蛋白纯化技术路线
his蛋白纯化操作步骤全
His蛋白的纯化一目的蛋白样液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌种复苏，将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基)，以未加菌的K+ LB培养基作空白对照，37度摇床培养12-16h。
3：扩大培养，将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6（2h左右）4：诱导表达，扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg，使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h，置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体，离心，5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体，用PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌（有效时间30-40min，超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性）7：蛋白提取液的收集，离心，5000r 15min取上清（可4度保存），菌体保存，测菌体中目的蛋白含量大小使用8：介质处理，取出底帽滴出多余液体，柱子顶部朝上直立固定好，蒸馏水洗涤一次，再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子，最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。
9：介质与核酸结合，从柱子上部加入蛋白提取液，4度旋转混匀1h，收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次，以最大限度提高结合力)10：取10ml 1*binding buffer洗树脂，洗2次，流出液标记洗涤顺序保存11：样品的收集，取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10，每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴（第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可，若需要可适当增加）12：树脂的保存，若样品体积大于柱子体积，树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用，若不使用可用蒸馏水洗涤树脂，加入20%乙醇10ml -20度保存（一种蛋白树脂可重复使用，注意不要超过树脂的结合能力）二检测收集的样品中目的蛋白量的大小13：取13个1.5mlEP管，分别标记1#，2#，3#……10#，A,B,C从1号EP 管内取30ul样液于1#号EP管内，依次移取至10号于10#号，取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。
纯化蛋白步骤
纯化蛋白步骤
嘿，咱今儿就来说说纯化蛋白这档子事儿！这纯化蛋白啊，就好比是从一堆乱糟糟的杂物里找出那颗最闪亮的宝石。
你想想看，细胞里面那可是啥都有啊，各种分子啊、化合物啊搅和在一起，就跟那菜市场似的热闹。
咱要的蛋白就像是藏在这菜市场里的宝贝，得把它给挑出来。
那咋挑呢？第一步，得先把细胞给弄破了，让里面的东西都跑出来。
这就好比是打开宝库的大门，东西都在那儿摆着呢。
然后呢，就得用各种方法把蛋白和其他那些杂七杂八的分开。
比如说，可以根据蛋白的大小、电荷啥的来搞。
这就跟挑苹果似的，大的小的、红的绿的得分清楚吧。
咱纯化蛋白也是这个理儿。
有时候得用层析柱，让蛋白乖乖地顺着柱子流下来，其他的就被拦住了。
这不就把蛋白给单独拎出来啦？
还有啊，纯化的过程可得细心着点，就跟绣花似的。
一点差错都可能让蛋白不纯了，那可就白忙活啦！比如说温度啦、酸碱度啦，都得控制好。
你说要是温度太高，那不就把蛋白给烫坏啦？那不就成了煮鸡蛋啦！
纯化蛋白可真是个技术活，需要耐心和细心。
每一步都得小心谨慎，就跟走钢丝似的。
但当你最后拿到那纯纯的蛋白的时候，哇，那感觉，就跟打了一场大胜仗一样！心里那个美呀！
咱做实验不就是这样嘛，过程虽然辛苦，但看到成果的时候，一切都值啦！所以啊，别害怕纯化蛋白这事儿，大胆去干，肯定能成功的！就把它当成一次有趣的探险，去找到属于你的那颗蛋白“宝石”吧！。
蛋白分离纯化 (2)
蛋白分离纯化概述蛋白分离纯化是生物学研究中常用的实验技术，用于从复杂的生物样品中分离和纯化目标蛋白质。
它是研究蛋白质功能和结构的重要手段，并在生物制药、基因工程和临床诊断等领域发挥着重要作用。
本文将介绍蛋白分离纯化的常用方法和技术。
方法1. 细胞破碎首先，需要将目标蛋白质所在的细胞破碎，以释放蛋白质。
常用的方法有机械破碎、化学破碎和超声破碎等。
机械破碎利用高速离心等手段打碎细胞壁，将细胞质释放出来。
化学破碎则通过溶解细胞膜和核膜，将蛋白质释放到溶液中。
超声破碎则利用超声波的振动力将细胞破碎，释放细胞内的蛋白质。
2. 固体分离经过细胞破碎后，需要将破碎后的混合物进行固体分离，将杂质和非目标蛋白质去除。
常用的方法包括离心和滤过。
离心利用离心机的离心力将混合物中较大的颗粒（如细胞碎片）沉淀下来，得到上清液。
滤过则通过滤纸、膜过滤器等，在物理上阻隔较大的颗粒和溶质，得到过滤液。
3. 蛋白分离蛋白分离是蛋白纯化的核心步骤。
常用的方法有凝胶过滤、凝胶电泳和亲和层析等。
a. 凝胶过滤凝胶过滤是一种基于蛋白质分子大小的分离方法。
将混合物通过一组具有不同孔径的凝胶，蛋白分子会根据其大小在凝胶中被阻滞或通过，从而实现蛋白的分离。
凝胶过滤分离方法操作简单，且对蛋白溶液稳定性要求低，但分辨率较低。
b. 凝胶电泳凝胶电泳是一种基于蛋白质电荷和大小的分离方法。
将混合物加载在凝胶的一侧，然后通过电场使蛋白质在凝胶中迁移，根据其电荷情况和大小分离。
凝胶电泳分离方法分辨率较高，可以同时分离多个蛋白质，但操作较复杂。
c. 亲和层析亲和层析是一种通过蛋白质与特定分子之间的亲和力进行分离的方法。
常用的亲和层析包括金属离子亲和层析、抗体亲和层析和亲和酶标记层析等。
这些方法基于目标蛋白和特定分子之间的特异亲和性进行分离，具有高选择性和高纯度的优势。
4. 纯化蛋白分离后，可以通过多次重复上述的蛋白分离步骤，进一步提高蛋白的纯度。
此外，还可以利用柱层析、凝胶过滤等方法进一步去除杂质。
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。
常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。
此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
Protocol蛋白质纯化步骤
Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V）7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？9. 3V BB;柱层析10.上样；11. 10V Washing Buffer（WB）；12. 6V Elute Buffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl: 58.44×4=233.76gTris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824gImidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g2. 8×CB: 400mM NiSO41000mlNiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.06×6=360.36gNi柱纯化蛋白注意事项(2011-10-13 16:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。
蛋白质 分离纯化主要方法
原始缓 冲溶液 的反离 子
5.再生阶段： 用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用
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样品溶液
梯度浓度
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应用
制备、纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分
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基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、
sepharose、sephadex
应用 分离纯化酶、 抗原、抗体
分离纯化核酸 研究酶的结构与功能
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聚焦层析（Chromatofocusing） 原理
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其 分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行 为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过 程叫做聚焦效应。
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（三）按支持介质形状不同 1.薄层电泳 ； 2.板电泳 ； 3.柱电泳。 （四）按用途不同可分为： 1.分析电泳； 2.制备电泳； 3.定量免疫电泳；
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（五）按所用电压不同可分为： 1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适
于分离蛋白质等生物大分子。 2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有
电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。
4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯
度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集
成很窄的区带。
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（二）按支持介质的不同可分为： 1.纸电泳 2.醋酸纤维薄膜电泳 3.琼脂凝胶电泳 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
蛋白质分离纯化方法汇总(简洁版)思维导图
02分离纯化 1.流程
1.前处理 1.目的溶液溶解状态释放酶
2.方法 1.细胞破碎 1.微生物（细菌）超声振荡
石英砂研磨
溶菌酶处理
2.动物
电动捣碎机
超声处理3.植物石英砂研磨
纤维素酶
2.提取
加缓冲液，过滤或离心除去细胞碎片及不溶物2.粗分级分离 1.目的分离所需蛋白和其他杂蛋白
2.方法 1.易沉淀盐析
等电点沉淀
有机溶剂分级分离
2.不易沉淀超过率凝胶过滤
冷冻真空干燥
3.细分级分离
1.目的制品纯化，除去大部分杂蛋白
2.方法 1.柱层析凝胶过滤层析
离子交换层析
吸附层析
亲和层析
2.电泳
凝胶电泳
等电聚焦4.结晶只有某种蛋白质在溶液中占有绝对数量优势，才能形成结晶
结晶本身也伴随一定程度的纯化，纯度越高，越容易结晶
2.分类（按纯化依据） 1.分子量 1.测定透析法
超离心法
沉降平衡法
沉降速度法
凝胶过滤法
SDS-PAGE
质谱法
2.纯化凝胶过滤（分子筛层析）
SDS-PAGE
超过滤
2.电荷电泳纸电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
毛细管电泳
等电聚焦（IEF）
双向电泳第一向：IEF
第二向：SSDS-PAGE
离子交换层析
3.溶解度盐析
等电点沉淀
有机溶剂分级分离
4.亲和力亲和层析
5.极性逆流分配
纸层析
薄层层析
聚丙烯酰胺薄膜层析
3.纯度鉴定 1.电泳分析IEF
PAGE
SDS-PAGE
2.超速离心
3.HPLC（高效液相色谱）。
蛋白表达纯化实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载蛋白表达纯化实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。
另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。
3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。
4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。
加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。
可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。
10、超声波裂解。
1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。
蛋白纯化技术路线
蛋白纯化技术路线
1.寻找来源：确定需要纯化的蛋白质所在的生物样品，可以是细胞提取物、细菌发酵液、动物组织等。
2.预处理：对样品进行预处理来去除非目标蛋白质和杂质，使目标蛋白更容易纯化。
常见的预处理方法包括超声破碎、离心、滤过等。
3.亲和层析：使用亲和层析柱选择性地结合目标蛋白质。
亲和层析柱可以根据目标蛋白质的性质选择，例如亲和剂可以是金属离子、抗体、某种结构域等。
目标蛋白质被结合到柱子上后，其他非目标蛋白质可以通过洗脱步骤洗脱下来。
4.尺寸排阻层析：利用蛋白质的分子量差异进行分离。
此步骤常用于去除亲和层析步骤中残留的杂质和非目标蛋白质。
5.离子交换层析：利用蛋白质在不同离子浓度条件下的电荷差异来实现分离。
在正负电荷基质之间的交换，可以根据蛋白质的电荷特性进行选择性结合和洗脱。
6.亲水性层析：利用蛋白质的亲水性差异进行分离。
亲水性层析可以通过调整盐浓度和pH值来选择性结合和洗脱目标蛋白质。
7.透析：用于去除层析步骤中使用的缓冲剂、杂质与目标蛋白之间的物质交换。
8.浓缩：用于将目标蛋白溶液浓缩至适当的浓度，以便于后续的研究操作。
9.纯化效果验证：使用蛋白质分析方法（如SDSPAGE、Westernblot等）来验证纯化的效果和目标蛋白质的纯度。
蛋白纯化工艺
裂解操作注意点
１、缓冲液为 10mMTris-HCl-1mMEDTA PH8.0 2、菌体与缓冲液的比例为为1:8,这是质量体积 比 3、整个过程中缓冲液的温度要控制在１０℃以下, 如 温度超过,可以向裂解液中加冰或冷水浴的方法降温。
超滤浓缩（脱盐）
原理 利用压力或离心力，强行使水和其他小分子通过 半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐 的目的。 我们公司超滤膜的分子截留量为10000。 操作注意事项： １、进出口压力压力差保持为 20psi,如发现压力超过以 上数值,要立即停止操作,查明超压的原因并解决后方 可以重新操作,以免造成膜包损伤。 ２、超滤脱盐时要使溶液的电导小于0.2 × 103 us/cm.
原理 是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一 种较为常用的方法。 不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性 作用力强弱不同，溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分 子与疏水层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将 待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度 选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗 脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。疏水 作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。 特点：高盐上样，低盐洗脱 操作过程：柱子处理 平衡 上样 洗脱 收集 后处理
裂解
裂解方法--化学渗透法
化学渗透法
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、 金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而 使胞内物质有选择地渗透出来。 EDTA螯合 EDTA 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的 外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质 来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将 脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填 补，从而导致内层膜通透性的增强。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。
蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。
下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。
1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。
先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。
使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。
2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。
它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。
原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。
该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。
3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。
其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。
4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。
超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。
5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。
配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。
原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。
6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。
利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。
蛋白纯化步骤
纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。
纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。
对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。
目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。
近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。
在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。
在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。
从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。
发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。
制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60） ，6（60—90） ，15（20—90） ，31（30—60） ，31（60—90） ，45（20—90） ，50（20—90） ，55（20—90） ，70（30—60） ，70（60—90） ，72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。
蛋白的分离纯化详解(分析“蛋白质”文档)共63张PPT
学反应。 蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。
最常用的蛋白定量方法是凯氏定氮法， Lowry Folin法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等。 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。 生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。 而可用于ELISA的抗体则有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。 配体特异性结合 重点 为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该 过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。
Ve，即可从图中得到样品的分子量。
SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的
• 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话） 的分子量；
• SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量； • 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得
蛋白质每条多肽链的分子量。 • 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信
平衡离子：H+, Na+, Cl-, OH-
基本液中） 3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰
4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
• 分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分 次洗脱样品蛋白的方法；
• 梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。
变性和复性
• 原理：蛋白质在一定的理化条件下失去原 有的空间结构、生物学功能及部分理化特 性等称为变性。当变性条件去除后恢复原 有的空间结构及生物学功能即为复性。
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯化 原核表达蛋白
蛋白质下游纯化工艺简介
蛋⽩质下游纯化⼯艺简介蛋⽩质下游纯化⼯艺简介Downstream（下游）与上游相对的概念，⼀般⽽⾔，上游指基因克隆、细胞培养等⽬的产物表达⼯序，下游指从表达有⽬的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的⽬的产物的⼀系列步骤。
美、⽇、欧等发达国家⽣物技术产品⼯业化的实践证明：⽣物技术产品的产业化⾼度依赖于基因⼯程下游⼯序技术及设备的进步。
⼀、纯化⼯艺常⽤衔接技术：1、盐析。
常采⽤硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20℃)中可以长期保存。
2、等电点沉淀。
根据蛋⽩质、多肽在等电点时溶解度最⼩的特点进⾏。
3、有机溶剂沉淀。
采⽤冷的丙酮、⼄醇沉淀蛋⽩质。
例如⼈⾎浆蛋⽩的⼄醇分级沉淀。
4、透析。
根据⽬的蛋⽩质、多肽的分⼦量，选取适宜的透析袋进⾏透析，可以起到更换缓冲液以及去除⼀些低分⼦杂质的⽬的。
5、超滤。
根据⽬的蛋⽩质、多肽的分⼦量，选取适宜截留分⼦量(MWcutoff)的超滤膜进⾏超滤。
6、真空冷冻⼲燥。
利⽤在低温和⾼真空条件下，冰不经融化为液态⽔⽽直接升华为⽔蒸⽓的原理。
可以很好地浓缩样品和保存蛋⽩质、多肽的⽣物活性。
7、变性沉淀。
根据⽬的蛋⽩质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较⾼的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的⽅法。
例如胸腺肽制备中使⽤的热变性(~80℃)去除杂蛋⽩。
如果⽬的蛋⽩、多肽本⾝热稳定性、酸碱稳定性不⾼则不宜采⽤。
8、离⼼沉淀。
利⽤离⼼沉降⼒将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采⽤⾼速冷冻离⼼机进⾏。
9、脱盐。
透析、超滤可⽤于进⾏脱盐，SephadexG25、G50常⽤于蛋⽩质脱盐。
10、过滤澄清过滤、除菌过滤（微⽶膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）⼆、蛋⽩质、多肽液相⾊谱纯化⽅法简介chromatography，⾊谱，层析表1常⽤的液相⾊谱纯化⽅法及其原理1、纯化的⼀般⽬标和⽅法⾸先，⾃然来源或者重组表达的蛋⽩质经过⼀些粗提的步骤（例如：匀浆、离⼼、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以⽤于⾊谱分离的样品。
蛋白质纯化色谱技术
手动（六通阀）进样器
进样位置
废液
样品
流动相
接色谱柱
进样阀
样品
采样位置
废液
流动相
接色谱柱
（ＬＯＡＤ）
（ＩＮＪＥＣＴ）
定量环
层析柱（填料/介质）
分离的关键场所 使用方法不同，先查阅说明书 注意清洗保养 防止气泡进入 样品及缓冲液的预处理 保湿
填料（层析介质）
分离官能团； 基质骨架； 粒径/分辨率；
ÄKTAexplorer
Fast method and process development and scale-up for proteins, peptides and nucleic acids
Fully equipped for development tasks
Options: Autosampler Sample pump Air sensors
04
峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀
05
常见问题分析
四、疏水性相互作用色谱 (Hydrophobic Interaction Chromatography）
ÄKTAFPLC
Options: Valves Sample Pump Air sensors
Reliable, well proven technology High performance purification of proteins
ÄKTA prime
Options: Valves Sample Pump Air sensors
2
K＝ 固定相溶质浓度/流动相溶质浓度
3
分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。
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蛋白纯化技术路线
引言：
蛋白质是生物体内至关重要的分子，它们在生理过程中发挥着关键作用。
为了更好地研究和利用蛋白质，科学家们开发了蛋白纯化技术。
本文将介绍一种常用的蛋白纯化技术路线，以及其在生物医学研究和工业生产中的应用。
1. 样品准备
在进行蛋白纯化之前，首先需要准备好含有目标蛋白的样品。
样品可以来源于细胞培养物、动物组织或生物体液等。
为了保持蛋白的活性和稳定性，样品的处理过程中需要严格控制温度、pH值和离子浓度等因素。
2. 细胞破碎与提取
对于细胞培养物样品，需要将细胞破碎并将蛋白提取出来。
常用的方法包括机械破碎、超声波破碎和化学溶解等。
破碎后的细胞溶液中含有大量的蛋白质、核酸和其他杂质。
3. 初步纯化
为了去除细胞溶液中的杂质，可以采用一系列的初步纯化方法。
例如，可以通过离心、过滤和沉淀等步骤去除细胞碎片、核酸和大分子蛋白等。
这些方法能够快速地减少样品中的杂质，提高目标蛋白的纯度。
4. 亲和层析
亲和层析是一种常用的蛋白纯化技术，它基于目标蛋白与特定配体之间的亲和作用。
首先将配体固定在亲和树脂上，然后将样品与亲和树脂一起混合，使目标蛋白与配体结合。
通过洗脱步骤，可以将目标蛋白从其他杂质中分离出来。
5. 凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子大小进行分离的方法。
通过选择合适的凝胶材料和孔径大小，可以将目标蛋白与其他分子分离开来。
凝胶过滤层析可以快速获得纯度较高的蛋白样品。
6. 离子交换层析
离子交换层析是基于蛋白质与固定在离子交换树脂上的离子之间的相互作用进行分离的方法。
通过调节溶液的离子强度和pH值，可以控制蛋白质与离子交换树脂的相互作用，从而实现目标蛋白的分离纯化。
7. 分子筛层析
分子筛层析是一种根据蛋白质的尺寸和形状进行分离的方法。
通过选择合适的分子筛材料和孔径大小，可以将目标蛋白与其他分子分离开来。
分子筛层析可以进一步提高蛋白样品的纯度。
8. 超滤和浓缩
为了去除溶液中的小分子杂质和水分，可以使用超滤膜对样品进行
浓缩。
超滤膜具有特定的孔径，可以将小分子从溶液中分离出来。
通过适当的浓缩处理，可以得到高浓度的目标蛋白样品。
9. 确定纯化效果
在蛋白纯化过程中，需要对每一步纯化操作进行监测和评估。
常用的方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting和质谱分析等。
这些方法可以帮助确定蛋白样品的纯度和活性。
结论：
蛋白纯化技术路线是一项复杂而关键的技术，对于生物医学研究和工业生产具有重要意义。
通过合理选择和组合不同的纯化方法，可以获得高纯度和高活性的蛋白样品。
蛋白纯化技术的发展将为我们更好地理解蛋白质的结构和功能，以及开发蛋白质药物和生物制品提供有力支持。