小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养
iPS细胞制备技术
iPS细胞制备技术随着对iPS细胞重编程机制研究的不断深入，iPS细胞的制备体系不断完善，目前iPS细胞的制备方法多种多样，但以Yamanaka的“四因子”诱导体系较为经典，本书在此简要阐述此制备方法。
一、小鼠iPS细胞制备【实验步骤】1.建立小鼠胎儿成纤维细胞系（1）脱颈处死13.5天孕鼠，分离出子宫并用PBS浸洗。
（2）用手术镊将胚胎从胎盘和周围膜系组织分离开，去除头、性腺和内脏组织。
（3）将胚胎转移至一个新100mm皿进行PBS清洗，剪刀剪碎组织，放于含有0.1%胰酶/0.1mmol/L EDTA溶液的50ml离心管，于37℃消化20分钟，重新加酶，再次消化。
（4）加入等体积FP溶液（含10%FBS，50U&50mg/ml青霉素和链霉素的DMEM）中止消化，吹打数次以帮助组织破碎。
（5）室温（20～25℃）放置5分钟以沉降大块组织，取上悬液体于离心管进行离心，1200r/min×5min，弃上悬液并用新鲜液体重悬。
（6）计数细胞，并调节细胞浓度至1×106/ml。
一般约1×107细胞/胚胎，1×107细胞/100mm皿于37℃，5%CO2培养24小时。
（7）次日，PBS清洗去除未贴壁细胞，待细胞铺满皿底，换掉FP液，用PBS清洗一次，1ml 0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA消化5分钟，加入9ml FP液并吹打成细胞悬液，传代按1∶4进行（用于iPS 诱导的MEFs代次最好选用3代以内）。
2.饲养层细胞准备（1）复苏 SNL 细胞1）由液氮罐中取出SNL冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。
2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的SNL液体中，800r/min×5min，弃去上液。
3）重新加入10ml SNL液体重悬细胞，转入明胶铺被的100mm皿中，于37℃，5%CO2培养至细胞80%～90%汇合。
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。
以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。
- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。
- 取下小鼠/大鼠的皮肤。
使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。
3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。
- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。
- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。
- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。
定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。
4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。
- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。
一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。
- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。
这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。
通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
3T3-L1脂肪前体细胞
细胞名称3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞，也称3T3-L1脂肪前体细胞
细胞描述3T3-L1是从Swiss-3T3小鼠胚胎中分离克隆的细胞株，该细胞有接触性抑制生长特征且能向脂肪样细胞分化，高血清培养液可促
进细胞脂肪积累等
动物种别小鼠
组织来源胚胎
细胞形态成纤维细胞（长梭形）
培养条件高糖DMEM培养液，含10%胎牛血清和1%青链霉素
High glucose DMEM medium with 10% fetal bovine serum, 100
IU/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin in the humidified
atmosphere with 5% CO2 and 95% O2 at 37℃
细胞传代以50 ml细胞培养瓶为例说明：
1．无菌PBS轻轻洗涤细胞1或2次（每次约4 ml PBS）；
2．倒掉PBS后再加入4ml PBS，将细胞培养瓶翻转；
3．加入0.25%胰酶和0.02%EDTA的溶液约1ml，拧紧细胞培养瓶盖，轻轻混匀；
4．在镜下观察细胞形态，当细胞稍稍变圆，轻轻并立即翻转培养瓶，终止消化（消化时间与细胞状态有关）；
5．倒掉胰酶加入适当培养液，轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落分散；
6．细胞悬液一分为二，继续传代培养（避免密度过高导致细胞分化）。
昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定
ｒｕｄｃｌ ，ｔｅｎ ｃ ｕ ｅ ｒｅａｄｔ ｔ ａｋ ｄ Ｋ ｏｉｖ ｔｉｉｇ ｏ ｎ ａ ｄｉ ｏ ｎ ｅ ｓ ｈ ｕｌ ｓｗ ｒ ｌ ｇ ｇ ｌ ｐｃｅ ．Ａ Ｐｐ ｓｉ ｓ ｎｎ ｌ ｙｗ ｓｒ ｄｓ ｅ ｅａ ｎ ｉ ｙ ｈ ｔｅ ａ ｃｏ ｅ ｈ—ｂｏ ｎｏ ｌｅ ｉｒｂａｔ ｅ ｓ ｒ ｉｅｅｔ ｔ ｒｗ ｒ ｕ ，ｆ ｏ ｌ Ｈ ｆ ｒ ｉ ｅ ｂ ｂ ｓｃ ｏ ｄ ｎ ａｄ
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昆 明 种 小 鼠胚 胎 干 细 胞 的 分 离 、 养 与 鉴 定 培
陈 明玉（ 大连铁 路 卫生 学校 辽 宁 大连 １６ ０ ） １０ １
ｃＨ ｅ ｉ ｔ ｅ ｏ ｒ ｏｏｅｓ ｎｉ ｖｒ ｓｅｓ ｎｃｌ ｒ， Ｓｃｌ ｉｓ ａ ｒ ｉｐｅｅ ｒｏ ｏｉｓ（ Ｂ ） ａｄＥ ｓ ｈｗ ｄｏｔａｄ ｅ ｓｗ ｒ ｌ Ｈｗｏ ｌｒ ｓ。Ｉ ｉｏｓ ｐｎｉ ｕｔ ｅ Ｅ ｏｏ ｅ ｎｆ ｍ ｓ ｌ ｍｂｙｉ ｂｄｅ Ｅ ｓ ， Ｂ ｏ ｅ ｕｗ ｅ ｇ ｙ ｈ ｃ ｌ ｎ ｔ ｕ ｏ ｕ ｎ ｃ ｏ ｍ ｄ ｎ ｓ ｒ
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小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
小鼠MEF细胞分离方法
小鼠MEF细胞分离方法小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblast，MEF）是从小鼠胚胎中分离并培养的一种成纤维细胞。
MEF细胞被广泛应用于细胞生物学实验中，例如：-作为体外培养基质，用于维持和扩增干细胞的生长。
以下是一种常见的小鼠MEF细胞分离方法：1.实验前准备：-将小鼠配对交配，取得受胎小鼠。
-受胎12.5天后，将受胎小鼠人道处死。
-用70%乙醇消毒显微镊子和剪刀。
-准备PBS缓冲液：将1×PBS固体溶解于去离子水中，加小量NaOH 调节pH至7.4，使用0.45μm滤器过滤并常温保存备用。
2.细胞分离：-将受胎小鼠置于消毒好的培养皿中。
-用显微镊子和剪刀剖开小鼠腹部，暴露子宫。
-将子宫取出并转移到新的培养皿中，用PBS缓冲液冲洗干净。
-使用显微镊子将子宫剪成小块，用PBS缓冲液冲洗掉残留的脂肪和血液。
-将子宫块转移到预先消化好的胶原酶溶液中，37°C孵育30分钟。
-用10mL预热的培养基密封试管，将胶原酶溶液过滤并收集上清液。
-加入培养基并轻轻振摇，使细胞均匀分散。
-将细胞转移到新的预热培养皿中，放入孵箱中培养。
3.细胞培养：-使用常规培养基（如DMEM/F-12）加10%FBS，将细胞培养至80-90%的传代。
-每3-4天更换培养基，以保持细胞的正常生长。
-在细胞达到足够密度时，可以使用三胎小鼠MEF细胞进行细胞冻存或进一步的实验。
MEF细胞的培养温度通常为37°C，使用5% CO2的培养箱进行培养，细胞密度在15,000-40,000细胞/cm²之间。
另外，为确保实验的成功，应注意以下几点：-所有实验仪器和试剂要经过严格的消毒和清洁，以防止细胞污染。
-在进行分离和培养过程中，避免细胞接触空气时间过长，以减少细胞受到氧化应激的影响。
-注意培养基的配制和使用，避免细胞受到菌落或受到培养基变质的影响。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告引言：细胞培养是一项关键的实验技术，被广泛运用于生物医学研究以及产业生产领域。
本实验旨在通过培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）并观察其生长、形态特征以及细胞增殖情况，探究细胞培养技术的应用和原理。
实验方法：本实验通过收集小鼠胚胎，将其胚体分离为单个细胞，并在含有完善的培养基的培养皿中进行培养。
细胞培养过程需要细致地调节温度、湿度和培养基组分的浓度，以提供细胞正常生长所需的环境条件。
结果与讨论：1. 细胞形态观察：在培养7天后，我们观察到细胞呈现典型的长条状形态，细胞质呈深染的圆形，细胞核体积大且显著染色。
这些形态特征与前人研究得出的成纤维细胞特征相符，表明成功培养的细胞为成纤维细胞。
2. 细胞增殖情况：为了观察细胞增殖情况，我们定期记录细胞的数量。
结果显示，在培养的前3天内，细胞数量迅速增加，呈指数增长趋势。
然而，在培养达到第4天后，细胞数量的增长速度下降，呈现对数增长趋势。
这与前人研究中发现的细胞生长曲线相吻合，即细胞在培养初期呈现快速增殖，随后进入平台期。
3. 细胞死亡情况：我们也检测了细胞的死亡情况。
结果显示，在培养的前3天内，细胞死亡率较低，细胞具有良好的存活率。
然而，随着培养时间的延长，细胞死亡率逐渐升高。
这可能是由于细胞寿命受到限制，受到培养基中营养物质的消耗和毒性物质的积累的影响。
4. 细胞传代：为了延续细胞的生长，我们进行了细胞传代的实验。
在细胞密度达到一定水平后，我们对细胞进行了传代，并观察到新传代的细胞能够生长并形成典型的细胞群。
这证实了我们成功地培养出了具有传代潜能的细胞。
结论：通过本次实验，我们成功地培养出了小鼠成纤维细胞，并观察到其特征、增殖和传代情况。
这次实验验证了细胞培养技术的可行性，并为细胞生物学和生物医学研究提供了有力的工具。
细胞培养技术的应用将进一步推动生物医学领域的发展，有望为疾病治疗和组织工程等领域带来更多突破。
展望：尽管本次实验获得了较为理想的结果，但仍存在一些值得深入研究的问题。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
细胞工程论文摘要及总结
河北师范大学细胞工程论文摘要及总结姓名曾媛班级08级生技学号 2008011175小鼠与人类ES细胞的分离与培养论文摘要昆明小鼠ES细胞的分离培养及鉴定张廷龙1,董雅娟1*,柏学进1,赵晶1,2,岳福杰3,史文升1,龚宜超1(1.青岛农业大学动物胚胎工程中心,山东青岛266109;2.西北农林科技大学,陕西杨凌712100; 3.荣成市出入境检验检疫局,山东荣成265300)摘要[目的]摸索一种适合昆明小鼠ES细胞分离培养的方法,以提高昆明小鼠ES细胞的建系率。
[方法]分别采用5种方法分离ICM和ES细胞集落,摸索了以BMSCs作为饲养层时,丝裂酶素处理的合适时间。
[结果]连续消化法要明显好于其他4种方法。
MMC处理BMSCs 1、1.5、2 h时效果较好,3个时间点无显著差异(P>0.05)。
mMEF作为饲养层与BMSCs作为饲养层时获得5代ES细胞相比差异不显著(P>0.05)。
[结论]连续消化法分离ES细胞效率较高,饲养层采用MMC处理1~2 h的BMSCs 饲养层或常规mMEF饲养层对昆白小鼠ES细胞无明显影响。
关键词:昆明小鼠; ES细胞; BMSCs; ICM昆明小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定作者:赵晶（西北农林科技大学）摘要本研究的目的是建立有效的昆明小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层培养体系，用于分离和培养小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的研究，筛选出更适合于昆明小鼠ES细胞的克隆培养体系，为进一步建立昆明小鼠ES细胞系奠定基础。
1．分别选取妊娠11 d，14.5 d和16 d的孕鼠胎儿分离成纤维细胞，比较分离不同日龄胎儿的成纤维细胞增殖及纯化情况，以及观察不同接种密度，成纤维细胞体外培养生长状况。
选择成纤维细胞分离培养的最适胚龄和最佳培养条件。
试验结果显示，14.5 d的孕鼠胎儿分离培养成纤维细胞效果最好。
可分离到大量的成纤维细胞，杂细胞少，并且细胞增殖快。
生长旺盛、已纯化的第三代成纤维细胞最适宜做ES细胞的饲养层。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
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小氯歴於成纤维细胞的分离和培养、实验材料1. 主要仪器役备(1) 倒置显微镜(Olympus, Japan)(2) CO2培养箔(BB16HF,上海力申科学仪器有限公司)(3) 100ml 的玻璃焙养瓶(江苏海门市大路塑料实验仪彖厂)(4) 6孔培养板(COSTA, R 每孔直径为3.5cm)(5) Eppendroff 管(6) 1ml,2ml,5ml 的玻璃摘管各30支；10ml 尖底禽心管和直径为8cm 的平皿(7) 雳心机(8) 5ml 冻存管(9) 两套小亂用解刘器械(包括眼科剪和眼科＜)2. 主要试利配制(1) MEF(mouse embryo fibroblast ,小亂軀於成纤维细胞)培养液---- 低糖DMEM 母液1) 用一个1000ml 的大烧杯加入1000ml 无蔺无内毒素的超纯木(购自福州新北生化工业有限公 司)； 2) 将一小软低DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，幷冲 洗 包装袋的内面以冼下所有的粉未。
3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。
4) 搅拌直至完全涿鮮。
5) 用1NHCI 或1NNaOH 调培养基的pH 至比最终的工作液的PH 低0.2-0.3 ,调好PH 后，将彖器•密 封01该实验中用1NHCI 调PH 至7.3 )o6) 立即用0.22um 的滤彖过德除菌，装入需压过的盐木瓶中，4°C 保(1存个月内用完)。
----------------- MEF 培 养液取100ml 上述配好的低穗DMEM 液体，加入10000IU 青霉素钠(6.25mg )和10mg 链霉素，溶鮮后再次 调节PH 至7.3,经0.22um 的滤黑过滤至壽压过的血请瓶中，再添加 10ml 分装好的新 生牛血请(Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需 56°C, 30min 夭涪过)，4°C 保存至使用。
⑵ PBS疫500ml 超纯水中依次溶入NaCIKCINa 2HPO4.12HO 2KH2PO4 于121 °C 壽压夭苗30min 或经0.22um 的滤器过滤除菌再分裝入100ml 洁净灭菌的盐水瓶 中, 再放入4°C 冰箔中保存备用。
(3) 0.25%胰養自酶一0.02%EDTA 混金请化液4 100ml 超纯水中分别溶鮮4.0g 0.1g 1.445g 0.1g胰養自酶干粉仃rypsin, Sigma,T4799) 0.25gEDTA 0.02gNaCI 0.7gNa2HPO4.12HO2 0.024gKH2PO4 0.024gKCI 0.037gTris 0.3gD■葡萄糖酚红0.1g于4°C过夜，使之充分涿鮮，用1mol/IHCI调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在一10〜30°C 下冻存备用O(4) 0.1%的朗胶木涿液称朗胶0.1 g (Sigma, G—9391)涿于100ml超纯木中，先加热涿鮮，再分装入20ml的血请瓶中于121°C 壽压灭菌45min,于4°C保存。
(5) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液疫盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml需压夭茵的PBS,用需压夭窗的尖嘴0昆匀。
即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。
注：此步应农胶卷暗盒内操作，然后于4°C避光保存。
2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml 血请瓶中。
用前临时配制，并A 37°C的CO2培养箔中预温.30min.。
(6) 冻存液取2 X 1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DME(M低糖型)培养液和0.1ml二甲基亚矶(DMSO, AR 纯，中国医药集团上海化学试利公司)，置4°C冰箔中预冷60min o3.动杨：性成熟期即大于8周龄昆朗种小勺亂，领自福建医科丸哮实睑动物中心。
、实验步骤1. 获取小亂軀於⑴将8周龄的昆自早亂和12周蛉的昆勺g按1:1比例金笼。
(2) 次可嚴10:00前观寨¥魚阴遒口，有乳自色或蛋黄色胶冻状物(阴遒栓)即爱为怀孕0.5夭。
(3) 实验肘断硕处死孕13.5天的母亂，置于蜡盘上。
(4) 75%酒精谄毒后，用普通剪刀和镶子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮朕向头尾两側李拉即剥发。
(5) 用眼科弯锁和眼科弯剪打开腹腔，暴療出子玄。
(6) 用眼科住一側子言，分需子言糸朕，服科弯剪剪断子言角和子言颈，将整个子言分禽下来 (注意勿使子富滑落到腹腔外，避免污染)。
(7) 将子玄置于无菌滤绒上去除血迹。
(8) 在超净台内将子玄移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。
(9) 将子言移入另一盛有PBS的平皿中，用服科弯剪沿子言糸朕打开子言，取出带有於朕的於亂，并用两把服科钱子剔除於朕，取出於魚(一般有12只)。
(10) 将■於亂移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科饮去除於亂的头、叨肢和内脏，得魚歴躯干。
(11) 将魚歴躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
2. 小亂胆於成纤维细胞的原代培养(组织块培养法)(1) 将干净的舗軀躯干移至青霉素小瓶内(毎6个亂軀躯干装1瓶)，用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3 以下的碎块(需剪约200 T)o(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS,混匀后连同舗軀碎块一起移至一尖底禽心管中。
(3) 室温下静置5min,用刻度哌管吸去上请液，霧下亂軀组织碎块。
(4) 向装有魚軀碎块的禽心管内加入1ml0.25%胰蛋自酶一0.02%EDTA混合葡化液，轻轻吹吸30秒(可见组织块变得较为粘稠)。
(5) 再加入1 mIMEF培养液终止谄化，室温下静置5min o(6) 吸去上请液，留下舗軀组织碎块沉淀。
(7) 毎个禽心管内加入5mlMEF培养液悬浮亂歴组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中(接种时应用谪管将组织块混匀)。
(8) 做好标记(如培养目期，细胞名称，编号)，将装有氯軀组织碎块的培养瓶放入37°C, 5%CO2, 100%RH的焙养箔中培养。
(9) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三夭可以观痙，可见组织碎块附着于培养瓶底，周囲细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是星圖形的上皮细胞。
如果细胞己全部长满则可谄化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。
3. 小亂胚於成纤维细胞的传代培养：(1) 用滴管吸弃焙养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。
(2) 毎瓶用厲管加入约3ml的PBS,轻轻前后晃动焙养瓶，洗涤细胞一遍，哌弃PBSo(3) 毎瓶用厲管加入约2ml的0.25%肢蛋仓酶一0.02%EDTA混合荫化液，能盖住培养瓶底，•室温下静置作用30秒，吸弃葡化液。
(4) 疫倒置镜下观寨，当细胞雯圆时即可加入4—5mllMEF培养液终止淸化，并用摘管吸堆养液用力吹打整个瓶底(约30T)o(5) 将培养物全部吸置尖底禽心管内，特置5min,将上层细胞悬液吸置另一禽心管内。
(6) 1000r/min ( 80-1富心机为80g)需心5min,吸弃上请液。
(7) 毎瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。
(8) 毎个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞(吹打肘勿产生气泡) 。
(9) 将创请化传代的细胞疫倒置镜下观痙，可见细胞呈大小不一的圆形。
(10) 将装有谄化后细胞的焙养瓶放入37°C, 5%CO2, 100% RH的培养箔中培养。
(11) 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3葡化传代(操作同前，省略步骤5中的静置和换管)。
4. 饲养层制备(1) 朋胶预包彼培养板：取1个6孔焙养板(COSTAR毎，孔直径为3.5cm),先紫外照射30min,毎孔用5ml id度滴管加入3ml的0.1%朋胶水涿液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃朋胶木涿液，并用2ml的PBS洗涤一遍。
(2) 丝裂霉素C作用2小时：将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的焙养液吸弃，每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37°C、5%CO2. RH100%的培养箔中焙养2h。
(3) 2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预温的PBS洗涤细胞5次，毎次3ml(加样时厲管靠疫培养瓶的上壁或御壁，勿直接冲冲击底壁的细胞)。
(4) 荫化：毎瓶中加入2ml0.25%胰蛋勺酶一0.02%EDTA谄化液，室温下作用10秒，立即浹弃谄化液，加入3mlMEF培养液终止荫化，并吹打壁底细胞(应注意逐瓶操作，避免荫化肘间过长而使细胞丢夬过多)O(5) 需心：将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底禽心管内，1000r/min需心5min,弃上请，得细胞沉淀块，往一个富心管的沉淀块内加入3ml的M EF培养液混悬细胞，再吸至另一富心管中混悬沉淀块O(6) 计数并调整密度：吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度，然后将细胞悬液吸至一焙养瓶或血请瓶中，补加适量的MEF培养液调整细胞•密度为3x105个/ml o(7) 接种：毎孔加3 ml密度为3X1CP个/ml的细胞悬液(因为培养孔的直径为 3.5cm,故其底面积S=Tn2=3.14x1.75 2=9.42 cm2,根据接种的细胞数为1x10 5 4^/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3x105 个/ml的细胞悬液)o(8) 培养：将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37°C、5%CO2. RH(相对渥度)100%的培养4q中培养。
5.饲养层细胞的冻存和复苏实验'(1)冻存1) 细胞：镜松，将处于对数生长期的小亂軀於成纤维细胞用于冻存实验。
弃旧培养液，后以PBS 或新鮮培养液漂冼细胞一次。
2) 请化：常规0.25%胰蛋自酶- 0.02%EDTA葡化制备单细胞悬液。
3) 需心重悬：80g富心10min,弃上请，以冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中。
4) 冻存：细胞逐级阵温.冷冻：40C冰箔40min -200C冰箔40min -800C冰箔保存备用。
(2)复苏培养1) 冻融：从低温冰箔中取出冻存细胞，置于37°C水浴锅内，不肘振摇冻存管，使细胞快速融化。
2) 洗涤：转移冻存管内细胞于离心管中，80g禽心5min,弃上请，沉淀用含新鮮DME(M低糖型)重新悬浮，制备单细胞悬液。