b第二节：细胞组分的分析方法
细胞生物学第三章细胞生物学研究方法知识讲解
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
细胞生物学教案(全面版)
细胞生物学教案目录前言第一章绪论第二章细胞结构概观第三章研究方法第四章细胞膜第五章物质运输与信号传递第六章基质与内膜第七章线粒体与叶绿体第八章核与染色体第九章核糖体第十章细胞骨架第十一章细胞增殖及调控第十二章细胞分化第十三章细胞衰老与凋亡前言依照高等师范院校生物学教学计划，我们开设细胞生物学。
一、学科本身的重要性要最终阐明生命现象，必须在细胞水平上。
细胞是生命有机体最基本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上阐明各种生命现象。
世界著名生物学家Wilson（德国人）曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找”。
二、学科发展特点细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。
它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学发展的前沿，又是生命科学赖以发展的基础。
三、欲达到的目的通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构发展的需求，也是为考研做准备。
本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。
参考资料1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年（第四版）；1980年（第七版）《细胞和分子生物学》2 Avers，“Molecular Cell Biology”， 1986年3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell”，1989年4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年（第一版）；1990年（第二版）“Molecular Cell Biology”5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社7 翟中和，细胞生物学基础，1987年，北京大学出版社8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；2000年由科学出版社再版9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，北京师范大学出版社10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，2000年再版11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》，12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起（1—3卷），北师大出版社13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社15徐承水，《细胞超微结构研究》2000，中国国际教育出版社学术期刊、杂志国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol.国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等第一章绪论教学目的 1 掌握本学科的研究对象及内容；2 了解本学科的来龙去脉（发展史及发展前景）；3 掌握与本学科有关的重大事件和名词。
细胞生物学翟中和完美版笔记
细胞生物学教案. 第一章绪论第一节细胞生物学研究内容与现状一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科1.细胞学（Cytology）：是研究细胞的结构、功能和生活史的科学2.细胞生物学（Cell Biology）：运用近代物理学和化学的技术成就以及分子生物学的概念与方法，从显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能及各种生命活动规律。
二、细胞生物学的主要研究内容1. 细胞核、染色体及基因表达基因表达与调控是目前细胞生物学、遗传学和发育生物学在细胞和分子水平相结合的最活跃领域。
2.生物膜与细胞器的研究膜及细胞器的结构与功能问题（“膜学”）。
3. 细胞骨架体系的研究胞质骨架、核骨架的装配调节问题和对细胞行使多种功能的重要.性。
4. 细胞增殖及调控控制生物生长和发育的机理是研究癌变发生和逆转的重要途径（“再教育细胞”）。
5. 细胞分化及调控一个受精卵如何发育为完整个体的问题。
（细胞全能性）6 .细胞衰老、凋亡及寿命问题。
7. 细胞的起源与进化。
8. 细胞工程改造利用细胞的技术。
生物技术是信息社会的四大技术之一，而细胞工程又是生物技术的一大领域。
目前已利用该技术取得了重大成就（培育新品种，单克隆抗体等），所谓21世纪是生物学时代，将主要体现在细胞工程方面。
三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域1. 染色体DNA与蛋白质相互作用关系；2. 细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控；3 .细胞信号转导的研究；4 .细胞结构体系的装配。
第二节细胞生物学发展简史一细胞生物学研究简史1.细胞学创立时期 19世纪以及更前的时期（1665—1875），是以形态描述为主的生物科学时期；2. 细胞学经典时期 20世纪前半世纪（1875—1900），主要是实验细胞学时期；3. 实验细胞学时期（1900—1953）；4. 分子细胞学时期（1953至今）。
总过程概括为：细胞发现→细胞学说建立→细胞学形成→细胞生物学的发展（1665）（1838—1839）（1892）（1965）R.Hooke Schleiden、Schwann Hertiwig DeRobertis二、细胞的发现（discovery of cell）以及细胞学说的建立及其意义（The cell theory）1.1838年，德国植物学家施莱登（J.Schleiden）关于植物细胞的工作，发表了《植物发生论》一文（Beitrage zur Phytogenesis）.2.1839年，德国动物学家施旺（T.Shwann）关于动物细胞的工作，发表了《关于动植物的结构和生长一致性的显微研究》一文，论证了所有动物体也是由细胞组成的，并作为一种系统地科学理论提出了细胞学说。
第三章细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法本章内容提要：第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术（一）普通光学显微镜1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。
3. 分辨率：指分辨物体最小间隔的能力。
（二）荧光显微镜Fluorescence microscope*特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；*有两个特殊的滤光片；*照明方式通常为落射式。
*用于观察能激发出荧光的结构。
用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
（三）激光共聚焦扫描显微境Laser confocal scanning microscope, LCSM*用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
*能显示细胞样品的立体结构。
*分辨力是普通光学显微镜的3倍。
*用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。
（四）相差显微镜*把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
*环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。
*相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
原理用途：观察未经染色的玻片标本（五）微分干涉差显微镜Differential interference contrast microscope （DIC）*1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。
标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
二、电子显微镜1、电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LM 200nm 可见光玻璃透镜不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差（400-700）和颜色变化100nm 紫外光（约200nm) 玻璃透镜不要求真空利用样品对电子的散射TEM0.1nm 电子束（0.01-0.9）电磁透镜要求真空和透射形成明暗反差2、原理*以电子束作光源，电磁场作透镜。
翟中和细胞生物学笔记-全-(整理打印版)
第一章绪论生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系，而细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动。
细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要内容。
核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。
细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学)相互渗透与交融是总的发展趋势。
“细胞学说”的基本内容认为细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成；每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益；新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。
学习细胞生物学的注意点•抽象思维与动态观点•结构与功能统一的观点•同一性(unity)和多样性(diversity)的问题•细胞生物学的主要内容：基本概念与实验证据；细胞器的动态特征；化学能的产生与利用；细胞的活动及其调控等•实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室——Whatweknow//Howweknow.细胞是生命活动的基本单位一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位细胞是有机体生长与发育的基础细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性没有细胞就没有完整的生命细胞概念的一些新思考细胞是多层次非线性的复杂结构体系细胞具有高度复杂性和组织性细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体细胞完成各种化学反应；细胞需要和利用能量；细胞参与大量机械活动；细胞对刺激作出反应；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。
细胞能进行自我调控；繁殖和传留后代；细胞的基本共性所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。
所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。
细胞生物学b第二节：细胞组分的分析方法
第二节：细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物（一）差速离心⏹特点：⏹介质密度均一；⏹速度由低向高，逐级离心(多次离心)⏹用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
⏹沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。
⏹可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
（二）密度梯度离心：⏹用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
⏹类型：速度沉降、等密度沉降。
（区别看PPT）⏹常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
⏹分离活细胞的介质要求：⏹1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；⏹2）PH中性或易调为中性；⏹3）浓度大时渗透压不大；⏹4）对细胞无毒。
二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法属于生化内容，自行补脑三、细胞内特异核酸序列的定位与定性原位杂交技术：利用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。
⏹Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。
⏹将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。
四、放射自显影术⏹用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
⏹原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。
⏹一般用14C和3H标记。
常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。
五、流式细胞仪和细胞电泳（1）流式细胞仪⏹用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
细胞生物学考试大纲整理
第一章绪论第一节细胞生物学研究的内容和现状1.了解细胞生物学研究的大致内容和不同层次（1）细胞核、染色体以及基因表达的研究；（2）生物膜与细胞器的研究；（3）细胞骨架体系的研究；（4）细胞增殖及其调控；（5）细胞分化及其调控；（6）细胞的衰老与凋亡；（7）细胞的起源进化；（8）细胞工程2.了解细胞生物学研究的总趋势细胞生物学与分子生物学相互渗透与交融是总的发展趋势。
无论是细胞结构与功能的深入研究，还是对细胞重大生命活动规律的探索，都需要用分子生物学的新概念与新方法，在分子水平上进行研究。
换句话说，细胞分子生物学或分子细胞生物学是今后相当一段时间的主流学科方向。
第二节细胞学与细胞生物学发展简史1.了解细胞学与细胞生物学发展简史，特别是细胞学说的内容和意义以及当前细胞学主要发展主要方向细胞与细胞生物学发展简史：从细胞的发现到细胞生物学的建立，大约经历了300多年的时间，这段历程一般分为以下五个阶段：（1）细胞的发现；（2）细胞学说的建立；（3）细胞学说的经典时期；（4）实验细胞学时期；（5）细胞生物学学科的形成与发展。
英国学者胡克于1665年第一次描述了植物细胞的结构，细胞学说是1838－1839年间由德国的植物学家施莱登和动物学家施旺所提出，直到1858年才完善。
它是关于生物有机体组成的学说，主要内容是：（1）细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来，即生物是由细胞和细胞的产物所组成；（2）所有细胞在结构和组成上基本相似；（3）生物体是通过其细胞的活动反映其功能；（4）新细胞是由已存在的细胞分裂而来的；（5）生物的疾病是因为其细胞机能失常。
恩格斯对细胞学说的评价是：十九世纪自然科学的三大发现之一。
细胞学说、进化论、遗传学三大定律被称为现代生物学的三大基石，而细胞学说又是后二者的基石。
细胞学说的重要意义：它从细胞水平提供了有机界统一的证据，证明动植物有着细胞这一共同的起源，动植物的产生、成长和构造的秘密被揭开了，从而为十九世纪自然哲学领域中辩证唯物主义战胜形而上学的唯心主义，提供了一个有力的证据，为近代生物科学的发展接受有机界进化的观念准备了条件。
细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法包括密度梯度离心法、贴壁培养法、超速离心法、层析法和电泳法。
密度梯度离心法是根据细胞密度的不同，在高速离心机中经过长时间离心，使细胞分层沉淀，形成密度梯度。
根据密度梯度的不同，可以将不同密度的细胞分开。
这种方法分离效果好，可以获得较为纯的细胞，适用于大多数细胞类型的分离。
但这种方法需要使用大型设备，操作也比较复杂，需要专业人员操作。
贴壁培养法是根据细胞贴壁生长速度的不同，将不同种类的细胞分离。
这种方法需要在培养皿中加入适量的培养液，然后将待分离的细胞悬液加入培养皿中，让其在培养液中贴壁生长。
由于不同种类的细胞贴壁生长速度不同，因此经过一定时间的培养，可以观察到不同种类的细胞在培养皿中形成的“岛屿”状分布。
根据不同种类的细胞形成的“岛屿”状分布的不同，可以将它们分离出来。
此外还有超速离心法、层析法和电泳法等方法。
这些方法各有特点，可以根据实验需求选择合适的方法进行细胞组分的分级分离。
细胞生物学的深入研究方法
等密度沉降：不同密度组分。连续密度高浓度介质离心
力场长时间作用。十分灵敏，可分辨到同位素级别。（连续
梯度）
细胞生物学的深入研究方法
差速离心 密度梯度离心
细胞生物学的深入研究方法
二、 细胞成分显示方法
原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。
细胞生物学的深入研究方法
因此利用此技术可以： 1）对细胞表面或细胞内部的抗原进行定位；2）了解
抗体合成过程中的动态变化；3）抗原—抗体复合物结构 细节；4）鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化等。
声波粉碎、强制过滤、研磨等； 离心处理； 收集分析。
细胞生物学的深入研究方法
沉降系数（Sedimentation Coefficient） 颗粒在离心场中的沉降速度的大小与颗粒大小、形状、密
度、离心力、悬浮介质的密度和粘度有关。单位离心力场中溶 质分子的沉降速度称为沉降系数通过下式计算：
S=dx /dt/ω2x x：颗粒到转头中心距离（cm）；. ω：角速度（弧度/秒）； dx/dt：沉降速度；S：沉降系数（单位：秒）。
各种颗粒都有一定的沉降系数，习惯上（规定）把10-13秒 作为一个沉降系数单位，简写成S（Svedberg unit，斯维得伯格 单位，瑞典人，1926年设计超速离心机，因此获诺贝尔奖。）
如某一蛋白质的沉降系数为5S，说明它的沉降系数实际上 是5×10-13秒，S值越大，说明颗粒的沉降速度越大。
细胞生物学的深入研究方法
细胞生物学的深入研究方法
一）化学显示剂法 基本原理： 利用某些化学物质和某些细胞成分发生化学结合， 从而显示出一定的颜色，进行定性和定位研究的方法。 1、Feulgen reaction 酸水解去除RNA，并除去嘌呤，醛基与 希夫（schiff）试剂作用形成紫红色。
细胞组分的分析方法
细胞组分的分析方法一、超速离心技术（P64）离心技术原理：不同的细胞器具有不同的密度和体积，因此，可以利用离心方法加以分离和纯化。
1、差速离心（differential centrifugation）利用不同的离心速度产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。
适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。
多次离心达到纯化的目的。
2、密度梯度离心（P65）①速度沉降——分离密度接近大小不一的组分②等密度沉降——分离不同密度的组分将介质形成一涵盖所有组分密度的密度梯度，不同的样品由于其密度差异，在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动，从而实现分离的目的。
速度沉降和等密度沉降的比较二、组织化学和细胞化学（P65）利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合，来判断核酸、蛋白质（酶）、糖类、脂类在细胞中的分布和含量。
福尔根（Feulgen）反应——显示DNA格莫瑞（Gomori）反应——显示碱性磷酸酶三、特异蛋白抗原的定位与定性P66原理：抗体能够自行识别并结合对应的抗原目的：检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。
（一）免疫荧光技术（二）免疫电镜技术人成纤维细胞中肌动蛋白束（800×）BHK细胞中的微管蛋白（500×）四、细胞内特异核酸序列的定位和定性研究对象：细胞内特异核酸（DNA或RNA）目的：定位、定量分析方法：原位杂交（in situ hybridization，ISH）以目标核酸的互补序列为探针，对细胞或者组织标本进行杂交处理，使目标核酸可视呈现的技术。
是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。
构建DNA分子物理图谱光谱核型分析（spectral karyotype，SKY）SKY of Human五、放射自显影研究生物大分子（略）六、定量细胞化学分析技术P69细胞分选（cell sorting）：是细胞生物学中较新技术，是利用流式细胞仪（flow cytometery，FCM）对细胞或者其他生物微粒（如染色体）进行分选，并对其进行定量分析（大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等）的技术。
细胞融合
第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术教学要求：了解和掌握细胞生物学研究领域所使用的实验技术的基本原理和应用。
1．显微镜技术（1）光学显微镜技术：普通复式显微镜技术，荧光显微镜技术与现代图像处理技术，激光共焦点扫描显微镜技术，相差和微分干涉显微镜技术，录像增差显微镜技术。
（2）电子显微镜技术：原理与基本知识，样品制备技术，扫描电镜技术，冷冻蚀刻技术。
（3）扫描隧道显微镜技术：特点与优越性。
2．细胞组分的分析方法。
（1）超速离心技术。
（2）细胞内大分子的显示方法。
（3）细胞内特异蛋白抗原和核酸序列的定位与定性：免疫荧光技术，免疫电镜技术和原位杂交技术。
（4）细胞内生物大分子的合成动态：同位素标记技术结合放射自显影。
（5）定量细胞化学分析技术：显微分光光度测定技术，流式细胞仪技术。
3．细胞工程：动物细胞培养、细胞融合（细胞杂交技术）、单克隆抗体技术、细胞拆合与显微操作技术。
4．分子生物学技术。
一、细胞培养技术1．细胞培养（cell culture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。
IN VITRO:（离体的，即在玻璃容器中）用培养细胞进行的实验IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验原代培养(primary culture):直接从生物体获取细胞进行培养。
传代培养(secondary culture)：将原代培养的细胞连续以一定比例扩大培养。
2．细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。
3．细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。
4．克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
细胞生物学的研究方法(1)
编辑课件 光学显微镜和电子显微镜下的细胞3结构
2、分辨率(resolution)
R = 0.61λ/n Sinα n=介质的折射率 ；空气为1. 油为1.5 α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1 λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明
DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope）
利用的偏振光 ;标本可略厚，折射率差别更大
基因注入、核移植、转基因等的显微操作
编辑课件
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（八）、倒置显微镜
倒置显微镜特点: 物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞 具有相差物镜
1）自发荧光
细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可 发荧光
2）诱发荧光
一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发
荧光
编辑课件
8
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
编辑课件
9
2、荧光显微镜和普通显微镜的区别
1）照明方式： 通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上
（四）、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 反差增大，分辨率提高 观察未经染色的活体或胶体粒子
编辑课件
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（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）
荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖 作用：可观察未经染色的标本和活细胞
细胞生物学考研笔记
第一章绪论一、细胞生物学概况二、细胞生物学简史三、细胞生物学研究内容四、细胞生物学学习方法一、细胞生物学概况(P1)1、什么是细胞生物学？细胞生物学（cell biology）是研究细胞基本生命活动规律的科学，是现代生命科学的重要基础学科之一；它从显微、亚显微和分子三个层次以动态的观点来研究细胞和细胞器结构与功能，探讨细胞的各种生命活动规律。
2、细胞是所有生物体（不包括病毒）一切生命活动的基本单位具有自我复制、自我装配和自我调控的能力，通过与外界物质和信息交流，保持自身动态平衡。
病毒、生物大分子和细胞的关系“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”3、细胞生物学分支细胞形态学细胞遗传学细胞化学细胞生理学细胞分类学细胞免疫学二、细胞生物学发展简史（P8）五个阶段1、细胞的发现1665年Robert Hooke（英）(30×)“cellar”——cell1677年Leeuwen Hoek（荷兰）（300×）活细胞观察，第一次观察到原生动物、人类和动物的精子。
2、细胞学说的建立1838－1839 Schleiden和Schwann（德）分别提出了细胞学说（cell theory）；基本内容:所有生物都是由一个或者多个细胞构成的；细胞是生命的基本单位。
1858年Rodulf Virchow（德）对细胞学说进行了重要补充：细胞只能来自细胞。
意义：19世纪自然科学三大发现之一；现代生物学三大基石之一。
3、细胞学经典时期——19世纪的后25年(P9)原生质理论的提出：protoplasm1861年，Max Schultze：有机体的单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体是相似的。
细胞分裂的研究：有丝、减数分裂；重要细胞器的发现。
4、实验细胞学及发展（1900－1953）(P10)experimental cytology——用实验的手段研究细胞学的问题,即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。
细胞生物学研究方法之细胞组分研究
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
基因组原位杂交大小麦杂交后代中大麦遗传物质的鉴定
以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布
五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内 的合成动态
原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一 段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使 乳胶感光，对细胞内生物大分子进行定性、定位和半定量研
用途：分离密度不等的颗粒。 特点：
介质密度高，斜率大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。
原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离
心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到
平衡，从而将不同密度的成分分离。
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
沉降系数以每单位重力的沉降时间表示：1～200×10-13 秒，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒，
差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数 不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。
沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分 离。沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开。 如血红蛋白的沉降系数约为4S。大多数蛋白质和核酸的沉 降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之 间，多核糖体在100S以上。 样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不 断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状 不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒 的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心， 分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所 需要的物质。
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第二节：细胞组分的分析方法
一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
（一）差速离心
⏹特点：
⏹介质密度均一；
⏹速度由低向高，逐级离心(多次离心)
⏹用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
⏹沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白
体。
⏹可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
（二）密度梯度离心：
⏹用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质
的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
⏹类型：速度沉降、等密度沉降。
（区别看PPT）
⏹常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
⏹分离活细胞的介质要求：
⏹1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
⏹2）PH中性或易调为中性；
⏹3）浓度大时渗透压不大；
⏹4）对细胞无毒。
二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法
属于生化内容，自行补脑
三、细胞内特异核酸序列的定位与定性
原位杂交技术：利用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。
⏹Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA
或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。
⏹将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。
四、放射自显影术
⏹用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、
作用机理、作用部位等等。
⏹原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，
涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。
⏹一般用14C和3H标记。
常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基
酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。
五、流式细胞仪和细胞电泳
（1）流式细胞仪
⏹用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
⏹原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在
激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送
入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离
纯度可达99%。
包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。
（2）细胞电泳：
⏹原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳
动。