2020年(生物科技行业)生化及分子生物学大实验

（生物科技行业）生化及分子生物学大实验

实验20质粒DNA的提取和鉴定

教学内容提要及时间分配：

1、实验原理讲解：8分钟

碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的俩条链不会完全分离。当用pH 值4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物,通过离心，染色体DNA和不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物壹起沉淀下来而被除去，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀，再用RNase除去RNA，即可获得较纯净的质粒DNA。

2、实验试剂和器材6分钟

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（从10%SDS

母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。

溶液Ⅲ：5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。

3mol/L醋酸钠(pH5.2)：800mL水中溶解408.1gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

STE缓冲液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。

TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

3、实验步骤讲解：6分钟

将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100μg/mL Amp）上，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基(含有100μg/mL Amp)中，37℃振荡培养14~16小时。

取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中，室温12,000r/min离心1分钟。

加入500μLSTE，涡旋打匀，室温12,000r/min离心1分钟。

弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。

加入100μL溶液Ⅰ重悬菌体，涡旋振荡，冰浴5分钟。

加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速轻柔颠倒5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟。

加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧，管口朝下，轻柔振荡5~10次，冰浴5~10分钟，12,000r/min离心10分钟。

取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡20秒。

室温下12,000r/min离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为有机相。

取上清，加入400μL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡20秒。

12,000r/min离心5分钟。

加入1/10体积3MNaAc，2倍体积无水乙醇，4℃沉淀10分钟或室温沉淀20分钟。12,000rpm离心10分钟。

去上清，加入1mL75%乙醇，洗涤沉淀以去盐。12,000rpm离心10分钟。

去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。

将沉淀溶于30μLTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mLRNaseA)中，储于-20℃冰箱中。如直接酶切，可将沉淀溶于30~50μLddH2O（含20μg/mLRNaseA）。

利用比色法测定质粒DNA在260nm和280nm下的光吸收值且计算样品浓度。

用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带。

实验21RNA的提取及鉴定

教学内容提要及时间分配：

1、实验原理讲解：12分钟

总RNA的提取

真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA （1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA 合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即１）样品细胞或组织的有效破碎；２）有效地使核蛋白复合体变性；３）对内源RNA酶的有效抑制；４）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品仍牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用俩种途径，1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA 和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相。

紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度鉴定

核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有壹定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。另外，核酸分子在双链向单链形式转化过程中，紫外吸收增加，故单链DNA及RNA分子较双链DNA分子具有更高的紫外吸收能力。这些物理特性为测定核酸样品浓度

提供了基础。在波长为260nm，光程为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA或RNA为40μg/mL，单链核苷酸为20μg/mL。紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25μg/mL的核酸浓度。

分光光度法不但能测定核酸浓度，仍可通过测定在260nm和280nm的紫外吸收比值（A260/A280）估计核酸的纯度。纯净的DNA样品的A260/A280为1.8，纯净的RNA制品的A260/A280为2.0。DNA样品中存在将导致比值升高，而比值降低表明有蛋白质或苯酚等污染。RNA浓度计算公式：C(μg/mL)＝40μg/mL×1/光程×A260×稀释倍数

琼脂糖凝胶电泳技术检测总RNA浓度和质量

琼脂糖英文名agarose，是由经过挑选、质地较纯的琼脂（agar）作原料制成的。琼脂化学结构上是由琼脂糖和琼脂胶（agaropectin）组成的复合物。琼脂胶是壹种含有磷酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质将给电泳及凝胶过滤以不良影响。琼脂糖是壹种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖和琼脂壹样也能形成凝胶。形成凝胶主要是由于氢键的缘故。由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生物化学物质的变性和吸附。

琼脂糖凝胶电泳是实验室中最早得到广泛应用的凝胶电泳，是分离鉴定核酸的常规方法。因为它具有以下优点：1）琼脂糖凝胶中含有琼脂1.0%-1.5%，在这种凝胶中电泳，近似自由界面电泳，可是样品的扩散度比自由电泳小；2）琼脂糖凝胶电泳支持物均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；3）液相和固相界面无明显界限，电泳速度快；4）琼脂糖凝胶透明而不吸收紫外线，能够直接用紫外检测仪作定量测定；5）区带易染色，样品易回收。

核酸分子在高于其等电点的电泳缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动。分子大小不同的核酸分子具有各异的电泳迁移率，而在电泳后处于凝胶的不同位置。影响其电泳迁移率