小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

小氯歴於成纤维细胞的分离和培养

、实验材料

1. 主要仪器役备

(1) 倒置显微镜(Olympus, Japan)

(2) CO2培养箔(BB16HF,上海力申科学仪器有限公司)

(3) 100ml 的玻璃焙养瓶(江苏海门市大路塑料实验仪彖厂)

(4) 6孔培养板(COSTA, R 每孔直径为3.5cm)

(5) Eppendroff 管

(6) 1ml,2ml,5ml 的玻璃摘管各30支；10ml 尖底禽心管和直径为8cm 的平皿

(7) 雳心机

(8) 5ml 冻存管

(9) 两套小亂用解刘器械(包括眼科剪和眼科＜)

2. 主要试利配制

(1) MEF(mouse embryo fibroblast ,小亂軀於成纤维细胞)培养液

---- 低糖DMEM 母液

1) 用一个1000ml 的大烧杯加入1000ml 无蔺无内毒素的超纯木(购自福州新北生化工业有限公 司)； 2) 将一小软低DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，幷冲 洗 包装袋的内面以冼下所有的粉未。

3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4) 搅拌直至完全涿鮮。

5) 用1NHCI 或1NNaOH 调培养基的pH 至比最终的工作液的PH 低0.2-0.3 ,调好PH 后，将彖器•密 封01该实验中用1NHCI 调PH 至7.3 )o

6) 立即用0.22um 的滤彖过德除菌，装入需压过的盐木瓶中，4°C 保(1存个月内用完)。 ----------------- MEF 培 养液

取100ml 上述配好的低穗DMEM 液体，加入10000IU 青霉素钠(6.25mg )和10mg 链霉素，溶鮮后再次 调节PH 至

7.3,经0.22um 的滤黑过滤至壽压过的血请瓶中，再添加 10ml 分装好的新 生牛血请(Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需 56°C, 30min 夭涪过)，4°C 保存至使用。

⑵ PBS

疫500ml 超纯水中依次溶入

NaCI

KCI

Na 2HPO4.12HO 2

KH2PO4 于121 °C 壽压夭苗30min 或经0.22um 的滤器过滤除菌再分裝入100ml 洁净灭菌的盐水瓶 中, 再放入4°C 冰箔中保存备用。

(3) 0.25%胰養自酶一0.02%EDTA 混金请化液

4 100ml 超纯水中分别溶鮮

4.0g 0.1g 1.445g 0.1g

胰養自酶干粉仃rypsin, Sigma,T4799) 0.25g

EDTA 0.02g

NaCI 0.7g

Na2HPO4.12HO2 0.024g

KH2PO4 0.024g

KCI 0.037g

Tris 0.3g

D■葡萄糖酚红0.1g

于4°C过夜，使之充分涿鮮，用1mol/IHCI调

PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在一10〜30°C 下冻存备用O

(4) 0.1%的朗胶木涿液

称朗胶0.1 g (Sigma, G—9391)涿于100ml超纯木中，先加热涿鮮，再分装入20ml的血请瓶中于121°C 壽压灭菌45min,于4°C保存。

(5) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液

1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液

疫盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml需压夭茵的PBS,用需压夭窗的尖嘴0昆匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。

注：此步应农胶卷暗盒内操作，然后于4°C避光保存。

2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液

在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml 血请瓶中。用前临时配制，并A 37°C的CO2培养箔中预温.30min.。

(6) 冻存液

取2 X 1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DME(M低糖型)培养液和0.1ml二甲基亚矶(DMSO, AR 纯，中国医药集团上海化学试利公司)，置4°C冰箔中预冷60min o

3.动杨：

性成熟期即大于8周龄昆朗种小勺亂，领自福建医科丸哮实睑动物中心。

、实验步骤

1. 获取小亂軀於

⑴将8周龄的昆自早亂和12周蛉的昆勺g按1:1比例金笼。

(2) 次可嚴10:00前观寨¥魚阴遒口，有乳自色或蛋黄色胶冻状物(阴遒栓)即爱为怀孕0.5夭。

(3) 实验肘断硕处死孕13.5天的母亂，置于蜡盘上。

(4) 75%酒精谄毒后，用普通剪刀和镶子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮朕向头尾两側李拉即剥发。

(5) 用眼科弯锁和眼科弯剪打开腹腔，暴療出子玄。

(6) 用眼科住一側子言，分需子言糸朕，服科弯剪剪断子言角和子言颈，将整个子言分禽下来 (注意勿使子富滑落到腹腔

外，避免污染)。

(7) 将子玄置于无菌滤绒上去除血迹。

(8) 在超净台内将子玄移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。

(9) 将子言移入另一盛有PBS的平皿中，用服科弯剪沿子言糸朕打开子言，取出带有於朕的於亂，并

用两把服科钱子剔除於朕，取出於魚(一般有12只)。

(10) 将■於亂移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科饮去除於亂的头、叨肢和内脏，得魚歴躯干。

(11) 将魚歴躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。

2. 小亂胆於成纤维细胞的原代培养(组织块培养法)

(1) 将干净的舗軀躯干移至青霉素小瓶内(毎6个亂軀躯干装1瓶)，用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3 以下的碎块(需剪约

200 T)o

(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS,混匀后连同舗軀碎块一起移至一尖底禽心管中。

(3) 室温下静置5min,用刻度哌管吸去上请液，霧下亂軀组织碎块。

(4) 向装有魚軀碎块的禽心管内加入1ml0.25%胰蛋自酶一0.02%EDTA混合葡化液，轻轻吹吸30秒(可见组织块变得较为

粘稠)。

(5) 再加入1 mIMEF培养液终止谄化，室温下静置5min o

(6) 吸去上请液，留下舗軀组织碎块沉淀。

(7) 毎个禽心管内加入5mlMEF培养液悬浮亂歴组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中(接种时应用谪管将组织块混

匀)。

(8) 做好标记(如培养目期，细胞名称，编号)，将装有氯軀组织碎块的培养瓶放入37°C, 5%CO2, 100%RH的焙养箔中培

养。

(9) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三夭可以观痙，可见组织碎块附着于培养瓶底，周囲细胞呈放射状生长，此时有多种

细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是星圖形的上皮细胞。如果细胞己全部长满则可谄化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。

3. 小亂胚於成纤维细胞的传代培养：

(1) 用滴管吸弃焙养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。

(2) 毎瓶用厲管加入约3ml的PBS,轻轻前后晃动焙养瓶，洗涤细胞一遍，哌弃PBSo

(3) 毎瓶用厲管加入约2ml的0.25%肢蛋仓酶一0.02%EDTA混合荫化液，能盖住培养瓶底，•室温下静置作用30秒，吸

弃葡化液。

(4) 疫倒置镜下观寨，当细胞雯圆时即可加入4—5mllMEF培养液终止淸化，并用摘管吸堆养液用力吹打整个瓶底(约30

T)o

(5) 将培养物全部吸置尖底禽心管内，特置5min,将上层细胞悬液吸置另一禽心管内。

(6) 1000r/min ( 80-1富心机为80g)需心5min,吸弃上请液。

(7) 毎瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。

(8) 毎个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞(吹打肘勿产生气泡) 。

(9) 将创请化传代的细胞疫倒置镜下观痙，可见细胞呈大小不一的圆形。

(10) 将装有谄化后细胞的焙养瓶放入37°C, 5%CO2, 100% RH的培养箔中培养。

(11) 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3葡化传代(操作同前，省略步骤5中的静置和换管)。

4. 饲养层制备

(1) 朋胶预包彼培养板：取1个6孔焙养板(COSTAR毎，孔直径为3.5cm),先紫外照射30min,毎孔用5ml id度滴管加入

3ml的0.1%朋胶水涿液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃朋胶木涿液，并用2ml的PBS洗涤一