成年小鼠心脏脂肪细胞分离培养的protocol
小鼠原代心肌细胞分离
分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。
3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。
9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
乳鼠心肌细胞分离及培养程序
下文所述程序改编于Speicher和McCarl（1974）的方法。
实验需要两把弯头的解剖剪，两把5号钳子，一个25-ml的带橡皮塞的锥形瓶，内装一搅拌棒。
所有器械使用前均应消毒灭菌。
为了进一步保证无菌条件，最好用一次性无菌塑料用品。
所有的孵育操作均应在高湿度的5% CO237℃孵箱中。
本实验适合处理20~30只幼鼠，若少于20只鼠则可能会发生组织消化过度的情况，若超过30只，则由于准备工作加长降低了细胞的成活性。
组织消化和分离细胞1）在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有100-ml灭菌水的容量600-ml的烧杯，加热至37℃。
2）准备胰酶液。
用水浴或温箱使胰酶液温度保持在37℃。
胰酶（0.1）%，100ml盐水A 90ml1%胰酶1:300（GIBCO/BRL）10ml使用当天配制盐水A137mmol/L NaCl4 mmol/L KCl4.2 mmol/L NaHCO35 mmol/L 葡萄糖溶于无菌蒸馏水中3）做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70%乙醇擦拭平皿后放进操作台。
取3个60-mm的一次性组织培养用平皿，加入5 ml盐水A，标记上1，2，3，放进操作台的冰台上。
4）取一只干净加盖的烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把0~1日龄的SD幼鼠放进该烧杯中麻醉。
20只幼鼠大约需要5分钟时间。
用70%乙醇擦净烧杯再放进操作间。
5）一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。
用乙醇擦洗其胸部及腹部。
把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着1的培养皿中。
24-mm规格的弯头解剖刀适合用于切口及摘除心脏。
此时幼鼠心脏仍能跳动，故一般很容易找到并摘除。
可用同一把解剖刀将心脏摘出放进盐水A溶液，若需要也可用灭菌的5号钳子。
6）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。
每次解剖约需1分钟。
7）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。
成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定王丽娟;贾大林;齐国先【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2007(015)003【摘要】目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况.方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞, 评价杆状心肌细胞的比例变化.台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin) 治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率.结果在每个成年小鼠心脏分离了40～60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞.心肌细胞培养1 h、24 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%.心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10 μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组 (P＜0.05,P＜0.01).结论应用改良Langendorff 方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究.【总页数】4页(P175-178)【作者】王丽娟;贾大林;齐国先【作者单位】中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001【正文语种】中文【中图分类】R332【相关文献】1.原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定 [J], 程阔菊;黄河;杜智勇;李洪;杨天德2.乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 [J], 辛毅;许秀芳;黄益民;张颖;李温斌3.成年C57BL/6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定 [J], 刘登群;龙爽;王军平;史春梦;冉新泽;粟永萍4.C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定 [J], 张玲;段明军;魏琴;陈华;时利;侯月梅5.新生小鼠心肌细胞分离培养的改良及其鉴定 [J], 夏机良;朱泽安;张湘涛;王跃群;吴秀山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
小鼠脂肪间充质干细胞的分离_培养以及多潜能分化的研究
494 中国组织化学与细胞化学杂志第18卷现,从22细胞胚胎培养24h后,体外受精胚胎培养液内H2O2含量较高,且培养液中H2O2含量越高,胚胎的发育情况越差。
可见,槲皮素、维生素C在一定浓度范围内对体外受精胚胎发育有一定的促进作用。
011、012和015μmol/L的槲皮素能克服二细胞发育阻滞,对体外受精胚胎42细胞发育率的促进作用明显;50μmol/L维生素C对体外受精胚胎囊胚发育率的促进作用较明显。
培养液中H2O2含量与胚胎发育情况呈负相关。
小鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养以及多潜能分化的研究 金明顺 张 毅 贾秀芬 周燕华 闫 妍 刘慧雯 哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室,黑龙江 1500811脂肪间充质干细胞由于取材时侵害性小、易于培养以及低衰老性已经成为目前研究的热点。
本实验中取小鼠腹股沟脂肪组织,采用01075%Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测培养第3代的脂肪间充质干细胞表面标记CD29,CD44和SCA21,同时在诱导培养基内,将第3代脂肪间充质干细胞进行成骨和成脂诱导培养,通过细胞的形态学、碱性磷酸酶活性、骨钙沉积鉴定其向成骨方向分化,通过油红2O染色鉴定其向成脂方向分化,以探讨由小鼠脂肪组织分离获得脂肪间充质干细胞的方法及其在体外诱导向成骨、成脂方向分化的潜能。
结果显示,脂肪间充质干细胞成长梭形,与骨髓间充质干细胞相似CD29和CD44双阳性的细胞达到80%以上;经成骨诱导(011μM地塞米松,200μM维生素C,and10mMβ2甘油磷酸钠)培养的脂肪间充质干细胞可见细胞呈层状排列,聚集成群,3周后进行碱性磷酸酶染色可见胞质深染,茜素红染色后钙结节呈红色;经成脂诱导(100μM地塞米松,1μM维生素C,100μM吲哚美辛和10μg/ml胰岛素)的脂肪间充质干细胞镜下可见细胞变圆,胞质内可见大小不等的脂滴,油红2O染色诱导细胞呈红色,而同期对照组培养的脂肪间充质干细胞则表现为阴性。
脂肪干细胞的分离培养及成心肌诱导
脂肪干细胞的分离培养及成心肌诱导纪伟宁;杨毅宁;马依彤;王宝珠;刘芬;陈邦党【摘要】目的探讨脂肪干细胞的分离培养以及成心肌细胞分化的可能性,为脂肪干细胞治疗缺血性心脏病的应用提供理论依据.方法自SD大鼠提取脂肪组织,用酶消化法分离脂肪干细胞,培养于a-MEM培养基中.显微镜下观察细胞生长情况及形态特征,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子的表达情况.用5-氮胞苷对脂肪干细胞进行诱导,显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,免疫组织化学方法检测心肌特异性抗体α-Actin的表达.结果分离培养的脂肪干细胞形态近似梭形,流式细胞仪检测结果显示CD90及CD105高表达,而CD34及CD45极低表达.经5-氮胞苷诱导后的脂肪干细胞呈类似心肌细胞的形态学特征,免疫组织化学检测结果见心肌特异性标志物α-Actin表达阳性.结论脂肪干细胞具有较强的分化为心肌样细胞的能力,可以应用于缺血性心脏病细胞治疗的研究.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2011(034)006【总页数】4页(P555-558)【关键词】脂肪干细胞;心肌细胞;诱导分化【作者】纪伟宁;杨毅宁;马依彤;王宝珠;刘芬;陈邦党【作者单位】新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R34近年来缺血性心脏病已成为严重威胁人类生命的头号杀手[1]。
传统的治疗方法包括药物干预以及再灌注治疗等，但是这些手段只能在一定程度上挽救缺血的心肌，不能从根本上修复和逆转已坏死的心肌。
随着对干细胞研究的深入，干细胞移植作为治疗缺血性心脏病的新手段成为近年来研究的热点之一。
改良的成年SD大鼠心室肌细胞分离与培养方法
广 东 药 学 院 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆＧ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ａ ｕ ｇ ． ２ ０ １ ５ ， ３ １ （ ４ ）
改 良的成年 Ｓ Ｄ大 鼠心室肌细胞分离与培 养方法
Ａ ｍｏ ｄ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｖ ｅ ｎ ｔ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｍｙ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｉ ｎ ａ ｄ ｕ ｌ ｔ Ｓ Ｄ ｒ ａ ｔ ｓ
韩福平 ， 陈耀旭 ， 苏浩 ， 吕南英 ， 殷春 霞 ， 黄礼 杰 ， 谭 文
（ 华南 理工大学 生物科 学与工 程学 院／ ＃ Ｅ
点实验室 ， 广东 广州 ５ １ ０ ０ ０ ６ ）
摘要： 目的 建立稳定 高效 的成 年大 鼠心 室肌 细胞分离 与培 养方法 。方法 成年 ｓ Ｄ大 鼠麻醉后 ． 迅速开胸 取心， 将主动脉连接于 Ｌ ａ ｎ ｇ ｅ ｎ ｄ ｏ ｆ ｆ 装 置 上 进 行 逆 向灌 流 ， 用０ ． ８ ｍｇ ／ ｍ Ｌ Ⅱ型 胶 原 酶 和 ０ ． １ ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ蛋 白 酶 双 酶灌 注消化分离心肌细胞 ， 采用 自然沉降法纯化心室肌细胞 ， 一部 分细胞用改 良的 Ｍ１ ９ ９培养基进行 细胞培养 ， 另一部 分使 用台盼蓝染 色进行 细胞 活性 检测并计 数 ， 同时使用激光共聚焦显微镜观察细胞 收 缩及钙 瞬变 。结果 本方法可获得 （ ８ １ ． ９ ＋ ２ ． ２ ） ％具有活性 的成 年大 鼠心 室肌细胞 ， 每只 ｓ Ｄ大 鼠心脏 的 细胞产量可达 （ ２ ． ０ ＋ ０ ． １ ） × １ ０ 个， 电刺激时细胞 同步稳 定收缩 。结 论 该分离 和培养方 法高效 、 稳定 ， 分 离 出的细胞活性高 ， 产量高 ， 可用于原代培养 。 关键词 ： 成年 大鼠 ； 心室肌细胞 ： 分离 ： 原代培养 中图分类号 ： Ｒ ９ ６ ５ ． ２ 文献标 志码 ： Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ６ — ８ ７ ８ ３ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ４ ． ０ ２ ２ 文章编号 ： １ ０ ０ ６ — ８ ７ ８ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ４ 一 ｏ ５ １ ８ — ０ ４
乳鼠心肌细胞分离
Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol作成者：富海英 趙卉日 期：2006/08/11法消毒器具：镊子 大和小 各两把，用纸包好后放入一个玻璃杯中放入搅拌棒的50cc 的烧杯一个次日开始培养的话，提前：17～21時）１）Hanks medium 15ml 加入P10培养皿，共三枚，置于37℃ incubate（其中2枚在取心脏时备用）Hanks medium 是室温保存，没时间的话，不用incubate 37℃也可２）从新生大鼠取心脏（以下以两窝计算）铺上草纸、准备酒精消毒液和尸体袋取出心脏（从剑突左下用尖镊子刺入，分离，心脏将突出体外）用镊子把心脏夹出，放在P10培养皿中将全部大鼠的心脏取出后，把心脏移到新的培养皿中然后拿到无菌操作台（cleanbench ）里面行进一步操作３）将P10 dish 中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿，枚目のdish に移将心脏撕裂2-3下，裂而不断的程度即可。
４）将Trypsin/EDTA 放入50cc 三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml 。
4℃ 过夜。
Trypsin 不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出，将需用部分取出注入带刻度试管中。
Trypsin 不要加热，以免影响效果。
4℃过夜，静置即可。
12-16h后：早上9点开始）试剂：D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG)FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M)PSG (GIBCO Cat No. 10378-016)GIBCO Hank’s balanced salt solution（Cat. No. 14175-095）（不含Ca,Mg离子）Collagenase Type II （Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2）最终浓度0.5~1.0mg/mlBSA (Sigma)最终浓度5mg/ml0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO、cat No. 25200）（4℃直接使用，不加温）５）配制胶原消化液：Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml６）在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM（10%FCS）10ml，37℃恒温槽5min７）弃上清，加胶原消化液10ml（0.22um filter过滤）（弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定
成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定邓文文;赵然尊;龙仙萍;石蓓【摘要】目的建立稳定的小鼠心脏干细胞(cardiac stem cells,CSCs)分离方法,并对体外培养的CSCs进行生物学特性鉴定.方法选用健康成年CD1小鼠,在无菌条件下取心脏并剪碎,并用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶反复消化,采用差速离心法去除混合细胞悬液中的心肌细胞,结合免疫磁珠分选法纯化c-kit+ CSCs后,进行流式细胞仪表面标记鉴定.结果酶消化法和磁珠分选法结合成功分离并纯化了成年小鼠c-kit+ CSCs.磁珠分选前,流式细胞仪表面标记鉴定c-kit+ CD34-CSCs为4.62％;经磁珠分选后c-kit+ CD34-CSCs可达70.23％.结论酶消化法结合磁珠分选法能成功分离纯化成年小鼠c-kit+ CSCs,且能用于后续体外培养.体外培养时c-kit+ CSCs相对于其它表型标记的心脏干细胞更加稳定,具有较强的扩增能力.相对于心脏组织块培养法,酶消化法可在短期内获得高纯度的c-kit+ CSCs,更有助于心脏干细胞相关信号通道的体外实验研究.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2013(036)005【总页数】5页(P406-409,412)【关键词】心脏干细胞;细胞分离;酶消化法;磁珠分选法;小鼠【作者】邓文文;赵然尊;龙仙萍;石蓓【作者单位】遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099;遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099;遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099;遵义医学院附属医院心血管内科,贵州遵义563099【正文语种】中文【中图分类】R541在成年哺乳动物的心脏组织内，心脏干细胞数量较少，分离较为困难[1]。
而临床治疗需要大量的CSCs，这就使得CSCs的临床应用受到极大的限制。
迄今为止，CSCs的分离方法甚至不能完全满足CSCs的相关研究。
目前主要有两种方法用于分离鼠和人CSCs，一种是酶消化法[2]，另一种是原代组织贴壁培养法[3]。
成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定
５ ６ ３ ０ ９ ９， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ａ ｃ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ Ｃ Ｓ Ｃ ｓ ）ａ ｎ ｄ ｉ —
［ 关键词］心脏干细胞 ； 细胞分 离； 酶消化 法 ； 磁珠分选法 ； 小鼠 ［ 中图法分类号］Ｒ ５ ４ １ ［ 文献标识码 ］Ａ ［ 文章 编号］１ ０ ０ ０ － ２ ７ １ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５ — ０ ４ ０ ６ — ０ ４
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｉ ｄ ｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ａ ｒ ｄｉ ａ ｃ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ａ ｄ ｕ ｌ ｔ ｍｉ ｃ ｅ Ｄｅ ｎ ｇ ｗｅ ｎ ｗｅ ｎ，Ｚｈ ａ ｏ ｒ ａ ｎ ｚ ｕ ｎ， ｘ ｉ ａ ｎ ｐｉ ｎ ｇ，Ｓ ｈ ｉ ｂ ｅ ｉ
第３ ６卷 第 ５期 ２ ０ １ ３年 １ ０月
遵
义
医 学
院 学 报
ＶＯ １ ． ３ ６ ＮＯ ． ５ ｏｃ ｔ ．２ ＡＥ Ｍ ＥＤＩ ＣＩ Ｎ ＡＥ ＺＵ ＮＹＩ
小鼠成体心脏干细胞的分离和鉴定
小鼠成体心脏干细胞的分离和鉴定徐路;詹金熹;李云;王晓侠;吴琼【摘要】目的：建立稳定的心脏干细胞提取方法，为进一步研究心脏干细胞生物学特性及临床应用奠定基础。
方法通过机械法剪碎组织，利用胶原酶Ⅱ消化后过细胞筛，再经流式细胞术根据细胞表面标志以及免疫荧光染色法进行鉴定，无菌分选得到细胞，体外培养。
结果通过酶消化过筛法获得单细胞悬液，经流式细胞术细胞表面标志鉴定出Lin-CD45-Sca-1+细胞，无菌分选获得高纯度细胞可进行体外培养。
结论本实验建立的小鼠成体心脏干细胞提取方法，可获得足够量的Lin-CD45-Sca-1+细胞用于实验研究，为心脏疾病的干细胞治疗提供技术支持。
%Objective To establish a stable method of isolating cardiac stem cells for further study of cardiac stem cells biological characteristics and clinical application. Methods The stem cells were isolated by the following methods:mechanical shear cardiac tissue and collagenaseⅡdigestion. The marker on the surface of cardiac stem cells were recognized by the flow cytometry and immunofluorescence assays. And germ-free sorting cells were cultured in vitro. Results The single cells were obtalned by enzyme digestion and the Lin-CD45 -Sca-1 + cells were identified by the flow cytometry. Conclusion The cardiac stem cellsisolstion method were established,which could provide e-nough Lin-CD45 -Sca-1 + cells used for scientific research. This study provided a technical support f or treating heart disease with stem cells.【期刊名称】《吉林医药学院学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P167-170)【关键词】心脏干细胞;酶消化;分离;鉴定【作者】徐路;詹金熹;李云;王晓侠;吴琼【作者单位】广西师范大学，广西桂林 541004;广西师范大学，广西桂林541004;广西师范大学，广西桂林 541004;广西师范大学，广西桂林 541004;广西师范大学，广西桂林 541004【正文语种】中文【中图分类】R96随着世界经济的迅速发展，人们生活水平的不断提高，心血管病成为各国高患病率和死亡率的主要疾病［1］。
改良联合酶消化法提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞
改良联合酶消化法提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞陈洪群; 郑梅; 晏乘曦; 黄鹏; 赵兴山【期刊名称】《《山东医药》》【年(卷),期】2019(059)021【总页数】4页(P38-41)【关键词】组织细胞提取法; 改良联合酶消化法; 心脏成纤维细胞; 原代培养; 成年小鼠【作者】陈洪群; 郑梅; 晏乘曦; 黄鹏; 赵兴山【作者单位】民航总医院北京100123; 北京积水潭医院; 首都医科大学宣武医院【正文语种】中文【中图分类】R318随着现代动物实验技术的发展，原代细胞的分离提取已经广泛应用于各个领域的研究[1～4]。
成年小鼠的心脏成纤维细胞，在研究心脏纤维化[5～7]、心衰、心脏重构[8～10]等方面应用广泛。
目前大多数实验采用细胞系作为实验对象，但细胞系是永生化的细胞，其基因型、生理特性等都已发生变化，不能完全反映细胞真实状态[11]。
国内偶有原代小鼠心脏成纤维细胞的提取方法，但大多是乳鼠。
既往提取小鼠心脏成纤维细胞的方法多为联合酶室温下消化法[12]或利用提取心肌细胞后剩余残液培养成纤维细胞。
联合酶室温下消化法受室内温度影响较大，在不同季节、不同实验室难以重复；消化提取时间过长，大量成纤维细胞被消化酶损伤，导致成纤维细胞产量少，难以传代。
利用提取心肌细胞后剩余残液培养成纤维细胞法提取残液中混杂内皮细胞等导致成纤维细胞纯度低。
2017年12月～2018年4月，我们在联合酶消化法的基础上改进了消化温度、提取液储存方式(改良联合酶消化法)稳定地提取了成年小鼠原代心脏成纤维细胞。
1 材料与方法1.1 动物、试剂 C57BL/6 小鼠，雌雄不限，SPF 级，42～46日龄，体质量15～20 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。
主要试剂：HG/DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素均为美国Gibco公司产品，Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶均为美国Sigma公司产品。
分离小鼠心肌细胞protocol
分离小鼠心肌细胞Protocol实验动物：小鼠, 体重20~30g1急性分离心肌细胞A 实验准备：1）无钙台氏液：配500mL无钙台氏液(50mL台氏母液+450mL去离子水+1g 葡萄糖), 用NAOH 调PH，一般在7.35~7.4之间即可，注：充氧后调PH值，否则充氧后PH下调。
调PH值前严格校正PH计，小鼠心肌细胞对PH值特别敏感。
表1：台式母液配方mM MW g/L g/500ml (10x)NaCl 126 58.44 7.363 36.82KCl 5.4 74.55 0.403 2.02Hepes 10 238.3 2.383 11.92MgCl2.6H2O 1.0 203.3 0.203 1.02NaH2PO4.2H20 0.33 156.01 0.052 0.2574CaCl2 1.8 147.03Glucose 10 198.2注：CaCl2, Glucose配制时后加，（浓度0.9M CaCl2母液 6.616g(有水)或者4.995g(无水)+50ml去离子水），0.2ml CaCl2母液/100ml无钙台氏液2）称取5mg胶原酶Ⅱ+8mg白蛋白3）配有钙液200ml：即200ml无钙液+0.4ml CaCl2 (0.9M)。
注：小鼠心肌细胞对钙浓度特别敏感，我们为了缩短心脏复跳时间，减少心肌耗氧，把有钙液中钙离子浓度降到正常的浓度的1/44) 准备器械：大弯剪刀一把，小直剪刀两把，直镊子两把，止血钳两把，弯镊子两把，纱布一块，注射器60mL一个，10mL一个；手术线一团(小鼠主动脉比较细，手术线比大鼠的要细)；表面皿三个，小烧杯50mL 三个，量筒50mL两个，500mL 一个；大烧杯500mL一个250mL一个；滤纸若干！滴管4个, 7号注射针头一个（尖端磨平，靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主动脉时系线）。
5）KB 液配方mM MW g/LGlutamic acid70 147.13 10.3(谷氨酸)15 125.14 1.875Taurine(牛黄酸)KCl 30 74.55 2.237Hepes 10 238.3 2.383MgCl2.6H2O 0.5 203.3 0.1015Glucuse 10 198.2 1.982EGTA 0.5 380.4 0.19KH2PO410 136.09 1.36注：5M KOH 调PH 值（7.3-7.4），5M KOH 配制：28g KOH 溶于100ML去离子水，KB 液保存在-20℃冰箱中保存。
改良成年小鼠心室肌细胞分离方法
改良成年小鼠心室肌细胞分离方法石山慧;吕定超;翟旭雯;李端端;周密;左琳【摘要】目的改进小鼠成体心肌细胞的分离方法,以提高小鼠心室肌细胞的成活率和收获量.方法采用心脏在体主动脉插管,行独创的前加压灌流法冲洗心脏后接入改进的langendorff装置,用胶原酶液Ⅱ灌流、消化心脏后,将心脏剪碎并用吸管吹打,经200目滤网过滤后获得单个小鼠心室肌细胞.检测并对比在体和离体主动脉插管获得的心肌细胞的状态:梯度复钙后,在倒置显微镜下观察细胞的形态和杆状心室肌细胞的数目.结果研究结果显示,改良的主动脉逆行灌流法在缩短手术时间的同时,提高了小鼠心室肌细胞收获量和存活率.本课题组利用医用三通管,独创倒置灌流排气法,可以迅速排空灌流装置中的气体;利用注射器和灌流针结合,独创前加压灌流法,可以快速彻底地冲洗心脏中的血液;并采用实验室常规眼科镊和血管钳巧妙组合成协助装置,可以单人独立完成插管,不需要助手协助,节约人力,节省经费开支.结论成年小鼠心室肌细胞分离方法的改进使整个实验流程简化,缩短了实验时间,操作简便易学;同时该分离方法稳定、可靠、有效,可以为同类型实验提供思路和借鉴.【期刊名称】《中国心血管病研究》【年(卷),期】2016(014)008【总页数】5页(P748-751,766)【关键词】成年小鼠;心室肌细胞;分离;Langendorff;胶原酶【作者】石山慧;吕定超;翟旭雯;李端端;周密;左琳【作者单位】030001 山西省太原市,山西医科大学基础医学院生理学系;030001 山西省太原市,山西医科大学基础医学院生理学系;030001 山西省太原市,山西医科大学基础医学院生理学系;030001 山西省太原市,山西医科大学基础医学院生理学系;030001 山西省太原市,山西医科大学基础医学院生理学系;030001 山西省太原市,山西医科大学基础医学院生理学系【正文语种】中文【中图分类】Q95-33;R542.2采用心脏在体主动脉插管，行独创的前加压灌流法冲洗心脏后接入改进的langendorff装置，用胶原酶液Ⅱ灌流、消化心脏后，将心脏剪碎并用吸管吹打，经200目滤网过滤后获得单个小鼠心室肌细胞。
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PROTOCOL
1.Anesthetize mouse with 150uL heparin (100U/ml) + 0.5mL ketamine/xylazine stock
2.Sacrifice by opening thorax after toe pinch test.
3.Remove and cannulate heart, secure with vascular clip then 6-0 silk. Check cannulation by inflation. Heart should swell.
4.Perfuse heart with 1xPB for 4 min at 4ml/min (16mL)
5.Switch to DB for 3 min at 4ml/min (12mL)
6.Perfuse with DB+CaCl2 for 8 min at 4ml/min (32mL)
7.Heart will be mushy when fully digested and dripping ~16 drops/min
8.Remove from cannula, remove atria and great vessels
9.Place ventricles in sterile 60mm dish with 2.5ml DB
10.Tease ventricles into several pieces. Add 5mL Stopping Buffer (37°C) and pipette several times to release cardiomyocytes from tissue. Solution
should turn cloudy.
11.Transfer cell solution to conical tube with 100µm mesh to filter cells from tissue.
12.Rinse dish with 2.5mL Stopping Buffer and add to tube through mesh. Final volume is 10mL.
13.Let CMs settle 10-20 min at 37°C and plate supernatant in 60mm dish. Let cells settle 2-3 hours in TC incubator. Wash and harvest CFs (plated
cells) or change media and passage.
14.Harvesting CFs:
a.Wash 2x5ml 1xPBS, add 1ml of 1xPBS.
b.Scrape cells into Eppie, cfg twice 3min at 5000rpm at 4°C.
c.Lyse in 350ul RLT+.
SOLUTIONS FOR LANGENDORFF
10x perfusion buffer (stored at 4°C up to 1 month)
1L 500mL
NaCl 70.3g 35.15g
KCl 11g 5.5g
KH2PO4.82g .41g
Na2HPO4.85g .425g
MgSO4●7H2O 3g 1.5g
HEPES**(1M) 100mL 50mL
pH to 7.4 with 1N NaOH ~3mL
mQ H2O to 1L to 500mL
**if HEPES is in powder form, add 13.01mg HEPES to 50mL mQ H2O.
1x perfusion buffer (PB) (make fresh)
250mL 500mL
10x perfusion buffer 25mL 50mL
NaHCO3.0975g .195g
Taurine .9375g 1.875g
BDM (butadionemonoxime) .25g .5g
Glucose .25g .5g
pH to 7.4 with NaOH
mQ H2O to 250mL to 500mL
Filter through 0.2µm
Stopping buffer (7.5mL/heart, make fresh, heat to 37°C before use)
1xPB 9mL
FBS 1mL
100mM CaCl2 1.25µL
Digestion buffer (DB)
1xPB 50mL
320U/mg collagenase II*50mg
100mM CaCl2**15µL
*add immediately before use
**BEFORE adding, remove 12.5mL to fresh tube (for Step 5), THEN add 15µL CaCl2 to remaining
DB. Mix, then put 2.5mL on 60mm plate (for Step 8).
Culture (Fibroblast) medium
MEM 48.5mL
Pen/Strep 0.5mL (1% final)
L-glutamine 0.5mL (1% final)
FBS 50mL (10% final)。