紫花苜蓿基因组测序及分析
紫花苜蓿冷胁迫转录组分析及MsMYB144基因的功能鉴定
紫花苜蓿冷胁迫转录组分析及MsMYB144基因的功能鉴定紫花苜蓿冷胁迫转录组分析及MsMYB144基因的功能鉴定引言紫花苜蓿（Medicago sativa L.）一直以来都是重要的牧草植物，广泛应用于畜牧业。
然而，在低温环境下，紫花苜蓿容易受到冷胁迫的影响，导致其生长和产量受损。
因此，深入研究紫花苜蓿在冷胁迫条件下的应对机制对于提高紫花苜蓿的抗寒性和产量具有重要意义。
方法本研究采用转录组学方法，结合生物信息学技术，对紫花苜蓿在低温条件下的基因表达谱进行了分析。
首先，我们将冷胁迫处理组和对照组中的紫花苜蓿植株分别收集并提取总RNA。
随后，使用Illumina HiSeq 2000测序平台进行RNA测序，获得高质量的测序数据。
将测序数据进行质控和去除低质量序列后，利用SOAPaligner软件将测序reads比对到紫花苜蓿参考基因组上。
最后，根据比对结果，分析不同基因在冷胁迫处理组和对照组中的表达差异。
结果结果显示，冷胁迫处理会导致大量基因的表达发生改变。
与对照组相比，冷胁迫处理组中有许多基因的表达下调，表明冷胁迫对紫花苜蓿的基因表达起到抑制作用。
同时，我们还发现一组特定的基因在冷胁迫条件下表达水平显著上调。
通过功能富集分析发现，这些上调表达的基因主要参与了诸如脱水、离子平衡、ROS清除和抗氧化等生物学过程，这可能是紫花苜蓿抵御冷胁迫的策略之一。
为进一步研究冷胁迫应答机制，我们选取了其中一个上调表达的基因，命名为MsMYB144进行功能鉴定。
首先，我们利用基因家族分析和序列比对的方法对MsMYB144进行了特征分析。
结果显示，MsMYB144属于MYB转录因子家族，具有MYB 结构域，推测其可能参与调控紫花苜蓿的冷胁迫响应过程。
接着，我们利用冷胁迫处理和外源ABA处理来研究模拟冷胁迫条件下MsMYB144的表达变化。
实验结果显示，在冷胁迫和ABA 处理下，MsMYB144的表达水平均显著上调，这进一步证明了MsMYB144可能在紫花苜蓿的冷胁迫响应中发挥重要作用。
全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用
全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用近年来，随着DNA测序技术的飞速发展，全基因组重测序技术越来越广泛应用于各种生物种的基因组研究中。
作为一种重要的草坪植物，紫花苜蓿因其在牧草生产中的重要性而备受关注。
全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中也得到了广泛的应用，并成为推动紫花苜蓿基因组研究进程的重要手段。
一、全基因组重测序技术简介全基因组重测序技术是指对DNA样本进行高通量测序，得到完整的个体基因组序列。
与Sanger测序技术相比，全基因组重测序技术具有高通量、高准确性、高覆盖度和低成本等优点。
其中，高覆盖度是全基因组重测序技术的重要特征。
通过多次测序，可以得到高度重叠的DNA序列，从而消除测序误差，提高数据可靠性。
全基因组重测序技术在遗传疾病研究、生物进化研究、种群遗传学研究等方面发挥了重要作用。
二、全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用1.确定紫花苜蓿基因组组成全基因组重测序技术可以全面揭示紫花苜蓿基因组组成，包括基因数量、长度、可变剪接以及重复序列等特征。
通过这些特征，可以进一步了解紫花苜蓿基因组的基本特征，为进一步研究其基因功能和进化提供基础数据。
2.揭示紫花苜蓿种群遗传学特征全基因组重测序技术可以揭示紫花苜蓿种群遗传学特征，如种群分化、基因流、基因多样性等。
紫花苜蓿广泛分布于全球各地，因而在不同地区的紫花苜蓿种群之间存在不同的遗传结构和遗传差异。
通过全基因组重测序技术，可以比较各种群之间的遗传差异，为紫花苜蓿的种质分类和遗传改良提供依据。
3.挖掘紫花苜蓿基因组特征和功能全基因组重测序技术可用于挖掘紫花苜蓿基因组特征和功能，并鉴定关键基因。
通过比对序列和功能注释，可以快速鉴定出紫花苜蓿基因组中的基因家族、调控因子、信号传导通路等关键功能元件，从而为紫花苜蓿基因功能研究提供基础数据。
4.开展基因组选择研究全基因组重测序技术可用于开展基因组选择研究，并筛选出重要基因。
通过比较不同种群之间的基因表达差异，可以筛选出与环境适应性和产量性状相关的基因。
最新 紫花苜蓿转基因的研究进展分析-精品
紫花苜蓿转基因的研究进展分析紫花苜蓿属于一种豆科多年生牧草，具备高产量、高营养、适应力强、适口性好等特点，具有悠久的栽培历史，得到广泛的应用[1-2]。
紫花苜蓿不单单是一种饲料作物，它还具有保持水土、改良土壤、保护生态环境的作用。
传统的栽培方法具有时间长，产量低，成本高的局限性，无法满足现今社会对于育种多元化的需求。
随着转基因技术的不断发展，植物转基因技术在紫花苜蓿的遗传改良中具有极高的应用价值，从根本上加大育种进程，提高生产产量以及质量。
1 电击法该方法主要是通过对植物物原生质体具有整合以及表达外源 DNA 的能力的有效利用，对植物细胞进行脱壁，借助电机所释放出来的电脉冲，对植物细胞进行刺激而产生原生质体细胞膜出现微孔，促使分布在原生质体四周位置的外源 DNA可以进入到原生质体内。
此外，电击法还可以把GUS 基因向紫花苜蓿根原生质体直接导入以此获得转基因植株。
有相关关于GUS 酶活性检测报告指出，在转化的紫花苜蓿细胞内，GUS基因不但转化的紫花苜蓿细胞内，还在其内进行表达，转化的频率大约为6.5%。
但是该方法在应用过程中却受到很多局限，例如：在重新建立植物原生质体再生系统不仅仅难度很大，且转化率很低。
2 农杆菌介导法农杆菌介导法是使用最早、最广泛以及效果最好的一种转化方法。
通过使用农杆菌介导法对受体进行转化，整个操作过程简单便捷、经济实惠。
该方法在基因组上的外源基因进行整合，不但拷贝数少，且重排程度较低，转化效率高，是当前对紫花苜蓿改良过程中最长使用的一种有效方法。
该方法之所以可以建立起稳定的遗传转化，其主要的作用原理是：双子叶植物以及单子叶植物均受到土壤农杆菌的侵染，当植物受到来自农杆菌侵染的时候，植物则会释放出酚类物质诱导进行诱导，质粒上 Vir区基因表达，可以把粒上 T-DNA向植物的基因组中进行整合，使其在植物体内进行表达，以此达到改变植物的遗传性状的最终目的。
因为农杆菌自身具备天然转移 DNA这一特性，所以在植物基因工程中得到了广泛的应用。
紫花苜蓿CAMTA_基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析
第 33 卷第 5 期Vol.33，No.5143-1542024 年 5 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA孔海明，宋家兴，杨静，等. 紫花苜蓿CAMTA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析. 草业学报， 2024， 33（5）： 143−154.KONG Hai-ming， SONG Jia-xing， YANG Jing，et al. Identification and transcript profiling of the CAMTA gene family under abiotic stress in alfalfa. Acta Prataculturae Sinica， 2024， 33（5）： 143−154.紫花苜蓿CAMTA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析孔海明1，宋家兴1，杨静1，李倩2，杨培志1，曹玉曼1*（1.西北农林科技大学草业与草原学院，陕西杨凌 712100；2.新疆农业大学草业学院，新疆乌鲁木齐 830052）摘要：钙调蛋白结合转录激活因子（CAMTA）是一类重要的钙调素结合蛋白，在激素信号转导、发育调控和环境胁迫耐受中发挥着重要作用。
本研究采用生物信息学技术，基于紫花苜蓿“新疆大叶”参考基因组，对紫花苜蓿中CAMTA家族成员进行鉴定，并对这些基因的理化性质、系统发育树、保守结构域、染色体上位置、顺式作用元件、转录表达谱进行分析和验证。
结果表明，共鉴定出17个MsCAMTA基因，MsCAMTA家族成员可划分为3个亚家族，亚家族成员在基因结构、保守基序位置上较为相似。
染色体定位结果显示，MsCAMTA家族成员不均匀地分布在7条染色体上。
启动子区具有大量响应低温、盐胁迫及植物激素信号相关的顺式作用元件。
此外，采用RT-qPCR对盐（300 mmol·L-1 NaCl）、模拟干旱（400 mmol·L-1甘露醇）、低温（10 ℃）和脱落酸（100 μmol·L-1）处理下紫花苜蓿叶片中MsCAMTA1、MsCAMTA3、MsCAMTA11和MsCAMTA12的表达模式进行了初步研究。
紫花苜蓿CNGC基因家族成员鉴定及分析
第32卷 第2期V o l .32 No .2草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 2月F e b . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.02.028引用格式:李小红,王晓彤,麻旭霞,等.紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析[J ].草地学报,2024,32(2):588-598L IX i a o -H o n g ,WA N GX i a o -T o n g ,MAX u -X i a ,e t a l .I d e n t i f i c a t i o n a n dA n a l y s i s o f C N G C G e n eF a m i l y Me m b e r s i n A lf a l f a [J ].A c t aA gr e s t i aS i n i c a ,2024,32(2):588-598紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析李小红1,王晓彤1,麻旭霞1,蔡文祺1,冯学丽1,马梦凡1,李淑霞1,2,3*(1.宁夏大学林业与草业学院,宁夏银川750021;2.宁夏草牧业工程技术研究中心,宁夏银川750021;3.农业农村部饲草高效生产模式创新重点实验室,宁夏银川750021)收稿日期:2023-09-26;修回日期:2023-11-16基金项目:国家自然科学基金项目(32101426);宁夏自然科学基金项目(2023A A C 05019)资助作者简介:李小红(1996-),男,回族,宁夏固原人,硕士研究生,主要从事牧草抗逆育种研究,E -m a i l :l x h 0895@163.c o m ;*通信作者C o r r e -s p o n d i n g au t h o r ,E -m a i l :l i s h u x i a 620@163.c o m 摘要:环核苷酸门控通道(C N G C )基因家族作为非选择性阳离子通道基因家族之一,在植物信号转导㊁生长发育和环境胁迫等生理过程中发挥着重要作用㊂本研究利用生物信息学手段和转录组数据对紫花苜蓿C N G C 家族成员的进化关系㊁基因结构㊁保守基序㊁顺式作用元件㊁染色体定位㊁共线性关系以及基因表达进行分析㊂结果表明,紫花苜蓿M s C N G C 基因家族成员有16个,在染色体上不均匀分布,存在片段重复,大多数蛋白定位于细胞质膜㊂系统发育树将M s C N G C s 为4个亚家族㊂基因结构和保守基序分析表明,都含有c NM P /C N B D 和I T P 功能域㊂顺式作用元件分析表明,M s C N G C s 基因含有许多与非生物或生物胁迫和激素响应元件㊂M s C N G C 4和M s C N G C 7.2蛋白之间存在互作㊂M s C N G C 基因具有组织表达特异性㊂M s C N G C 基因对干旱㊁盐和激素等非生物胁迫均有显著的响应,为进一步研究M s C N G C 基因在调控非生物胁迫过程中的潜在功能提供了理论依据㊂关键词:紫花苜蓿;C N G C 基因家族;全基因组;系统进化;基因结构;非生物胁迫中图分类号:S 512.6 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0588-11I d e n t i f i c a t i o na n dA n a l y s i s o f C N G C G e n eF a m i l y Me m b e r s i nA lf a l f a L IX i a o -h o ng 1,WA N G X i a o -t o n g 1,MA X u -x i a 1,C A IW e n -qi 1,F E N G X u e -l i 1,MA M e n g-f a n 1,L I S h u -x i a 1,2,3*(1.C o l l e g e o fF o r e s t r y a n dP r a t a c u l t u r e ,N i n g x i aU n i v e r s i t y ,Y i n c h u a n ,N i n g x i a 750021,C h i n a ;2.N i n g x i aG r a s s l a n d a n dA n i m a l H u s b a n d r y E n g i n e e r i n g T e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r ,Y i n c h u a n ,N i n g x i a 750021,C h i n a ;3.K e y L a b o r a t o r y fo rM o d e l I n n o v a t i o n i nF o r a g eP r o d u c t i o nE f f i c i e n c y ,M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,Y i n c h u a n ,N i n gx i a 750021,C h i n a )A b s t r a c t :T h e c y c l i cn u c l e o t i d e -g a t e dc h a n n e l s (C N G C s )g e n e f a m i l y fu n c t i o n s a so n eo f t h en o n -s e l e c t i v e c a t i o n c h a n n e l g e n e f a m i l i e s a n d p l a y s i m p o r t a n t r o l e s i n p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s s u c h a s p l a n t s i gn a l t r a n s -d u c t i o n ,g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t ,a n d e n v i r o n m e n t a l s t r e s s .I n t h i s s t u d y ,w e a n a l y z e d t h e e v o l u t i o n a r y r e -l a t i o n s h i p ,g e n e s t r u c t u r e ,c o n s e r v e d m o t i f s ,c i s -a c t i n g e l e m e n t s ,c h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o n ,c o l l i n e a r i t y,a n d g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n so f t h e C N G C f a m i l y m e m b e r s i na l f a l f au s i n g b i o i n f o r m a t i c t o o l sa n dt r a n s c r i p-t o m i c d a t a .T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ew e r e16m e m b e r so f M s C N G C g e n e s f a m i l y ina l f a l f a ,w h i c h w e r eu n e v e n l y d i s t r i b u t e do n c h r o m o s o m e s ,w i t h s e g m e n t a l r e pe a t i o n ,a n dm o s t of p r o t e i n sw e r e l o c a t e d i n t h e p l a s m am e m b r a n e .T h e p h y l o ge n e t i c t r e e d i v i d e dM s C N G C s i n t of o u r s u b f a m i l i e s .G e n e s t r u c t u r e a n d c o n s e r v e dm o t i f a n a l y s i s s h o w e d t h a t c NM P /C N B Da n dI T Pf u n c t i o n a l d o m a i n sw e r e p r e s e n t .C i s -a c t i n ge l e m e n t a n a l y s i s s h o w e d t h a t M s C N G C g e n e s c o n t a i n e dm a n y e l e m e n t s t h a t r e s p o n d e d t o a b i o t i c o r b i o l o g i -c a l s t r e s s e s a n dh o r m o n e s .T h e r ew a s i n t e r a c t i o nb e t w e e n M s C N G C 4a n d M s C N G C 7.2p r o t e i n s .M s C -N G C g e n e s h a dt i s s u es p e c if i c i t y .M s C N G Cg e n e sh a dsi g n i f i c a n t r e s p o n s e t od r o u gh t ,s a l t a n dh o r m o n e s t r e s s ,w h i c h p r o v i d e d a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r f u r t h e r r e s e a r c h o n t h e p o t e n t i a l f u n c t i o n o f M s C N G C g e n e s i nt h e r e gu l a t i o no f a b i o t i c s t r e s s .K e y wo r d s :A l f a l f a ;C N G C g e n e s f a m i l y ;G e n o m e -w i d e ;S y s t e m a t i c e v o l u t i o n ;G e n e s t r u c t u r e ;A b i o t i c s t r e s s第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析C a2+作为植物中重要的次级信使,在调控植物的多种信号转导㊁生长发育和非生物胁迫响应中发挥着关键性的作用,如植物的光合作用㊁激素合成㊁生物胁迫和非生物胁迫等[1-4]㊂环核苷酸门控离子通道(C N G C s)蛋白是钙离子传导途径之一,广泛存在于动植物中[5]㊂在植物中,大多数C N G C蛋白位于质膜,部分位于核膜和液泡膜[6-8]㊂C N G C是由六个跨膜(T M)结构域和第五㊁第六T M结构域之间的一个孔隙区域(P)组成,包含C a M B结构域和环核苷酸结合结构域(C N B D)[9-11]㊂C N B D是一个高度保守的区域,包含一个能与钙调蛋白(C a l m o d u-l i n,C a M)结合的磷酸盐结合盒(P B C)和1个铰链区[12-13]㊂环核苷酸单磷酸(3',5'-c AM P和3',5'-c GM P)和C a M可调节C N G C通道的关闭和打开[14]㊂这些结构对研究C N G C提供了重要的信息㊂研究表明,C N G C家族成员可参与植物的各种生理反应,包括种子萌发㊁生殖发育[15]和非生物胁迫(盐胁迫㊁热胁迫)响应等[16,17]㊂目前,已经在大多数植物种鉴定出了C N G C基因,如拟南芥(A r a-b i d o p s i s t h a l i a n a)中鉴定出20个A t C N G C s㊁蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u)中19个M t C N G C s基因㊁赤豆(V i g n a a n g u l a r i s)中18个V a C N G C s基因[35]㊂在拟南芥中,A t C N G C1作为植物发育和抗逆性的调节因子,参与C a2+的吸收[19]㊂A t C N G C18在花粉中表达,A t C N G C18功能的丧失导致花粉管生长缺陷,并导致雄性不育[18]㊂A t C N G C19和A t C N G C20在盐胁迫下表达量显著降低[19]㊂沉默I V b亚族S l C N G C基因显著增强番茄(S o l a n u m l y-c o p e r s i c u m)对真菌病原体P y t h i u ma p h a n i d e r m a-t u m和S o l a n u ml y c o p e r s i c u m的抗性[20]㊂在芒果(M a n g i f e r ai n d i c a)C N G C家族成员中,M i C-N G C13和M i C N G C6可通过调节M D A含量来维持细胞膜完整性,进而积极响应冷胁迫[21]㊂沉默棉花(G o s s y p i u m h i r s u t u m)G h C N G C32和G h C-N G C35基因后,转基因植株的耐盐性降低[22]㊂C N G C基因在植物的各种生物学过程中发挥重要作用㊂因此,鉴定紫花苜蓿(M e d i c a g os a t i v a) C N G C家族成员对紫花苜蓿的抗逆性研究具有重要意义㊂紫花苜蓿是一种优质的多年生豆科牧草,在世界范围内广泛种植,对环境的适应性相对较强,因其营养含量高和适口性好而享有 牧草之王 的美誉[23,24]㊂然而,一些不利的生物和非生物因素严重制约了苜蓿生产,对苜蓿产量和品质产生了严重的负面影响,进而影响畜牧业的高质量发展㊂本研究利用紫花苜蓿全基因组序列信息㊁拟南芥C N G C家族基因研究信息及生物信息学分析技术对紫花苜蓿中的C N G C基因家族成员进行鉴定和分析,并利用转录组数据分析M s C N G C基因在不同组织和非生物胁迫(冷㊁干旱㊁盐和A B A)下的表达模式,以期为进一步探究M s C N G C 基因的功能提供了理论依据㊂1材料与方法1.1紫花苜蓿C N G C基因家族鉴定从拟南芥数据库(T A I R,h t t p://w w w.a r a b i-d o p s i s.o r g/)中下载拟南芥C N G C家族蛋白的氨基酸序列㊂紫花苜蓿(中苜一号)基因组文件下载自h t t p s://f i g s h a r e.c o m/a r t i c l e s/d a t a s e t/M e d i c a g o_ s a t i v a_g e n o m e_a n d_a n n o t a t i o n_f i l e s/12623960㊂以拟南芥C N G C蛋白为参考序列,利用T B t o o l s中的B L A S T p比对出紫花苜蓿中C N G C s的蛋白,然后,利用c NM P/C N B D(p f a m:P F00027)和I T P(p f a m: P F00520)的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件作为查询,对紫花苜蓿蛋白数据库进行搜索,利用C D-H I T(h t t p://w e i z h o n g-l a b.u c s d.e d u/c d-h i t/)软件去除冗余序列㊂再利用I n t e r P r o(h t t p s://w w w.e b i.a c.u k/i n t e r p r o)网站分析预测蛋白的结构域,同时包含一个环核苷酸结合结构域(c NM P/C N B D, P F00027)和一个离子转运蛋白结构域(I T P, P F00520)的蛋白属于紫花苜蓿C N G C基因家族成员,并根据基因在染色体上的位置信息重新命名M s C N G C基因㊂1.2紫花苜蓿C N G C蛋白质理化性质㊁亚细胞定位㊁二级和三级结构预测分析利用在线工具P r o tP a r a m(h t t p s://w e b.e x-p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)预测M s C N G C蛋白质的氨基酸数㊁分子量㊁等电点㊁稳定指数等理化性质㊂利用W o L F P S O R T I I网站(h t t p s://w w w.g e n-s c r i p t.c o m)和S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r)预测M s C N G C蛋白成员的亚细胞定位及二级结构㊂使用在线网站S W I S S-MO D E L(h t t p s:// s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)分析M s C N G C蛋白的三级结构㊂1.3紫花苜蓿C N G C基因系统进化树分析利用软件M E G A11对紫花苜蓿16个M s C-985草地学报第32卷N G C,拟南芥20个A t C N G C,蒺藜苜蓿19个M t C-N G C蛋白和赤豆18个V a C N G C蛋白共73个C N G C蛋白序列构建系统进化树㊂进化树构建采用最大似然法(M a x i m u m l i k e l i h o o d e s t i m a t e, M L),步长值(b o o t s t r a p v a l u e s)为1000次,其他参数设置默认㊂1.4紫花苜蓿C N G C基因结构、保守基序和顺式作用元件分析通过T B t o o l s工具对M s C N G C基因家族成员进行内含子-外显子结构分析㊂M E M E(h t t p s:// m e m e-s u i t e.o r g/m e m e/t o o l s/m e m e)用于预测蛋白的保守基序,保守基序数为10,其他参数默认㊂利用P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n tc a r e/h t m l/)工具分析启动子序列(基因上游2.0k b)中的顺式作用元件,并利用T B t o o l s工具进行可视化㊂1.5紫花苜蓿C N G C基因染色体定位和共线性分析基于紫花苜蓿全基因文件信息,使用T B t o o l s 软件分析和定位M s C N G C基因的染色体分布㊂从E n s e m b l P l a n t s(h t t p://p l a n t s.e n s e m b l.o r g/i n-d e x.h t m l)网站分别下载拟南芥和蒺藜苜蓿全基因组序列和g f f文件,利用多重共线扫描工具(M C S-c a n X)分析紫花苜蓿与拟南芥和蒺藜苜蓿C N G C基因共线性,并通过T B t o o l s进行可视化㊂用S i m p l e K a/K sC a l c u l a t o r(N G)计算非同义替换率(K a),同义替换率(K s)以及K a/K s比率㊂1.6M s C N G C蛋白互作网络预测蛋白质互作网络预测对功能未知的蛋白有着非常重要的作用㊂我们以模式作物拟南芥已注明功能的蛋白质和16个M s C N G C蛋白为研究对象,通过S T R I N G(h t t p s://c n.s t r i n g-d b.o r g/)在线软件对M s C N G C蛋白进行了预测分析,置信度参数设为0.400,其他参数默认㊂1.7紫花苜蓿M s C N G C基因的组织表达模式和非生物胁迫表达分析从N C B I网站(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ s r a/?t e r m)下载紫花苜蓿在不同组织㊁干旱㊁低温㊁A B A以及盐胁迫下的转录组数据(S R P055547㊁S R R7091780~7091794,S R R7160313~7160357),获得M s C N G C基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式,对每个M s C N G C s的F P K M值进行对数归一化,并使用T B t o o l s工具绘制热图㊂2结果与分析2.1紫花苜蓿M s C N G C基因家族成员鉴定及基本理化性质分析为鉴定紫花苜蓿中所有的C N G C家族成员,从T A I R网站上下载了拟南芥C N G C基因家族20个成员的蛋白序列作为参考序列,对紫花苜蓿全基因组进行B L A S T检索,E小于1ˑ10-5㊂同时,将c N M P/C N B D 和I T P(p f a m:P F00027㊁P F00520)的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件作为查询,对紫花苜蓿蛋白数据库进行搜索㊂去冗余后,共鉴定出16个包含C N G C功能域的基因,根据它们在染色体上的位置被命名为M s C-N G C1-M s C N G C8.5(表1)[36]㊂M s C N G C蛋白长度为460a a(M s C N G C4.2)~2638a a(M s C N G C3.2),对应的蛋白分子量为52.85~295.52k D a,理论等电点在5.87 ~9.5之间,疏水指数(G R A V Y)为-0.433~0.096㊂M s C N G C s蛋白二级结构分析表明,M s C N G C蛋白的α-螺旋㊁β-链折叠㊁延伸链和无规则卷曲分别为37.66% (M s C N G C8.2)~62.17%(M s C N G C4.2),2.60%(M s C-N G C8.3)~11.02%(M s C N G C8.2),延伸链9.17% (M s C N G C3.2)~22.70%(M s C N G C8.2),25.00% (M s C N G C4.2)~33.65%(M s C N G C8.5)㊂不稳定系数预测表明,M s C N G C2.1/7.1/7.2/8.2蛋白的稳定系数小于40,属于稳定蛋白,其他M s C N G C s的稳定系数大于40,属于不稳定蛋白㊂M s C N G C3.2和M s C N G C8.1蛋白的等电点小于7,属于酸性蛋白,其他14个M s C-N G C蛋白等电点大于7,属于碱性蛋白㊂亚细胞定位预测表明,M s C N G C4.2和M s C N G C8.1蛋白分别位于液泡和叶绿体上,其他14个M s C N G C蛋白定位于质膜上㊂2.2紫花苜蓿M s C N G C蛋白的系统发育分析对紫花苜蓿16个M s C N G C蛋白㊁拟南芥20个A t C N G C蛋白㊁蒺藜苜蓿19个M t C N G C蛋白和赤豆18个V a C N G C蛋白,共73个C N G C蛋白的系统进化分析表明:73个C N G C s蛋白被划分为5个亚家族(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,ⅣA,ⅣB)(图1)㊂除Ⅲ亚家族不包含M s C N G C蛋白,其他4个亚家族均包含M s C N G C成员,其中Ⅲ㊁ⅣA㊁ⅣB亚家族均包含上述4个物种的C N G C成员,表明C N G C在不同物种间的进化关系是高度保守㊂第Ⅰ亚家族只包含095第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析M s C N G C 2.1,M s C N G C 3.2和M s C N G C 5㊂第Ⅱ亚家族包含有M s C N G C 8.4和M s C N G C 8.5;第ⅣA 亚家族包含M s C N G C 1,M s C N G C 2.2,M s C N G C 3.1,M s C N G C 4.2,M s C N G C 7.1和M s C N G C 7.2;第ⅣB 亚家族包含M s C N G C 4.1,M s C N G C 7.3,M s C -N G C 8.1,M s C N G C 8.2和M s C N G C 8.3㊂表1 紫花苜蓿M s C N G C 基因家族成员信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o no f M s C N G C g e n e f a m i l y me m b e r s i na lf a l f a 基因名称G e n en a m e基因号G e n e I D蛋白质长度P r o t e i nL e n g t h /a a 蛋白质分子质量P r o t e i n MW /k D a稳定系数I n s t a b i l i t yi n d e x 等电点p IV a l u e 疏水指数G R A V Y α-螺旋α-H e l i x /%延伸链E x t e n d e d S t r a n d/%β-折叠B e t at u r n /%无规则卷曲R a n d o m c o i l /%亚细胞定位S u b c e l l u l a rL o c a l i z a t i o nM s M s C N G C 1M s G 0180003547.01.T 01977111.1648.618.21-0.20145.9614.025.1234.90p l a s M s M s C N G C 2.1M s G 028*******.01.T 011189136.2036.658.120.09642.1418.597.9931.29p l a s M s M s C N G C 2.2M s G 028*******.01.T 0171282.1946.389.2-0.14252.8811.672.9532.49p l a s M s M s C N G C 3.1M s G 0380016434.01.T 0167978.4945.729.21-0.17754.7911.193.0930.93p l a s M s M s C N G C 3.2M s G 0380017485.01.T 012638295.5248.235.87-0.23753.079.175.1232.64p l a s M s M s C N G C 4.1M s G 0480018204.01.T 0174486.1557.849.2-0.25752.5511.833.3632.26p l a s M s M s C N G C 4.2M s G 0480020782.01.T 0146052.8547.909.260.01062.1710.222.6125.00v a c u M s M s C N G C 5M s G 0580028912.01.T 0160070.0841.428.16-0.08052.1716.005.3326.50p l a s M s M s C N G C 7.1M s G 0780037654.01.T 0167978.5139.828.96-0.11952.2812.962.8031.66p l a s M s M s C N G C 7.2M s G 0780037699.01.T 0167978.5139.828.96-0.12054.9311.782.9530.34p l a s M s M s C N G C 7.3M s G 0780041753.01.T 0173284.2547.719.5-0.15852.1112.963.4131.51p l a s M s M s C N G C 8.1M s G 0880041836.01.T 0146553.7959.956.81-0.43356.5610.113.2330.11c h l o M s M s C N G C 8.2M s G 0880043019.01.T 0176286.8339.879.48-0.16337.6622.7011.0228.61p l a s M s M s C N G C 8.3M s G 0880043020.01.T 0165475.5941.238.92-0.07154.1312.542.6030.73p l a s M s M s C N G C 8.4M s G 0880044538.01.T 0154963.8750.139.13-0.27455.1910.753.2830.78p l a s M s M s C N G C 8.5M s G 0817*******.01.T 0162472.3750.679.07-0.21952.7210.742.8833.65pl a s 注:pl a s ,代表细胞质膜;v a c u ,代表液泡膜;c h l o ,代表叶绿体N o t e :p l a s s t a n d s f o r c e l l p l a s m am e m b r a n e ;v a c us t a n d s f o r v a c u o l a rm e m b r a n e ;c h l os t a n d s f o rC h l o r o pl a st 图1 紫花苜蓿㊁拟南芥㊁蒺藜苜蓿和赤豆C N G C 蛋白的系统进化分析F i g .1 P h y l o g e n e t i c t r e e o fC NG C p r o t e i n s f r o m M .s a t i v a ,A .t h a l i a n a ,M .t r u n c a t u l a a n d V .a n gu l a r i s 注:图中红色圆圈㊁绿色圆圈㊁黄色圆圈和蓝色色圆圈分别代紫花苜蓿㊁拟南芥㊁赤豆㊁蒺藜苜蓿N o t e :I n t h e f i g u r e ,t h e r e d c i r c l e ,t h e g r e e n c i r c l e ,t h e y e l l o wc i r c l e a n d t h e b l u e c i r c l e r e p r e s e n t a l f a l f a ,A r a b i d o p s i s ,V .a n gu l a r i s a n d M .t r u n -c a t u l a r e s p e c t i v e l y195草地学报第32卷2.3紫花苜蓿M s C N G C基因家族保守基序和基因结构分析为进一步探究M s C N G C基因的进化过程,我们首先对M s C N G C s蛋白构建系统进化树,M s C N G C s 蛋白被划分成3个亚家族(图2A)㊂对M s C N G C基因家族成员的保守基序和基因结构进行了分析,结果表明,M s C N G C蛋白中共预测到了10个基序(M o t i f1 ~M o t i f10)(图2B),其中大多数M s C N G C蛋白含有10个m o t i f㊂根据紫花苜蓿与拟南芥的进化关系,我们发现在第Ⅰ亚家族中M s C N G C3.1/7.1/7.2含有相同的m o t i f;第Ⅱ亚家族中的M s C N G C2.2具有与第Ⅰ亚家族基因相同的m o t i f结构;而第Ⅲ亚家族包含的M s C N G C1和M s C N G C4.2m o t i f数量和种类并不相同,其中M s C N G C1比M s C N G C4.2多3个m o t i f;第Ⅳ亚家族中的M s C N G C蛋白(M s C N G C2.1,M s C-N G C3.2,M s C N G C4.1,M s C N G C5和M s C N G C8.1)包含4~7个m o t i f,其中M s C N G C2.1㊁M s C N G C3.2和M s C N G C5含有4个m o t i f,M s C N G C4.1和M s C-N G C8.1含有7个m o t i f;第Ⅴ亚家族中3个M s C N G C 蛋白(M s C N G C7.3,M s C N G C8.2和M s C N G C8.3)含有8~10个m o t i f,M s C N G C8.2不包含m o t i f7㊂此外,m o t i f2在所有成员中都存在,M s C N G C2.1,M s C-N G C3.2和M s C N G C5不包含m o t i f3和m o t i f5㊂基因结构分析表明,M s C N G C基因内含子/外显子的数量分别为4~45个㊁5~46个不等(图2C)㊂6个基因(M s C N G C2.2,M s C N G C3.1,M s C N G C4.2, M s C N G C7.1,M s C N G C7.2和M s C N G C8.1)含4~5个内含子;4个基因(M s C N G C7.3,M s C N G C8.3, M s C N G C8.4和M s C N G C8.5)包含6~7内含子;2个基因(M s C N G C1,M s C N G C8.2)含有9~10个内含子;3个基因(M s C N G C5,M s C N G C2.1和M s C N G C3.2)含11~45个内含子㊂特别地,M s C N G C3.2基因含有的内含子和外显子数是该家族中最多的,分别是45和46个㊂另外,M s C N G C家族成员U T R的分布也是不均匀的,其数量在0~4个,其中6个基因(M s C N G C3.1,M s C N G C3.2,M s C N G C4.2,M s C-N G C7.3,M s C N G C8.1和M s C N G C8.3)的序列没有预测到U T R区㊂图2紫花苜蓿M s C N G C基因保守结构域、基序及基因结构分析F i g.2 A n a l y s i s o f g e n e c o n s e r v e dd o m a i n,m o t i f a n d g e n e s t r u c t u r e o f a l f a l f a M s C NG C注:(A)M s C N G C基因家族系统发育树㊂(B)M s C N G C蛋白的基序㊂不同的图案用不同颜色的矩形标注,编号1-10㊂(C)M s C N G C基因的外显子-内含子结构㊂非编码区(U T R)是用绿色方框表示㊂黄框表示外显子,灰线表示内含子㊂(D)基序的蛋白N o t e:(A)M s C N G C g e n e f a m i l yp h y l o g e n e t i c t r e e.(B)M o t i f o fM s C N G C p r o t e i n.D i f f e r e n t p a t t e r n s a r em a r k e dw i t hr e c t a n g l e so f d i f f e r e n t c o l o r s,n u m b e r e d1-10.(C)E x o n-i n t r o n s t r u c t u r e o f M s C N G C g e n e.N o n-c o d i n g r e g i o n(U T R).I t i s r e p r e s e n t e db y a g r e e nb o x.T h e y e l l o w b o x s h o w s e x o n s,a n d t h e g r a y l i n e s h o w s i n t r o n s.(D)P r o t e i no f t h em o t i f2.4紫花苜蓿C N G C基因启动子顺式作用元件分析为了进一步了解M s C N G C家族成员顺式作用元件的分布,利用P l a n t C A R E在线工具分析顺式作用元件㊂结果表明,16个M s C N G C基因启动子区共检测到170个响应元件,但不同基因含有的响应元件数量和种类不尽相同㊂M s C N G C基因启动子中与植物激素相关的顺式作用元件有5类,包括与295第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析脱落酸(A B A)㊁生长激素(I A A)㊁茉莉酸(J A)㊁赤霉素(G A)和水杨酸(S A)相关的元件;参与环境刺激的顺式作用元件包括3类,分别为低温响应㊁干旱和防御/应激响应元件;此外,还有与昼夜节律和光响应相关的元件(图3)㊂M s C N G C家族基因均含有与激素响应元件,例如,M s C N G C2.2/7.2/8.3/ 8.4/8.5包含生长素响应(T G A-e l e m e n t)元件; M s C N G C2.1/3.1/4.1/5/7.2/7.3/8.1基因包含参与水杨酸响应(T C A-e l e m e n t)元件;M s C-N G C2.1/4.1/4.2/5/7.1/7.2/7.3/8.1/8.2基因包含参与脱落酸(A B R E)作用元件;M s C-N G C7.2/8.3/8.4/8.5基因包含参与赤霉素响应(P b o x㊁T A T C-b o x)的顺式作用元件;M s C N G C1/ 2.2/3.1/3.2/5/7.2/8.1/8.2/8.3/8.4/8.5包含参与茉莉酸响应(T G A C G-m o t i f)元件㊂胁迫响应元件也广泛存在于M s C N G C基因家族中,例如, M s C N G C2.2㊁M s C N G C4.1㊁M s C N G C4.2和M s C-N G C7.3基因含有干旱响应(M B S)元件;M s C N G C1/ 2.2/3.2/8.5基因包含参与防御和应激反应(T C-r i c hr e p e a t s)元件;M s C N G C1/3.2/4.1/5/7.3/ 8.1/8.4包含光响应(G-b o x㊁I-b o x)元件,M s C-N G C2.1/7.2/8.3包含低温响应(L T R)元件㊂此外,M s C N G C1/3.1/4.2/7.2/8.1还包含参与昼夜节律调控相关(C i r c a d i a n)作用元件(图3)㊂图3M s C N G C基因启动子区顺式作用元件分析F i g.3 D i s t r i b u t i o no f c i s-a c t i n g e l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r r e g i o no f M s C NG C g e n e s i na l f a l f a 注:顺式作用元件由不同颜色的矩形表示N o t e:T h e c i s-e l e m e n t s a r e r e p r e s e n t e db y r e c t a n g l e s o f d i f f e r e n t c o l o r s2.5紫花苜蓿M s C N G C基因染色体定位、基因重复及共线性分析对紫花苜蓿C N G C家族基因进行染色体定位分析发现,16个M s C N G C s基因不均匀的分布在c h r1㊁c h r2㊁c h r3㊁c h r4㊁c h r5㊁c h r7和c h r8上(图4A)㊂其中,c h r1和c h r5上各包含1个M s C N G C 基因,c h r2㊁c h r3和c h r4上各包含2个M s C N G C s 基因,c h r7上各包含3个M s C N G C s基因,c h r8上各包含5个M s C N G C s基因㊂共线性分析表明:紫花苜蓿C N G C家族内的M s C N G C1/M s C N G C4.2, M s C N G C7.3/M s C N G C8.2之间存在共线性关系(图4A),属于节段重复,K a/K s小于1,说明他们之间在进化过程中经历了纯化选择(表2)㊂进一步分析紫花苜蓿与拟南芥和蒺藜苜蓿之间C N G C基因的共线性发现,不同物种间也存在共线性关系,但紫花苜蓿与蒺藜苜蓿之间在相同染色体上的共线性较多,说明紫花苜蓿与蒺藜苜蓿都是豆科植物,所以其亲缘性更高(图5B)㊂395草地学报第32卷图4M s C N G C基因的染色体分布及共线性分析F i g.4 C h r o m o s o m e d i s t r i b u t i o na n d c o l l i n e a r i t y a n a l y s i s o f M s C NG C g e n e s注:(A)紫花苜蓿C N G C基因在染色体定位和染色体间关系㊂黑线线表示M s C N G C共线性基因㊂(B)苜蓿㊁苜蓿和拟南芥中C N G C基因的共线性分析㊂背景中的灰线代表紫花苜蓿和拟南芥/蒺藜苜蓿的共线块,蓝线代表共线C N G C基因对N o t e:(A)C h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o na n d i n t e r c h r o m o s o m e r e l a t i o n s h i p o f C N G C g e n e i na l f a l f a.T h e b l a c k l i n e r e p r e s e n t s t h e M s C N G C c o l l i n e a r g e n e s.(B)C o l l i n e a r i t y a n a l y s i s o f C N G C g e n e s i n a l f a l f a,a l f a l f a a n dA r a b i d o p s i s.T h e g r a y l i n e s i n t h e b a c k g r o u n d r e p r e s e n t t h e c o l l i n e a r b l o c k s o f a l f a l f a a n d A r a b i d o p s i s/M.t r u n c a t u l a,a n d t h eb l u e l i n e s r e p r e s e n t c o l l i n e a r C N G C g e n e p a i r s表2M s C N G C基因复制事件T a b l e2M s C N G C g e n e r e p l i c a t i o ne v e n t s基因1/基因2G e n e1/G e n e2K a K s K a/K s D u l p l i c a t e d e d a t e(M y a)重复日期D u l p l i c a t e t y p e重复类型M s C N G C1/M s C N G C4.20.2642.0990.126172.083节段重复M s C N G C7.3/M s C N G C8.20.2120.7670.27662.915节段重复注:对于每个基因对,基于每个位点每年6.1ˑ10-9次替换的速率,将k值转换成以百万年为单位的分化时间㊂重复时间(T)计算为T= K s/(2ˑ6.1ˑ10-9)ˑ10-6M y aN o t e:F o r e a c h g e n e p a i r,t h eK s v a l u e i s t r a n s l a t e d i n t o d i v e r g e n c e t i m e i nm i l l i o n s o f y e a r s b a s e do n a r a t e o f6.1ˑ10-9s u b s t i t u t i o n s p e r s i t e p e r y e a r.T h e d i v e r g e n c e t i m e(T)i s c a l c u l a t e d a sT=K s/(2ˑ6.1ˑ10-9)ˑ10-6M y a2.6M s C N G C蛋白互作网络预测分析为了提供更多关于M s C N G C功能的线索,我们利用S T R I N G在线软件基于拟南芥C N G C蛋白的相互作用预测了该家族成员的蛋白质相互作用网络㊂构建蛋白质相互作用网络(图5)㊂M s C N G C 蛋白中有6个C N G C蛋白存在互作现象㊂其中M s C N G C7.2与M s C N G C4之间存在蛋白互作,其他M s C N G C蛋白之间不存在互作现象㊂M s C-N G C2.1和M s C N G C5共有的互作蛋白有钙调蛋白(C a l c i n e u r i nB-l i k e1,C B L1㊁C a l c i n e u r i nB-l i k e4,C B L4)㊁与C B L蛋白相互作用的植物激酶(C B L-I n-t e r a c t i n g P r o t e i n K i n a s e24,C I P K24)㊁钠/氢交换蛋白(N a+/H+E x c h a n g e r7,N H X7)和参与真核生物前转录R N A剪接和R N A延伸的蛋白质(P r e-t R N A S p l i c i n g F a c t o ra n d R N A E l o n g a t i o n F a c-t o r,P O T5)㊂M s C N G C2.1还与C B L蛋白相互作用的植物激酶(C B L-I n t e r a c t i n g P r o t e i n K i n a s e6, C I P K6)和氢离子A T P酶(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a H ʃA T P a s e1,A H A1)这2个蛋白之间存在互作㊂M s C N G C2.2与植物受体样激酶(P s e u d o m o n a s s y-495第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析r i n ga e p v .t o m a t o D C 3000s t r e s sk i n a s er e c e p t o r 1,P S K R 1)和氢离子A T P 酶(A r ab i d o p s i s t h a l i a n a H ʃA T P a s e 1,AH A 1)之间存在互作㊂M s C -N G C 8.3只和参与真核生物前转录R N A 剪接和R N A 延伸的蛋白质(P r e -t R N AS p l ic i n g Fa c t o r a n d R N A E l o n g a t i o nF a c t o r ,P O T 5)互作㊂M s C N G C 5还与C B L 蛋白相互作用的植物激酶(C B L -I n t e r a c -t i n g Pr o t e i nK i n a s e 10,C I P K 10)之间存在互作㊂此外,M s C N G C 7.2与钙依赖性蛋白激酶(C a l c i u m -d e -pe n d e n t p r o t e i nk i n a s e 32,C P K 32)存在互作㊂图5 紫花苜蓿M s C N G C 蛋白与拟南芥同源基因对的蛋白-蛋白互作网络预测模型F i g .5 P r e d i c t i o nm o d e l o f p r o t e i n -p r o t e i n i n t e r a c t i o n n e t w o r kb e t w e e n M s C N G C p r o t e i n s o f a l f a l f a a n dA r a b i d o ps i s h o m o l o g o u s g e n e p a i r s 2.7 紫花苜蓿M s C N G C 基因在不同组织中的表达模式分析分析了M s C N G C 基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式,M s C N G C 基因具有组织表达特异性(图6)㊂M s C N G C 4.1和M s C N G C 8.1在各个组织中都具有相同的表达水平㊂M s C N G C 1在根瘤组织中不表达;M s C N G C 7.2在花组织中不表达;M s C -N G C 8.4在根组织中不表达;M s C N G C 4.2和M s C N G C 5的表达模式相似,只在花中表达;M s C -N G C 3.1仅在叶中表达;M s C N G C 8.5主要在伸长茎中表达;M s C N G C 8.2基因在伸长茎和短茎组织中均有较高的表达水平,尤其在伸长茎中表达量最高;M s C N G C 7.1在根瘤和根中高表达;M s C -N G C 2.1和M s C N G C 8.4在地上组织中的表达量要显著的高于地下组织,表明M s C N G C s 基因在调节紫花苜蓿生长发育过程中发挥不同的作用㊂图6 M s C N G C 基因在不同组织中的表达模式F i g u r e 6E x pr e s s i o no f M s C N G C g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s 注:热图中的数值代表基因的表达量,下同N o t e :T h e v a l u e s i nt h eh e a tm a p r e pr e s e n t t h ea m o u n to f g e n ee x -pr e s s i o n ,t h e s a m e a s b e l o w 2.8 紫花苜蓿M s C N G C 基因在非生物胁迫下的表达模式分析为进一步研究M s C N G C 基因家族对非生物胁迫的响应,利用紫花苜蓿转录组数据分析了M s C N G C s 基因在低温㊁盐㊁干旱和A B A 处理下的表达模式(图7)㊂在低温处理下,M s C N G C 2.2㊁M s C N G C 5㊁M s C -N G C 8.4㊁M s C N G C 8.5的表达量在2h 后与0h 相比明显上调(图7A );M s C N G C 7.1和M s C N G C 7.2的表达趋势一致㊂在盐处理下,M s C N G C s 基因的表达量随着盐处理时间的延长表现出不同程度的下调现象,如M s C N G C 2.2和M s C N G C 5的表达量显著降低(图7B )㊂在干旱处理下,随着处理时间的增加,M s C -N G C 3.2㊁M s C N G C 5和M s C N G C 8.5基因的表达量不断升高(图7C )㊂在A B A 处理下,M s C N G C 2.2的表达量随胁迫时间的延长而降低;M s C N G C 5在3h 表达量明显下调,随处理时间的延长又逐渐升高;M s C N G C 4.2㊁M s C N G C 8.4和M s C N G C 8.5在A B A处理下表达趋势相似,在处理1h 后表达量显著下调㊂M s C N G C 1和M s C N G C 3.1在A B A 处理下的表达量不变(图7D )㊂595草地学报第32卷图7M s C N G C基因在非生物胁迫下的表达模式分析F i g.7 E x p r e s s i o no f M s C NG C s g e n eu n d e r a b i o t i c s t r e s s注:图7C中M代表甘露醇㊂(A)低温处理;(B)盐处理;(C)干旱处理;(D)A B A处理N o t e:I n t h e f i g u r e7C,Ms t a n d s f o rm a n n i t o l.(A)C o l d t r e a t m e n t;(B)S a l t t r e a t m e n t;(C)M a n n i t o l t r e a t m e n t;(D)A B At r e a t m e n t3讨论紫花苜蓿作为最重要的豆科牧草之一,是畜牧业持续健康发展的重要物质基础,因此,研究紫花苜蓿对非生物胁迫的响应是至关重要的㊂C N G C作为一种非选择性的阳离子通道,对C a2+和K+具有渗透性,并已被证实参与植物的生长发育和对各种环境胁迫的响应[24]㊂本研究利用生物信息学方法从在紫花苜蓿全基因组中初步鉴定到了16个C N G C基因,而拟南芥和玉米中分别有20,12个C N G C基因,与M s C N G C基因的数量不同,说明在不同物种间C N G C基因的数量存在差异㊂亚细胞定位预测分析表明,大多数M s C N G C蛋白定位于细胞膜,与拟南芥C N G C基因的亚细胞定位相似[10],推测C N G C蛋白主要在细胞膜上发挥功能㊂物种间的系统发育关系是生物学研究的基础㊂紫花苜蓿和拟南芥中C N G C蛋白的系统发育关系发现,紫花苜蓿和拟南芥的C N G C蛋白被划分为4个亚家族(图1),并且在第Ⅱ和第Ⅳ亚家族中紫花苜蓿与蒺藜苜蓿的C N G C蛋白被划分到同一分支,表明紫花苜蓿和蒺藜苜蓿有较高的亲缘性㊂基因的功能域是调控顺式作用元件活性和基因表达的重要因素㊂拟南芥[10]㊁玉米[27]㊁小麦[29]的C N G C蛋白都含有典型的c N M P/C N B D和I T P功能域,能促进阳离子运输[25]㊂而M s C N G C蛋白成员也含有典型的c N M P/C N B D和I T P功能域,表明M s C-N G C蛋白可能也具有运输阳离子功能㊂外显子和内含子的结构影响基因的表达和蛋白质的功能,意味着外显子和内含子使基因在生物体中发挥重要作用,从而维持生命[26]㊂内含子和外显子分析发现,M s C-N G C基因家族成员的内含子数目分别是4~45不等㊂虽然部分基因外显子/内含子结构相似,但序列长度不同(图2),这与其他植物的外显子/内含子结构相似,如玉米[27]㊁水稻[28]㊁小麦[29]等,说明C N G C家族695第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析基因的结构相对复杂㊂基因启动子区域内的顺式作用元件在基因表达调控中起着至关重要的作用,基因启动子中不同类型的顺式作用元件预示着该基因在应对不同胁迫时可能具有不同的功能[30]㊂对启动子顺式作用元件分析发现,M s C N G C s的启动子中包含大量的植物激素(A B A,I A A,J A,G A)响应元件㊁光响应元件和胁迫(光照,低温,干旱)响应元件(图3),表明M s C N G C基因可能参与调控胁迫响应及植物激素信号转导㊂例如,M s C N G C2.2,M s C N G C4.1,M s C-N G C4.2和M s C N G C7.3基因含有干旱响应(M B S)元件,表明它们可能在干旱胁迫下具有活性㊂M s C-N G C7.2和M s C N G C8.3基因具有多个激素应答元件,它们可能在植物的激素应答和各种生理代谢过程的调控中发挥作用㊂M s C N G C基因分布在紫花苜蓿的7条染色体上,第6号染色体上没有M s C N G C基因,因此, M s C N G C的分布是不均匀,与玉米㊁水稻C N G C基因在染色体上的分布相似[26,28]㊂基因复制是基因组进化和物种遗传最重要的驱动力之一[31]㊂植物中基因家族扩增的两个主要原因是节段重复和串联重复㊂基因复制不仅可以为基因家族增加新成员,还可以丰富基因家族的功能,极大地促进了各种生物的遗传进化[32]㊂在本研究中,M s C N G C基因家族中存在2对节段重复事件(M s C N G C1/M s C-N G C4.2,M s C N G C7.3/M s C N G C8.2)(图4A),表明他们可能在功能上具有相似性㊂M s C N G C s基因与蒺藜苜蓿之间存在共线性关系,可能由于其是同科植物和亲缘关系较近,也表明它们可能具有相似的功能,这需要进一步的研究㊂M s C N G C与拟南芥存在共线性,为预测M s C N G C基因的表达和蛋白的功能提供了依据㊂进一步蛋白质相互作用网络预测发现,M s C N G C4与M s C N G C7.2之间存在蛋白互作,同时M s C N G C蛋白还与C B L,C I P K,NH X7, P O T5和C P K32蛋白之间存在互作关系㊂这些结果为深入研究M s C N G C蛋白的潜在功能提拱了依据㊂组织表达分析表明,第ⅣB亚家族中M s C-N G C4.1和M s C N G C8.1的组织表达一致,可能与它们的亲缘性较高有关(图1)㊂M s C N G C基因具有组织表达特异性,例如,M s C N G C4.2和M s C-N G C5基因只在花中表达,M s C N G C3.1基因只在叶中表达,说明M s C N G C s在各个组织中发挥着不同的作用㊂类似的,Z m C N G C5在玉米花粉中的特异性表达高于其他组织,Z m C N G C10㊁Z m C N G C11和Z m C N G C12在玉米胚中的表达量都相对较高[27],说明这些基因在玉米的花粉和胚的生长发育中起着至关重要的作用㊂C N G C家族基因参与了非生物胁迫响应过程[13,16,21]㊂转录组数据分析表明,大多数M s C N G C基因在冷㊁盐㊁干旱和A B A胁迫下表达量下降,有少数M s C N G C基因的表达量上升㊂如M s C N G C2.2㊁M s C-N G C5㊁M s C N G C8.4㊁M s C N G C8.5受冷胁迫诱导下在2h显著上调表达,该结果与R c C N G C14和部分油菜籽C N G C s在冷诱导下的表达模式相同[13];第Ⅲ亚家族中M s C N G C7.1和M s C N G C7.2在冷胁迫诱导下的表达水平一致,这与它们可能在进化关系上的亲缘性较高有关(图2A)㊂在盐处理下M s C N G C2.2与拟南芥中的A t C N G C19和A t C N G C20的表达水平类似[19],它们可能参与了植物对盐胁迫时的生理调控㊂M s C N G C5㊁M s C N G C8.5与P t r C N G C15.2㊁P t r C N G C15.3在干旱胁迫下的表达相似[12]㊂研究发现沉默S l C N G C15基因的表达可提高番茄耐旱性,为进一步研究M s C N G C基因在非生物胁迫下的功能提供依据[33-35]㊂4结论本研究对紫花苜蓿的C N G C家族成员进行了鉴定分析,从紫花苜蓿参考基因组中共鉴定出16个M s C N G C基因,并对其蛋白分子特征㊁进化关系㊁保守基序㊁基因结构㊁重复事件㊁共线性关系㊁顺式作用元件和表达模式进行了研究㊂M s C N G C基因被划分为4个亚家族,所有成员均含有c N M P/C N B D和I T P功能域㊂M s C N G C基因家族内存节段重复事件,紫花苜蓿与蒺藜苜蓿和拟南芥之间存在物种间共线性关系㊂M s C N G C基因的启动子区含有大量与非生物应激和激素响应相关的顺式作用元件㊂M s C N G C基因具有组织表达特异性㊂M s C N G C基因参与调控紫花苜蓿的冷㊁干旱㊁盐和A B A等非生物胁迫响应过程,其中,M s C N G C3.2,M s C N G C5和M s C N G C8.5能是调控紫花苜蓿耐干旱的关键差异基因㊂参考文献[1] WU M,L IY,C H E ND,L I U H,e t a l.G e n o m e-w i d e i d e n t i f i c a-t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so f t h e I Q D g e n e f a m i l y i n m o s ob a m b o o(P h y l l o s t ac h y s ed u l i s)[J].S c ie n t if i cR e p o r t s,2016,(6):24520[2] S A A N D M A,X U YP,MU N Y AM P U N D UJ P,e t a l.P h y l o g-e n y a n de v o l u t i o nof p l a n t c y c l i cn u c l e o t i d e-g a 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紫花苜蓿几丁质酶ClassⅠ基因cDNA全长克隆及序列分析
中 图分 类 号 ：Ｑ ８ ７５ 文 献标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２—１０ （０ １０ ０ ２ ０ １０ ３２ ２ １ ２— ０９— ５ Ｊ
苜蓿根腐性病害是 由土传病原 菌侵染导致 的根腐 、 茎基
江苏农 业科 学
２ １ 年第 ３ ０１ ９卷第 ２期
一 ２ ９一
伊亚莉， 关 宁 ， 文 娟 ， ．紫花 苜 蓿 几 丁 质 酶 ＣａｓＩ基 因 ｃ Ｎ 张 等 ｌ ｓ Ｄ Ａ全 长 克 隆及 序 列 分 析 ［ ］ Ｊ ．江 苏 农 业 科 学 ，０ １３ （ ）２ ３ ２ １ ，９ ２ ：９— ４
腐 病 害 ， 一 种 世 界 性 病 害 ， 遍 发 生 在 各 个 苜 蓿 栽 培 地 是 普 区 。 。根 腐 病 对 紫 花苜 蓿 生 长 的 各 个 时期 均 可造 成 严 重 危 害 ， 致 根 的 中柱 腐 烂 ， 茎 和 根 中部 变 空 ， 枝 数 减 少 ， 根 导 根 分 侧 大 量腐 烂 死 亡 ， 固氮 能 力 降 低 ， 命 和利 用 年 限 明显 缩 短 ， 寿 草 产 量 和 品质 下 降 。基 于 上 述 原 因 ， 蓿 根腐 病 的研 究 已 得 苜
用 更 为 突 出 。几 丁质 酶 是 降 解 几 丁 质 的 糖 苷 酶 ， 于 在 大 部 由 分 真 菌 的 细胞 壁 中含 有 几 丁 质 ， 植 物 中虽 不含 几 丁 质 ， 却 而 但 有 几 丁 质 酶 ， 认 为 几 丁 质 酶 在 植 物 抗 病 尤 其 是 抗 真 菌 性 病 故 害 中起 着作 用 。它 在 单 子 叶 和 双 子 叶植 物 中 均 可 分 泌 ， 分 布在胚 、 子 、 叶、 种 子 叶片 、 、 、 、 伤组 织 中 ， 常情 况 下 茎 根 花 愈 正 植 物 体 内 的几 丁 质 酶 含 量 较 低 。 在 受 到 外 界 因 素 诱 导 下 ， 几 丁 质 酶基 因大 量 表 达 ， 丁 质 酶 迅 速 积 累 。 生 物 和 非 生 物 因 几 素均可诱 导植物几丁质酶 的产 生， 生物 因素如 真菌、 细菌 、 病 毒 、 病 毒 等 ； 生 物 因素 如 机 械 损 伤 、 伤 、 类 非 虫 乙烯 、 杨 酸 、 水 紫 外 光 、 金 属 盐 等 重 。几 丁 质 酶 的 分 子 质 量 约 为 ２ ～ ５ ３ ｕ 多 数 以单 体 形式 存 在 ， 有较 高或 较 低 的 等 电 点 ， ５ｋ ， 具 最适
紫花苜蓿多元杂交后代表型多样性分析与选择研究
紫花苜蓿多元杂交后代表型多样性分析与选择研究紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种重要的牧草和土壤改良植物，具有广泛的分布和应用价值。
为了获得更好的牧草品种，我们进行了紫花苜蓿的多元杂交和后代选育工作。
本文旨在通过对紫花苜蓿多元杂交后代的表型多样性进行分析和选择研究，为优良牧草品种的育种提供科学依据。
首先，我们利用不同优良紫花苜蓿品种杂交，获得了一个庞大的后代种群。
这些后代植株主要表现出了各种不同的形态特征，包括植株高度、叶片形状、开花期等。
通过对这些表型特征的详细观察和记录，我们发现了很多变异现象，为选择进一步研究的优良个体提供了依据。
接下来，我们对这些表型变异的后代进行了统计分析，并建立了一个表型指标体系。
我们测量了每个个体的表型特征值，并计算了各个特征之间的相关性。
结果显示，不同表型特征之间存在一定的相关性，并且某些特征可能是多基因控制的。
基于这些结果，我们可以进一步选择具有优良表型特征的个体进行进一步研究和选育。
在选择方面，我们采用了综合评价指数法。
根据上述建立的表型指标体系，我们分别计算了每个个体的综合评价指数，并根据指数高低进行排序。
通过对不同指数的比较，我们可以选择出具有优良表型特征的个体，并将其作为下一代育种工作的目标。
最后，我们对选出的个体进行了进一步的观察和实验证明。
我们通过对这些个体进行形态分析、遗传分析和耐逆性测试等方面的研究，验证了它们的优良性。
同时，我们也发现了一些新的表型特征，并对其进行了遗传基础和应用前景的初步讨论。
综上所述，通过对紫花苜蓿多元杂交后代的表型多样性进行分析和选择研究，我们获得了一批具有优良表型特征的个体，并为进一步的育种工作提供了科学依据。
这些研究成果对于改良紫花苜蓿的品质和产量，促进畜牧业的发展具有重要的意义。
在未来的研究中，我们将深入探究紫花苜蓿的遗传基础和形态调控机制，并结合育种实践，进一步提高紫花苜蓿的综合性状和适应性，以满足不同地区和用途的需求综合以上研究结果，我们成功地分析了紫花苜蓿多元杂交后代的表型多样性，并选出了一批具有优良表型特征的个体。
紫花苜蓿生长相关基因的筛选及验证
紫花苜蓿生长相关基因的筛选及验证紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种广泛应用于畜牧业和土壤改良的多年生草本植物，其具有高产量、优质和耐逆性等特点。
为了深入理解紫花苜蓿的生长发育机理，进行相关基因的筛选和验证对提高种植效益具有重要意义。
本研究旨在通过转录组学和生物信息学方法，对紫花苜蓿生长相关基因进行筛选，并进一步通过实验验证其功能。
该研究采集来自不同生长阶段和组织的紫花苜蓿样品，提取RNA并进行转录组测序。
通过构建文库、测序和数据分析等步骤，获得了大量的转录组测序数据。
在数据分析阶段，我们使用不同的生物信息学工具对转录组数据进行处理和分析。
首先，我们对转录组数据进行质控，并筛选出高质量的序列数据。
接着，我们将序列比对到参考基因组上，使用了多个最先进的比对软件，以确保结果的准确性。
然后，通过计算每个基因的表达水平，并使用差异表达分析方法，鉴定出在不同生长阶段和组织中具有显著差异表达的基因。
最后，通过GO功能注释和KEGG通路分析等手段，确定这些基因的功能和参与的代谢途径。
在基因筛选的基础上，我们选择了一些具有较高差异表达的基因进行进一步的验证。
首先，我们设计了引物，使用qRT-PCR技术对这些基因的表达水平进行实时监测。
实验结果显示，qRT-PCR结果与转录组测序数据的趋势一致，验证了我们筛选基因的准确性和可靠性。
为了进一步验证这些基因的功能，我们利用遗传转化技术对紫花苜蓿进行了遗传改良。
通过转基因紫花苜蓿的生长情况对比分析，我们发现转基因植株在耐盐、耐旱和抗病等方面表现出更好的性状。
综上所述，本研究通过转录组学和生物信息学方法，筛选出了紫花苜蓿生长相关基因，并通过实验验证了这些基因的表达水平和功能。
这些结果为进一步研究紫花苜蓿的生长发育机理，提高紫花苜蓿的品种改良和种植效益提供了理论基础和实践指导。
希望本研究能够对紫花苜蓿的种植和利用提供有益的参考和借鉴综合以上研究结果，本研究通过转录组学和生物信息学方法，成功鉴定出紫花苜蓿生长相关基因，并验证了这些基因的表达水平和功能。
《MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》范文
《MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的牧草作物，在农业生产中具有广泛的应用价值。
然而，由于气候变化和季节性低温的影响，紫花苜蓿的生长发育常常受到限制。
为了提高紫花苜蓿的耐寒性，科学家们一直在寻找有效的基因改良方法。
本研究通过将MfERF028基因导入紫花苜蓿中，旨在提高其耐寒性，为农业生产提供更优质的牧草品种。
二、材料与方法1. 材料本实验选用的材料为紫花苜蓿及其转基因株系。
转基因株系通过将MfERF028基因导入紫花苜蓿获得。
2. 方法（1）基因克隆与表达分析：首先，通过PCR技术克隆MfERF028基因，并构建表达载体。
然后，将表达载体导入紫花苜蓿中，观察其表达情况。
（2）转基因紫花苜蓿的培育与鉴定：将表达载体通过农杆菌介导法导入紫花苜蓿中，筛选出转基因株系。
通过PCR和Southern blot等方法鉴定转基因株系，确保其基因成功整合。
（3）耐寒性试验：在低温条件下，对转基因紫花苜蓿与野生型紫花苜蓿进行生长试验，观察其生长状况和耐寒性变化。
三、结果与分析1. 基因克隆与表达分析结果通过PCR技术成功克隆了MfERF028基因，并构建了表达载体。
将表达载体导入紫花苜蓿后，观察到转基因株系中MfERF028基因的表达水平明显提高。
2. 转基因紫花苜蓿的培育与鉴定结果通过农杆菌介导法成功将表达载体导入紫花苜蓿中，筛选出转基因株系。
PCR和Southern blot鉴定结果表明，转基因株系中成功整合了MfERF028基因。
3. 耐寒性试验结果在低温条件下，转基因紫花苜蓿的生长状况明显优于野生型紫花苜蓿。
转基因紫花苜蓿的叶片颜色更绿，生长速度更快，且抗寒能力更强。
这表明MfERF028基因的导入成功提高了紫花苜蓿的耐寒性。
四、讨论本研究通过将MfERF028基因导入紫花苜蓿中，成功提高了其耐寒性。
这为农业生产提供了更优质的牧草品种，有助于提高农业生产效益和农民收入。
假盘菌诱导下紫花苜蓿不同株系的转录组测序与抗病相关基因差异表达研究
假盘菌诱导下紫花苜蓿不同株系的转录组测序与抗病相关基因差异表达探究引言：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种重要的牧草和绿肥作物，因其高营养价值和良好的氮固定能力而深受农业界的青睐。
然而，紫花苜蓿的产量和质量受到各种病原微生物的恐吓，其中假盘菌（Phomoopsis medicaginis）是紫花苜蓿主要的病原微生物之一。
假盘菌感染引起的病害严峻降低了紫花苜蓿的生长、发育和产量，因此探究紫花苜蓿与假盘菌互作的分子机制对于控制该病害具有重要意义。
方法：本探究选择了对假盘菌具有不同的抗性的紫花苜蓿株系进行探究。
通过人工接种假盘菌感染不同株系的紫花苜蓿，利用高通量测序技术对感染前后的转录组进行测序。
通过比对测序结果与基因组注释数据，确定差异表达基因并进行功能富集分析。
同时利用荧光定量PCR（qPCR）验证差异表达基因在感染过程中的动态变化。
结果：通过转录组测序，我们获得了感染前后不同株系的紫花苜蓿的转录组数据。
在假盘菌感染后，感病株系与抗病株系之间有大量基因表达差异。
通过功能富集分析，我们发现差异表达基因主要涉及到免疫相关、信号传导、转录调控等功能模块。
此外，一些与紫花苜蓿抗病性相关的基因也被发此刻感病株系中表达上调，而在抗病株系中表达下调。
通过qPCR验证，我们进一步确认了这些差异表达基因在假盘菌感染过程中的动态变化。
谈论：本探究结果揭示了不同紫花苜蓿株系中与假盘菌感染相关的差异表达基因，为深度理解紫花苜蓿与假盘菌互作的分子机制提供了重要线索。
免疫相关和信号传导基因的差异表达可能参与了紫花苜蓿对假盘菌的反抗反应。
此外，抗病性相关基因的差异表达也表明了不同株系间抗病性的差异。
进一步探究这些基因的功能和调控网络，将有助于培育抗假盘菌的紫花苜蓿品种，提高其产量和品质。
结论：本探究通过假盘菌诱导下对紫花苜蓿不同株系的转录组测序与差异表达基因探究，发现了感病株系与抗病株系之间大量基因表达差异，并揭示了该差异与免疫相关、信号传导、转录调控等功能模块有关。
紫花苜蓿白粉病病原菌鉴定及其对苜蓿草品质的影响
紫花苜蓿白粉病病原菌鉴定及其对苜蓿草品质的影响紫花苜蓿白粉病病原菌鉴定及其对苜蓿草品质的影响引言：紫花苜蓿（Trifolium pretense L.）作为一种重要的饲料作物，在畜牧业中起到了不可替代的作用。
然而，尽管紫花苜蓿具有较高的抗病能力，但仍然会受到一些病原菌的侵袭。
其中，白粉病病原菌（Erysiphe trifolii）是造成紫花苜蓿受害的主要原因之一。
本文旨在对紫花苜蓿白粉病病原菌进行鉴定，并探讨其对苜蓿草品质的影响。
一、紫花苜蓿白粉病病原菌的鉴定1. 外部形态特征紫花苜蓿白粉病病原菌菌丝生长在寄主植物上形成白色粉状菌层。
观察其形态特征可发现其菌丝短而粗，呈白色，易在潮湿的环境下形成孢子。
2. 菌丝结构特征通过显微镜观察，紫花苜蓿白粉病病原菌的菌丝为单一菌丝结构，没有分支。
菌丝呈透明状，质地柔软。
3. DNA序列分析利用PCR技术提取紫花苜蓿白粉病病原菌的DNA，并进行DNA序列分析。
结果显示，该菌株基因序列与Erysiphe trifolii已知菌株高度相似，进一步确认其病原菌身份。
二、紫花苜蓿白粉病对苜蓿草品质的影响1. 影响产量紫花苜蓿白粉病病原菌侵染苜蓿草后，会使苜蓿草的生长受到抑制，导致产量下降。
病害严重时，甚至会导致草叶凋萎，进一步降低产量。
2. 影响品质白粉病严重侵染紫花苜蓿会导致苜蓿草的品质下降。
病害受损的苜蓿草叶片变得枯黄，丧失了翠绿的颜色。
同时，受到白粉病侵染的苜蓿草会丧失一部分营养物质，从而影响了饲料的营养价值。
3. 传播与防治白粉病病原菌可以通过飞播孢子、种子以及带病的种苜蓿草传播。
为了防止病害传播，应采取合理的防治措施，包括清除病残植株、适时喷洒杀菌剂等。
结论：紫花苜蓿白粉病病原菌是导致紫花苜蓿受害的主要病原菌之一。
对于苜蓿草的影响主要体现在产量和品质上。
为了避免白粉病的发生，农民应注意苜蓿草的防治工作，加强病害监测与控制，提高紫花苜蓿饲料的质量综上所述，紫花苜蓿白粉病是一种严重影响紫花苜蓿草产量和品质的病害。
-紫花苜蓿几丁质酶Class_基因克隆及生物信息学分析
豆 丁 推 荐 ↓精 品 文 档紫花苜蓿几丁质酶ClassⅢ基因克隆及生物信息学分析张文娟李聪*王涌鑫苗丽宏中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草遗传育种实验室,北京,100193*通讯作者,*******************摘要本文根据截叶苜蓿(Medicago trucatula)几丁质酶ClassⅢ基因(GenBank:AY294484.1)的全长序列设计引物，通过RT-PCR的方法得到紫花苜蓿(Medicago sative)几丁质酶ClassⅢ的核酸序列，命名为MsChiⅢ，在NCBI中的登录号为FJ872918。
利用生物信息学软件分析MsChiⅢ，预测氨基酸序列的等电点、二级结构和三级结构，并构建系统发育树。
结果显示该核酸序列全长为953bp，包括完整的开放阅读框，编码301个氨基酸，等电点为8.212。
该序列所编码的蛋白属于几丁质酶18家族的内切酶，分布于细胞间隙，并含有几丁质酶18家族的特征序列———LGDVDFDIE，并预测MschiⅢ可能是一种具有几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。
关键词紫花苜蓿,几丁质酶,ClassⅢ基因,生物信息学Cloning and Bioinformatics Analysis of Chintnase ClassⅢGene in Medicago sativeZhang Wenjuan Li Cong*Wang Yongxin Miao LihongForage Plants'Genetics and Breeding Laboratory,Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing,100193*Corresponding author,*******************DOI:10.3969/mpb.008.000271Abstract The cDNA of chitinase ClassⅢgene(GenBank accession:AY294484.1)from Medicago sative was cloned by RT-PCR,with primers designed according to the sequence of chitinase ClassⅢof Medicago trucatula,It was named as MsChiⅢ,and its GenBank accession number is FJ872918.The isoelectric point of amino acid se-quence,secondary and three-dimersional structures of MsChiⅢwere analysed by bioinformatics software,and the homologue tree of chitinaseⅢwas established.The result showed that the sequence consisted of953bp and had an full open reading frame,which encoded a polypeptide of301amino acid residues.The estimated PI of ClassⅢchiti-nase of Medicago sative was8.212.The protein coded by this sequence as incision enzyme belong to chitinase family18,dispersed in intercellular space,and the amino acid sequence included special sequence of chitinase family18,with an amino acid sequence of LGDVDFDIE.The effects of chitinase ClassⅢwould include chitinase and lysozyme.Keywords Medicago sative,Chitinase,ClassⅢgene,Bioinformatics苜蓿是全世界最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。
《2024年MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》范文
《MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》篇一一、引言紫花苜蓿，作为世界各地重要的豆科作物之一，在饲料生产和生态系统稳定性中具有不可或缺的作用。
然而，低温和严寒的气候环境经常会对紫花苜蓿的生长和产量造成严重影响。
为了增强紫花苜蓿的耐寒性，提高其在寒冷环境下的生存能力，近年来，利用基因工程技术进行植物耐寒性改良的研究备受关注。
本研究旨在探讨MfERF028基因在提高转基因紫花苜蓿耐寒性方面的应用及其潜在机制。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验选取了紫花苜蓿作为实验材料，并成功克隆了MfERF028基因。
MfERF028基因是一种与植物耐寒性相关的转录因子基因。
2.2 实验方法（1）构建转基因载体：将MfERF028基因与植物表达载体连接，构建转基因载体。
（2）转化紫花苜蓿：利用农杆菌介导法将转基因载体导入紫花苜蓿中，获得转基因紫花苜蓿。
（3）耐寒性检测：通过低温处理和观察其生长状况，检测转基因紫花苜蓿的耐寒性。
（4）基因表达分析：利用实时荧光定量PCR技术，分析MfERF028基因在转基因紫花苜蓿中的表达情况。
三、结果与分析3.1 转基因紫花苜蓿的获得与鉴定通过农杆菌介导法成功将MfERF028基因导入紫花苜蓿中，获得了转基因紫花苜蓿。
通过PCR鉴定和DNA测序验证，确认了MfERF028基因已经成功整合到紫花苜蓿的基因组中。
3.2 转基因紫花苜蓿的耐寒性检测低温处理后，转基因紫花苜蓿的存活率明显高于非转基因紫花苜蓿。
此外，转基因紫花苜蓿在低温下的生长速度和叶片的绿度也优于非转基因紫花苜蓿。
这些结果表明MfERF028基因提高了转基因紫花苜蓿的耐寒性。
3.3 MfERF028基因的表达分析实时荧光定量PCR结果显示，在低温处理后，转基因紫花苜蓿中MfERF028基因的表达量明显高于非转基因紫花苜蓿。
这表明MfERF028基因的表达与紫花苜蓿的耐寒性有密切关系。
四、讨论本研究表明，MfERF028基因能够提高转基因紫花苜蓿的耐寒性。
《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》范文
《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有丰富的营养价值和生态价值。
近年来，随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，对紫花苜蓿的基因功能研究逐渐成为热点。
SKIP（Skipping）基因作为一类重要的调控基因，在许多植物的生长、发育及响应逆境中起到关键作用。
本文以紫花苜蓿为研究对象，通过对SKIP 同源基因的克隆和功能鉴定，探讨其功能特点，以期为进一步的研究提供参考。
二、实验材料与方法1. 材料本实验选取紫花苜蓿为实验材料，相关试剂和仪器均购自正规渠道。
2. 方法（1）基因克隆a. 提取紫花苜蓿的DNA；b. 设计并合成特异性引物；c. 通过PCR技术扩增SKIP同源基因；d. 连接T载体并转化至大肠杆菌；e. 筛选阳性克隆并测序验证。
（2）功能鉴定a. 构建SKIP同源基因的过表达载体；b. 通过遗传转化法将过表达载体导入植物中；c. 观察并记录转基因植物的生长状况；d. 对转基因植物进行逆境处理，观察其抗逆性；e. 利用生物信息学软件分析基因表达模式。
三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR扩增，成功克隆了紫花苜蓿的SKIP同源基因。
连接T载体并转化至大肠杆菌后，筛选出阳性克隆并进行了测序验证，结果表明所克隆的基因序列与已知的SKIP同源基因序列高度相似。
2. 功能鉴定结果（1）过表达载体的构建及遗传转化成功将SKIP同源基因构建至过表达载体中，并通过遗传转化法成功将过表达载体导入紫花苜蓿中。
（2）转基因植物的生长状况观察在正常生长条件下，转基因植物与野生型植物相比，生长状况无明显差异。
然而，在逆境处理后，转基因植物的抗逆性明显增强，表现出更好的生长恢复能力。
（3）生物信息学分析通过对转基因植物的基因表达模式进行分析，发现SKIP同源基因在紫花苜蓿中的表达受到多种环境因素的调控，具有较高的表达活性。
此外，该基因在紫花苜蓿的生长发育及抗逆过程中发挥重要作用。
紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析
紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析
紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析
本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.
作者：王步云李聪王涌鑫关宁苗丽宏 Wang Buyun Li Cong Wang Yongxin Guan Ning Miao Lihong 作者单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,牧草遗传育种研究室,北京,100193 刊名：分子植物育种英文刊名：MOLECULAR PLANT BREEDING 年，卷(期)：2009 7(2) 分类号：S6 关键词：几丁质酶基因紫花苜蓿克隆分析。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)高效遗传转化与基因组编辑体系的建立与优化
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）高效遗传转化与基因组编辑体系的建立与优化紫花苜蓿（Medicago sativa L.），又称草豆，是一种重要的经济作物和饲料植物，具有广泛的应用价值。
近年来，随着基因工程技术的快速发展，紫花苜蓿的高效遗传转化与基因组编辑体系的研究成为了热门课题。
高效遗传转化是基因工程研究的关键一步。
紫花苜蓿的主要遗传转化方法包括农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化。
农杆菌介导的转化是目前最常用的遗传转化方法之一，它通过农杆菌将外源基因导入植物细胞。
基因枪介导的转化则是利用金粒枪将外源DNA迅速“炮入”植物细胞，突破植物细胞的保护屏障。
这两种方法各有优劣，研究人员可以根据具体需求选择合适的方法进行遗传转化。
遗传转化的关键是选择合适的载体和选择合适的转化子。
在紫花苜蓿的遗传转化研究中，研究人员通常选择转化质粒和短小DNA片段作为载体。
而转化子则需要具有强大的转化能力和稳定的遗传表达，以确保外源基因可以稳定地表达在植株中。
基因组编辑是指通过直接改变生物体的基因组来达到特定的目的。
它通常包括诱导突变、基因敲除和基因改造等技术。
基因组编辑技术的研究在农业和医药领域具有重要的应用前景。
紫花苜蓿基因组编辑的研究主要集中在利用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行敲除和改造。
CRISPR/Cas9系统是一种刚刚兴起的基因组编辑技术，它通过导引RNA与Cas9蛋白的结合来实现DNA的切割和编辑。
研究人员通过将CRISPR/Cas9系统导入紫花苜蓿细胞，并设计合适的导引RNA序列，可以针对目标基因进行精确的编辑。
由于紫花苜蓿是一种自交不纯的植物，其遗传转化和基因组编辑体系的建立与优化会受到自交不纯性产生的困扰。
因此，研究人员需要在选择父本和控制自交过程时谨慎选择，以提高遗传转化和基因组编辑的效率。
此外，研究人员还需要考虑到遗传编辑的效果和安全性。
在使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑时，需要确保编辑的基因在整个遗传过程中稳定传递，并且不会对植物的生长和发育造成不良影响。
《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》范文
《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿是一种重要的豆科植物，因其营养丰富、适应性强等特点被广泛种植。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的基因被克隆并鉴定其功能。
其中，SKIP基因家族作为一种重要的调节因子，在多种生物过程中发挥重要作用。
因此，本实验旨在克隆紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并对其功能进行鉴定。
二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括紫花苜蓿植株、PCR引物、酶类试剂、载体等。
2. 方法（1）基因克隆通过生物信息学分析，确定紫花苜蓿中SKIP同源基因的序列。
设计特异性引物，利用PCR技术扩增目标基因片段。
将扩增得到的DNA片段与载体连接，转化至感受态细胞中，筛选阳性克隆。
（2）功能鉴定利用生物信息学软件预测SKIP同源基因的编码蛋白的结构和功能。
构建过表达和沉默载体，通过遗传转化技术将载体导入紫花苜蓿中。
观察转基因紫花苜蓿的生长状况、抗病性、抗逆性等表型变化，以及相关基因的表达水平变化，从而鉴定SKIP同源基因的功能。
三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR扩增，成功获得了紫花苜蓿中SKIP同源基因的DNA片段。
将DNA片段与载体连接后，转化至感受态细胞中，筛选出阳性克隆。
测序结果表明，克隆得到的DNA片段与预期的SKIP同源基因序列一致。
2. 功能鉴定结果（1）生物信息学分析通过生物信息学软件预测，紫花苜蓿中SKIP同源基因编码的蛋白具有典型的SKIP结构域，可能参与多种生物过程。
（2）过表达和沉默实验构建过表达和沉默载体，通过遗传转化技术将载体导入紫花苜蓿中。
观察转基因紫花苜蓿的生长状况、抗病性、抗逆性等表型变化，发现过表达SKIP同源基因的转基因紫花苜蓿表现出更强的生长势和抗病性；而沉默该基因的转基因紫花苜蓿则表现出生长受抑、抗病性降低等表型变化。
此外，通过检测相关基因的表达水平变化，进一步证实了SKIP同源基因在紫花苜蓿中的功能。
四、讨论本实验成功克隆了紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并对其功能进行了鉴定。
《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》范文
《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有丰富的营养价值和生态价值。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对紫花苜蓿的基因研究逐渐深入。
SKIP基因作为一种重要的调控基因，在多种生物中发挥着重要的功能。
因此，本文旨在克隆紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并对其功能进行鉴定，以期为进一步研究紫花苜蓿的生长发育和抗逆机制提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的紫花苜蓿材料采自于……（具体地点），经过无菌处理后用于基因克隆实验。
2. 方法（1）基因克隆a. RNA提取及cDNA合成：从紫花苜蓿中提取总RNA，反转录合成cDNA。
b. 设计引物：根据已知SKIP基因的序列信息，设计特异性引物。
c. PCR扩增：以cDNA为模板，进行PCR扩增，获得SKIP 同源基因片段。
d. 序列分析：对PCR产物进行测序，分析序列信息。
（2）功能鉴定a. 表达模式分析：通过实时荧光定量PCR技术，分析SKIP 同源基因在紫花苜蓿不同组织、不同发育阶段的表达情况。
b. 转基因植物构建及功能验证：构建SKIP同源基因的过表达和敲除植物，观察其对植物生长、抗逆性能等方面的影响。
c. 蛋白质互作分析：通过酵母双杂交等技术，分析SKIP同源基因与其他蛋白质的互作关系。
三、实验结果1. 基因克隆结果通过上述方法，成功克隆了紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并进行了序列分析。
结果表明，该基因与已知的SKIP基因具有较高的相似性，表明其可能具有相似的功能。
2. 功能鉴定结果（1）表达模式分析结果实时荧光定量PCR结果表明，SKIP同源基因在紫花苜蓿的不同组织、不同发育阶段中均有表达，且表达量存在一定的差异。
这表明该基因可能参与紫花苜蓿的多种生物过程。
（2）转基因植物构建及功能验证结果过表达和敲除植物的实验结果表明，SKIP同源基因对紫花苜蓿的生长、抗逆性能等方面具有显著影响。
过表达植物表现出更强的生长势和抗逆性能，而敲除植物则表现出相反的趋势。
《利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究》范文
《利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究》篇一一、引言随着全球气候的变化和人类活动的加剧，土壤盐渍化问题日益严重，对农业生产产生了重大影响。
紫花苜蓿作为一种重要的牧草作物，其耐盐性的提高对于改善盐碱地的利用效率和农业可持续发展具有重要意义。
近年来，转基因技术的发展为作物育种提供了新的途径。
本研究旨在利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质，以提高紫花苜蓿在盐碱地的生长和产量。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为紫花苜蓿的基因组DNA和耐盐相关基因。
耐盐相关基因来源于已经报道的具有耐盐性的植物基因库。
2. 方法（1）基因克隆与载体构建：通过PCR扩增、酶切、连接等分子生物学技术，将耐盐相关基因克隆到表达载体中，构建成重组质粒。
（2）紫花苜蓿遗传转化：采用农杆菌介导的遗传转化方法，将重组质粒导入紫花苜蓿的基因组中，获得转基因紫花苜蓿。
（3）转基因紫花苜蓿的筛选与鉴定：通过PCR和Southern Blot等技术，对转基因紫花苜蓿进行筛选和鉴定，确认目的基因的成功导入和整合。
（4）耐盐性评价：在含有不同盐浓度的土壤中种植转基因紫花苜蓿和非转基因紫花苜蓿，比较两者的生长情况和生物量，评价转基因紫花苜蓿的耐盐性。
三、结果与分析1. 基因克隆与载体构建结果通过PCR扩增、酶切、连接等分子生物学技术，成功克隆了耐盐相关基因，并构建了表达载体。
经测序验证，目的基因序列正确，无突变。
2. 转基因紫花苜蓿的获得与鉴定结果采用农杆菌介导的遗传转化方法，将重组质粒导入紫花苜蓿的基因组中，获得了转基因紫花苜蓿。
通过PCR和Southern Blot 等技术，确认目的基因的成功导入和整合。
3. 耐盐性评价结果在含有不同盐浓度的土壤中种植转基因紫花苜蓿和非转基因紫花苜蓿，发现转基因紫花苜蓿在较高盐浓度下的生长情况和生物量明显优于非转基因紫花苜蓿。
这说明目的基因的成功导入和整合提高了紫花苜蓿的耐盐性。
四、讨论本研究利用转基因技术成功创建了紫花苜蓿耐盐新种质，提高了紫花苜蓿在盐碱地的生长和产量。
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紫花苜蓿基因组测序及分析
近年来,随着基因组测序技术的不断发展越来越多的植物基因组序列得到完善。
通过基因组测序,可以系统地解析植物基因功能。
紫花苜蓿具有优良的农艺性状,是全世界种植范围最广的牧草作物,具有“牧草之王”的美称。
在我国,紫花苜蓿生长主要集中在北方地区,这些地区气候寒冷,容易发生低温冻害,造成苜蓿减产,大大降低苜蓿的生产效益。
肇东苜蓿作为紫花苜蓿的地方品种之一,具有良好的抗寒特性。
因此,本研究以肇东苜蓿为主要研究材料,进行基因组测序、组装及注释,获得基因组草图;对其它四种紫花苜蓿品种:阿尔冈金、WL168、WL525和WL440进行基因组重测序,
挖掘抗寒相关的SNP。
同时,对紫花苜蓿AP2/ERF转录因子进行挖掘分析,构建紫花苜蓿AP2/ERF
基因调控网络,系统的解析紫花苜蓿AP2/ERF转录因子在抗寒胁迫中的调控机制。
主要研究成果如下:1.紫花苜蓿全基因组组装及注释分析通过高通量测序,评估
紫花苜蓿基因组大小为1107M左右,杂合率为1.77%,通过组装获得紫花苜蓿基因组草图。
进一步注释分析,挖掘119194个蛋白质编码基因,它们主要的功能集中在信号转导机制、蛋白质翻译后修饰、防御机制以及转录调控等生物过程。
2.紫花苜蓿抗寒性状相关遗传变异的挖掘通过四个紫花苜蓿品种进行基因组重测序,发掘紫花苜蓿品种间的遗传变异(SNP),获得8909604个遗传变异;结合5个紫花苜蓿品种的抗寒性数据,挖掘82838个SNP与紫花苜蓿抗寒性状形成相关。
这些SNP分布在14372个基因上,它们主要涉及转录调控、还原代谢和信号转导等过程。
进一步富集分析发现,AP2/ERF、bHLH、MADS、NAC、MYB以及WRKY
等基因家族可能在紫花苜蓿抗寒过程中起关键调控作用。
3.紫花苜蓿AP2/ERF转录因子分子调控机制研究对紫花苜蓿全基因组进行分析,发掘了139个AP2/ERF转录因子,其成员分布在3个亚家族中;挖掘紫花苜蓿与模式植物拟南芥的基因互作关系,构建紫花苜蓿的基因调控网络,系统的解析紫花苜蓿的分子调控网络,将来为紫花苜蓿基因资源的利用奠定了理论基础。