建质粒时，我们需要设计两对引物，分别用于扩增目标DNA的两端。
引物设计的好坏将直接影响到后续的实验效果，因此需要仔细选择引物的序列，确保其具有高度的特异性和稳定性。
第二步，PCR扩增。
设计好引物后，接下来就是进行PCR扩增。
PCR是一种体外合成DNA的方法，通过PCR扩增可以在短时间内获得大量目标DNA。
在PCR反应中，我们需要将待扩增的DNA模板、引物、DNA聚合酶和反应缓冲液混合，然后进行一系列的温度循环，最终得到目标DNA的扩增产物。
第三步，酶切和连接。
获得PCR产物后，接下来需要进行酶切和连接。
酶切是利用限制性内切酶在特定的酶切位点上切割DNA分子，从而得到特定的DNA片段。
在质粒构建中，我们通常会选择两种不同的限制性内切酶，分别用于酶切目标DNA和质粒载体。
然后将酶切后的目标DNA 片段与质粒载体连接，形成重组质粒。
第四步，转化和筛选。
最后一步是将重组质粒转化至宿主细胞中，然后进行筛选。
转化是利用化学方法或电穿孔法将质粒导入宿主细胞内，使其在细胞内进行复制和表达。
然后通过对转化后的细胞进行抗生素筛选或荧光筛选，筛选出含有目标重组质粒的细胞克隆。
总结。
质粒构建是一项复杂而又重要的实验技术，它涉及到许多分子生物学的基本原理和实验操作。
通过本文的介绍，相信大家对质粒构建的流程有了更清晰的认识。
当然，质粒构建的具体操作还需要根据实验的具体要求和目的进行调整和优化。
希望本文能够为大家在质粒构建实验中提供一些帮助和指导。
质粒构建流程1(总7页)
质粒构建流程1(总7页)质粒构建是现代分子生物学研究中非常关键的一步。
在细菌中将需要表达的外源基因通过质粒表达，已经被广泛应用于蛋白表达、基因功能分析和疫苗研究等方面。
下面我们将详细介绍质粒构建的流程。
一、质粒选择在进行质粒构建之前，首先要根据实验需求选择适合的质粒。
目前常用的质粒有pUC19、pET系列、pcDNA3.1等。
选择质粒时需要考虑以下因素：1. 质粒大小：不同质粒大小不同，承载的基因段数也不同，需要根据实验需要选择适合的大小。
2. 引物、酶切位点：质粒上的引物和酶切位点需要考虑是否符合实验设计，方便后面的操作。
3. 表达宿主：质粒表达需要宿主细胞，不同宿主细胞适合表达的质粒不同，需要根据实验需要选择适合的宿主细胞。
4. 表达标签：如果需要通过表达检测蛋白质，可以选择带有表达标签的质粒，如His 标签、Flag标签等。
5. 细菌抗性标记：质粒需要选择带有适当的细菌抗性标记，方便后续筛选。
二、PCR扩增目的基因在选择了适合的质粒之后，需要将需要表达的目的基因进行PCR扩增，以得到DNA模板，方便后续质粒构建过程。
PCR扩增需要根据实验目的设计合适的引物，引物需要选择在基因片段两端的序列上。
一般情况下，引物序列长度为18-30bp，并且需要避免序列间存在重复。
此外，引物需要考虑跨越的酶切位点，方便后续克隆操作。
PCR反应体系一般包括模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTPs等。
反应条件为94℃预变性2-5min，94℃变性30s，温度根据引物长度而定，一般为55-65℃，延伸时间1-3min，72℃合成外显子，最后72℃固定3-5min。
扩增反应可以根据需求选择合适的引物、反应体系和行程。
三、酶切质粒酶切质粒是将已有质粒经过酶切后得到的线性化质粒。
酶切需要选择适合的内切酶切割质粒，切割后的末端需要具有互补的序列，以方便后续的连接操作。
酶切反应需要同时加入酶和反应缓冲液，反应条件需要根据不同酶而定。
质粒构建流程
质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。
aav药物生产工艺
aav药物生产工艺
AAV（adeno-associated virus）是一种常用于基因传递的病毒载体，在药物生产中主要用于基因治疗和疫苗开发。
下面是AAV药物的生产工艺简要流程：
1. AAV载体构建：首先，需要将目标基因插入AAV载体的基因组中。
这通常通过分子克隆技术实现，将目标基因与AAV载体的基因组连接，并经过酶切、连接和转化等步骤。
2. AAV质粒制备：将构建好的AAV载体转化至适当的宿主细菌中，经培养和扩增，以获得大量的AAV质粒。
3. 产生AAV病毒颗粒：将AAV质粒与AAV辅助质粒（helper plasmid）一起转染至滴度合适的细胞中（如HEK293细胞），使细胞表达所需的AAV蛋白。
接着，用适当的方法促使细胞产生并释放AAV病毒颗粒。
4. AAV病毒精制：使用离心、滤膜、超速离心等技术对细胞培养上清液进行处理，去除细胞残渣、杂质和其它不需要的物质，纯化得到AAV病毒精制液。
5. AAV病毒液体冻干：如果需要长期存储或运输，可以选择冻干（lyophilization）技术对AAV病毒精制液进行冻干处理，得到AAV病毒液体冻干制剂。
6. AAV药物的制剂和灭活：根据具体的药物类型和使用目的，对AAV病毒进行制剂处理，如添加适当的缓冲液、稳定剂、灭活剂等，并进行必要的灭活处理，以确保药物的稳定性和有效性。
以上是AAV药物生产的主要工艺流程，不同制药厂商和具体药物的生产工艺可能存在差异，需要根据具体需求和合规要求进行调整和优化。
质粒的工艺流程
质粒的工艺流程质粒是一种重要的生物学工具，用于在基因工程中携带和传递外源的DNA序列。
工艺流程是指质粒的制备和改造过程，涉及到质粒的提取、限制酶切、连接、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍质粒的工艺流程。
1. DNA提取：质粒通常从菌株中提取。
首先，将选定的菌株进行培养扩增，获得大量的细菌。
然后，将培养液离心，以获得含有细菌和质粒的沉淀。
利用化学方法或商用DNA提取试剂盒可以提取质粒DNA。
2. 限制酶切：质粒DNA通常被限制酶切为片段，以便进行后续的连接和分析。
限制酶是一种酶，可以识别和切割特定的DNA序列。
将限制酶加入质粒DNA 溶液中，按照酶切反应条件进行反应。
酶切反应通常在适当的温度和酶缓冲液下进行。
酶切反应后，通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA片段的分离和检测。
3. 连接：在限制酶切的质粒DNA片段和外源DNA片段之间进行连接。
这一步通常需要将两者暂时性地“黏合”在一起，然后使用DNA连接酶将它们永久性地连接。
连接方法有多种，常用的是T4 DNA连接酶，具体方法是将质粒DNA 片段和外源DNA片段与连接酶和连接缓冲液一起反应，通常在适当的温度下进行。
4. 转化：连接后的质粒需要转移到宿主细胞中进行进一步的繁殖和表达。
转化是将质粒DNA导入到细胞中的过程。
主要有三种转化方法：自然转化、电转化和化学转化。
其中，自然转化是将质粒DNA和细胞混合，利用细胞壁的微小孔洞和质粒DNA的负电荷相互作用，使DNA进入细胞。
电转化是利用电场刺激，使质粒DNA通过细胞壁和细胞膜进入细胞。
化学转化则是通过特定的化学条件使细胞膜通透性增加，从而实现质粒DNA导入细胞。
5. 筛选：在转化后，需要对细菌进行筛选，以确定哪些细菌取得了质粒。
通常利用抗生素筛选，即在培养基中添加抗生素，只有带有抗生素抗性基因的细菌才能存活下来。
在含抗生素的培养基中生长的细菌通常被认为是成功转化并带有外源DNA的细菌。
此外，还可以使用其他标记方法，如荧光蛋白标记、酶标签标记等来筛选质粒。
植物载体构建流程
植物载体构建流程植物载体构建是个还挺有趣的事儿呢，咱就像搭积木一样把各种元素组合起来，让植物能按照我们想要的方式生长或者表达特定的基因。
一、载体选择。
我们得先挑个合适的载体，就像给植物找个合适的房子一样。
这载体有很多种哦，像质粒载体就比较常用。
它就像一个小小的工具箱，里面有各种工具（不同的功能元件）。
我们要根据自己的目的来选，要是想把某个基因送到植物细胞里去，就得选那种能在植物细胞里好好工作的质粒载体。
比如说，有的质粒是专门为双子叶植物设计的，有的呢又更适合单子叶植物。
这就好比不同的房子适合不同的住户，可不能选错啦。
二、目的基因获取。
接下来就是找我们想要的那个“小秘密”——目的基因。
这目的基因可以从很多地方来，有时候是从其他植物里发现的一个特别厉害的基因，能让植物抗虫或者抗旱啥的。
我们就像寻宝一样把这个基因找出来。
找的方法也有不少哦，可以用基因文库筛选，就像是在一个装满各种基因宝贝的大仓库里找我们要的那个小宝贝。
还有一种是通过PCR（聚合酶链式反应）来扩增这个基因，这就像是用复印机把这个基因复印很多份一样，让我们有足够的量可以用。
三、基因连接。
把目的基因找到后，就要把它和我们选好的载体连接起来啦。
这就像是给小宝贝找个合适的座位，让它能稳稳地待在载体这个小房子里。
我们会用到一些酶，比如说限制性内切酶，这个酶可神奇了，它就像一把小剪刀，能在载体和目的基因的特定位置剪开，然后再用DNA连接酶把它们像缝衣服一样缝起来。
这过程得小心翼翼的，要是连接错了地方，那可就麻烦啦，就像把东西放错了口袋一样。
四、转化。
连接好之后呢，就要把这个带着目的基因的载体送到植物细胞里去啦。
这就像是给植物送个小礼物。
转化的方法有很多种哦。
最常见的一种是农杆菌介导转化法。
农杆菌就像是一个小邮差，它天生就有把自己身上带着的一些东西送到植物细胞里的能力。
我们就把构建好的载体放到农杆菌里，然后让农杆菌去感染植物细胞，这样载体就跟着进去了。
fosmid 质粒提取流程及方法
Fosmid质粒提取方法及流程细菌培养1）按照流程构建fosmid，转染后的克隆约2.0ml，加入等体积的LB培养基37度，180rpm培养过夜。
2）吸取过夜培养物2.0ml用于加甘油保存，另外2.0ml接种到10mlLB（含氯霉素）中，加入诱导剂阿拉伯糖（终浓度为0.1mg/ml），250rpm培养超过5小时（过夜）（菌体要足够浑浊），小样法提取质粒。
注意：此处用50ml离心管，保证一定的空气。
质粒提取：1、菌液分装：取2.0ml菌体于Ep管，12000rpm离心30秒，弃上清液；2、加0.lml溶液I(50mM葡萄糖，10mM EDTA pH8.0，25mM Tris-HCl pH8.0)充分混合；3、加入0.2ml溶液II(0.2 N NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min ；4、加入0.15ml溶液III(3M KAc，11.5%冰乙酸)，轻轻翻转混匀，置于冰浴15 min ；5、以12000rpm离心5min，取上清液于另一新Ep管；6、加入等体积的苯酚-氯仿，混匀后12000rpm离心5min；7、取上清液于另一新Ep管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min，12000rpm，4℃离心10min。
8、 吸掉上清，加1ml 70%乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，之后，12000rpm，4℃离心3min。
9、 吸掉上清，然后加1ml无水乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，12000rpm，4℃离心3min。
倒掉上清，室温放置约30min至乙醇完全挥发干净。
10、每管加入20µl TE溶解沉淀（含Rnase，终浓度20ng/ul），用手轻弹管壁，室温1h消化。
注：质粒提取完后用0.6%琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小及浓度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。
14）-20℃保存2.RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10μl体系）② 5×gDNA eraser buffer 2μl① gDNA eraser 1μlTotal RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)⑥ RNase free water 3μlPCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20μl体系）④ 5×primerScript buffer 2 4μl③ primerScript RT enzyme mix I 1μl⑤ RT primer mix 1μl⑥ RNase free water 4μl1）反应液10μlPCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50μl5×PS buffer 10μldNTP 4μldH2O 32.5μlPrimerstar 0.5μlcDNA 1μl(可变)R-primer 1μlF-primer 1μl点样：5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer，4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。
②转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。
③弃废液，加700μl DNA wash buffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。
④弃废液，重复③⑤弃废液，空管离心13000g，1min⑥柱子放入新EP管，加10-20μl Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min⑦电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。
②加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次④弃废液，加300μl binding buffer（XP2），离心10000g，1min⑤弃废液，加700μl SPW washing buffer，离心10000g，1min⑥重复⑤⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管⑧加入30-50μl elution buffer 于膜上，室温孵育1min ，离心13000g ，1min⑨ 电泳检测三、双酶切30μl 反应体系如下：PCR 纯化产物 15μl10×M/L/K buffer 3μl3dH2O 10μl酶A 1μl酶B 1μl反应条件：takara 酶30℃水浴1h →65注：buffer 类别依使用的酶具体选择，见附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl2）酶切产物液相纯化3）20μl 连接体系（皆可）PCR 产物 5μlpcDNA3.1 2μl10×T4buffer 2μlT4 ligase 1μl3dH2O 10μlPCR 仪中进行：22℃，30min →4注：连接产物-20℃可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌EP 管、LB 空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42℃，45s ，冰浴1min5）加900μl LB 空培养基，摇菌150rpm ，37℃，1h6）浓缩离心13000rpm ，1min ，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100μl ）7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h六、菌落PCR1）以rTaq 酶50μl 体系配制PCR 反应液，每个PCR 管分装15μl ，体系如下：3dH2O 35.7μl PCR 程序：95℃ 5min10×buffer 5μlMgCl2 3μldNTP 4μlrTaq 0.3μlR-primer 1μlF-primer 1μl2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。
新划的板37℃倒置培养12-16h。
3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。
七、测序1.摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37℃。
250rpm摇菌12-16h2.送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序3.比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。
（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。
1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl 80%灭菌甘油。
2）再加入800μl 箘液，轻混匀。
3）液氮冻存。
（一个基因冻2管即可）九、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。
试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min2）弃上清，加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀3）加250μl solution II，倒置轻混匀，孵育2min。
（整个裂解反应不超过5min）4）加入250μl solution III，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。
5）室温离心13000g，10min6）上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管)，室温离心10000g，1min7）弃废液，加500μl buffer HB，室温离心10000g，1min8）选择性步骤：重复第7步9）弃废液，空管室温离心13000g，2min10）柱子转入新EP管，加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min 11）室温离心13000g，1min12）提取的质粒-20℃保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：1.菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h4）检测箘液OD600≤ 0.5（0.3-0.4）2.感受态制备准备：0.1M CaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。
步骤：1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min2）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min4）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀6）1.5mlEP管分装，每管分装100μl ，液氮冻存。
试剂配制：1.琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉0.6g1×TAE 50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料，混匀，倒板2.电泳缓冲液TAE（50×）2mol/L tris-碱242g1mol/L 冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0) 18.622g二蒸水至1L用NaOH调节pH至8.6，常温储存。
用时稀释成1×溶液使用。
3.LB培养基Yeast extract（酵母提取物）1gTryptone 2gNaCl 2gAgar powder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。