限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶

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2基因工程的酶学基础

GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰单一多功能的酶活性内切酶和甲基共同亚基的双化酶分开功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基白结构限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助因子寄主特异性 EcoB：位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI

名词解释

名词解释同裂酶:识别相同序列的限制性内切酶称为～。

它们的切割位点可能不同同尾酶（Isocaudarner）:不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的，切是对称的，即相同的粘性末端星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为～（star activity)。

klenow片段：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，经枯草杆菌蛋白酶处理后，分割成两个片段，其中大片段称为～。

具有5′-3′聚合酶和3′-5′外切酶活性核酸外切酶：核酸外切酶（exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始按顺序降解核苷酸的酶。

质粒的不亲和性：也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。

α-互补：LacZ′基因编码的α-肽链是β-半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。

于是便可以应用X-gal和IPTG显色技术检测转化子。

重组子为白斑，非重组子为蓝斑。

穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）:是一类有人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活的质粒载体穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）:是一类有人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活的质粒载体基因文库：来自于某种生物的不同DNA序列的集合基因组文库：用于构建文库的DNA来源于基因组DNAcDNA文库：用于构建文库的DNA是mRNA群体的拷贝（cDNA）基因治疗：A.对有基因缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的B.把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D.运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的低拷贝数的质粒：每个寄主细胞中仅有1-3份拷贝，这类质粒为严谨型复制控制的质粒（stringent plasmid）高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒为松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）回文结构：DNA局部双螺旋以某一对称轴旋转180度后，与另一侧的互补片段的顺序完全的DNA结构粘性末端（cohesive end）识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后，产生的末端为粘性末端，形成的两个末端是相同的，也是互补的同序同切酶: 识别序列和切割位置都相同同序异切酶（Isoschizomer) 识别序列相同，但切割位点不同. 结合型质粒（conjugative plasmid），又叫自我转移质粒，除了具有自主复制所必需的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因非结合型质粒（non-conjugative plasmid），又称非自我转移的质粒，具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此，不能从一个细胞自我转移到另一个细胞质粒的迁移（mobilization），由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。

核酸内切酶和核算外切酶的名词解释

核酸内切酶和核酸外切酶是生物学领域中常见的两种酶类，它们在DNA和RNA分子的修复、重组和剪切等生物学过程中起着重要作用。

本篇文章将对这两种酶的名词解释进行详细介绍，包括定义、功能、特点、应用等方面的内容，以便读者更好地理解这两种关键酶的作用机制和意义。

一、核酸内切酶的定义和功能1. 核酸内切酶是一类能够在核酸分子中切割特定的磷酸二酯键的酶，其作用是将核酸分子切割成两个或多个片段，并广泛参与DNA和RNA的修复、复制和重组等生物学过程。

2. 核酸内切酶可识别核酸分子中特定的核酸序列，并在该序列特定的位置上将其切割成两个相对应的片段，从而实现对核酸分子的精确修饰和分解。

3. 核酸内切酶在细胞分裂、DNA修复和RNA剪切等生物学过程中发挥着重要作用，是维持细胞遗传信息稳定性和正常功能的关键因素。

二、核酸外切酶的定义和功能1. 核酸外切酶是一类能够在核酸分子中切割磷酸二酯键的酶，其作用是在核酸分子的末端位置对核酸链进行切割，从而在DNA和RNA分子的修复、降解和重组等生物学过程中发挥着重要作用。

2. 核酸外切酶通常通过识别特定的核酸序列或结构，在核酸分子的末端位置将其切割成两个或多个片段，促进DNA和RNA分子的进一步修复和降解。

3. 核酸外切酶在细胞的免疫防御、DNA降解和RNA后修饰等生物学过程中发挥着重要作用，对维持细胞内核酸分子稳定性和功能性具有重要意义。

三、核酸内切酶和核酸外切酶的应用1. 核酸内切酶和核酸外切酶在分子生物学研究中广泛应用，包括DNA 和RNA的分子克隆、限制性酶切图谱分析、基因组定位、DNA指纹分析、基因突变检测等方面，成为分子生物学实验的重要工具。

2. 核酸内切酶和核酸外切酶在基因工程和基因编辑技术中发挥着关键作用，如CRISPR/Cas9基因编辑技术就利用了核酸内切酶的特定识别和切割能力，实现对目标基因的精准编辑和修饰。

3. 核酸内切酶和核酸外切酶的应用不仅局限于科研领域，在医学诊断、药物研发和生物工业生产等领域也具有重要意义，为相关领域的发展和进步提供了有力支持。

核酸酶范文

核酸酶范文核酸酶核酸酶（nuclease）是一类能够降解核酸的酶类。

核酸酶在生物体内起着重要的作用，参与了许多生物过程，如DNA复制、转录、修复和重组等。

核酸酶可以分为核酸内切酶和外切酶两类。

核酸内切酶用于切割酶解产物，而核酸外切酶则负责降解寡聚核苷酸和多聚核苷酸。

核酸内切酶（endonuclease）是一类特殊的酶，它能够在DNA或RNA链的内部剪切链。

核酸内切酶可以识别特定的序列，并将其切割成两段或多段。

几乎所有的细胞都含有核酸内切酶，这些酶在DNA修复、重组和重组中起着非常重要的作用。

其中，限制性内切酶是最常见的核酸内切酶之一、限制性内切酶能够识别并切割具有特定序列的DNA链。

限制性内切酶可以产生具有粘性末端或平滑末端的切割产物。

这种特异性切割序列使得限制性内切酶广泛应用于DNA重组实验和基因工程中。

另一类核酸酶是核酸外切酶（exonuclease），它能够将DNA或RNA的核酸链从末端开始逐一剪切。

核酸外切酶根据切割的方向和位置可以分为3'外切酶和5'外切酶。

3'外切酶从核酸链的3'末端开始剪切，而5'外切酶则从核酸链的5'末端开始剪切。

核酸外切酶在DNA修复和降解过程中起着重要的作用。

除了功能上的差异，核酸酶还具有不同的催化机制。

一类核酸酶使用金属离子作为催化剂，例如镁离子和锌离子。

这类酶被称为金属依赖性核酸酶。

另一类核酸酶则不需要金属离子催化，被称为金属无依赖性核酸酶。

金属无依赖性核酸酶的催化机制较为复杂，可能包括三个阶段的反应，即活性位点的形成、反应的进行和产物的释放。

在生物体内，核酸酶的活性受到多种因素的调控。

一些核酸酶对pH 值和离子浓度敏感，而另一些核酸酶则受到其他蛋白质的调控。

例如，核酸酶可以与负责DNA修复的蛋白质形成复合物，以协调修复过程。

此外，一些核酸酶还受到DNA或RNA的特定结构的影响。

总的来说，核酸酶是生物体中具有降解核酸能力的酶类。

分子生物学第四章--基因工程常用工具酶

A．以酶切特点来分同位酶：识别相同序列，切点不同。
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。
第四章基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.

分子克隆技术常用的工具酶

经修饰的DNA不再被限制酶降解。
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的酶解活性。受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程

考研《生物化学》—名词解释

考研《生物化学》—名词解释考研《生物化学》—名词解释氨基酸（amino acids）:是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连接在α-碳上。

氨基酸是肽和蛋白质的构件分子。

必需氨基酸（essential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸等氨基酸。

非必需氨基酸（nonessential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成的，不需要由饮食供给的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。

等电点（pI，isoelectric point）：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的净电荷为零）的pH值。

茚三酮反应（ninhydrin reaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。

肽键（peptide bond）：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合，除去一分子水形成的酰胺键。

肽（peptides）：两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物。

蛋白质一级结构(primary structure)：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。

层析(chromatography)：按照在移动相（可以是气体或液体）和固定相（可以是液体或固体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。

离子交换层析(ion-exchange column chromatography)：使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。

透析（dialysis）：通过小分子经半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)：也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。

一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。

第四讲 DNA分子的酶切

酶切产生5’突出黏性末端
5’ -C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-
-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T- 3’
EcoRI 37℃
P-A-A-T-T-C-G-A-’ 5’-C-T-G-OHG … 3’ -G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T3’
酶切产生3’突出黏性末端
-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 5’ …-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 3’
II型
单一条肽链构成，单功能，活性仅需 Mg2+。
III型
二亚基蛋白质，双功能：既有内切酶活性，又有修饰酶活性。切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，
特异性识别并切割 DNA 。切割位点位于识别位点序列范围内。
应用最广的限制性内切酶，通常重组 DNA 操作中内切酶即指此。
DNA甲基化程度
大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基化酶（dam），在GATC序列中腺嘌呤N6位引入甲基，使用甲基化酶影响BclI、MboI等的活性。缺失的菌株制大肠杆菌DNA胞嘧啶甲基化酶（dcm），备质粒DNA 在CCAGG或CCTGG序列中胞嘧啶C5 位引入甲基，影响EcoRII等的活性。
种类型切割方式
5’突出黏性末端
3’突出黏性末端
酶切产生平头末端
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C… 5’
PvuII 37℃
5’ … G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C… 5’

华中农业大学生物化学本科试题库第12章核酸的降解和核苷酸代谢

8. A
9. B
10.B
11.D 12. B。
2. 对
3. 对
4. 对
5.错
6. 对
7. 对
8. 对
9. 错
10. 对
(五) 简答题 1. 稀碱的作用下，RNA 在碱（OH-）的作用下生成 2ˊ，3ˊ-环核苷酸的中间物，然后由于 H2O 的参入生成 2′-和 3′-核苷酸的混合物。进一步水解生成核苷。DNA 的核糖 2 位上没有羟基，在碱（OH-）的作用下不能生成 2ˊ，3ˊ-环核苷酸的中间物。DNA 不能被碱水解。 2. 嘌呤核苷酸分解的过程如下：腺嘌呤核苷酸→腺嘌呤核苷→次黄嘌呤核苷→次黄嘌呤 *║ 鸟嘌呤核苷酸→ 鸟嘌呤核苷→ 黄嘌呤核苷→ 黄嘌呤→ 尿酸→尿囊素→尿囊酸→尿素+乙醛酸。（*黄嘌噙氧化酶催化的反应。）人、猿类、鸟类、爬虫类和大多数的昆虫以尿酸作为嘌呤碱的最终代谢产物；其它多种生物还可进一步降解尿酸，形成不同的代谢产物，除上述提及的哺乳动物，其它哺乳动物体中嘌呤的降解产物为尿囊素。某些硬骨鱼可将尿囊素进一步分解形成尿囊酸；大多数鱼类、两栖类中尿囊酸可再分解为尿素和乙醛酸；某些低等动物可将尿素分解为氨和二氧化碳。其它原因导致体内过多的尿酸积累特别是在关节组织中积累可产生痛风症。别嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶，减少尿酸的生成可缓解痛风症。 3. 嘌呤和嘧啶核苷酸的合成，通过完全不同的途径进行。嘌呤核苷酸合成的第一步是 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）与谷氨酰胺生成 5-磷酸核糖胺（PRA）。最后合成的产物是次黄嘌呤核苷酸，然后再转变为鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸。嘧啶核苷酸的合成一开始没有核糖参加，合成的产物是嘧啶碱的前体乳清酸，然后再与 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）生成乳清酸核苷酸，再进一步转变为尿嘧啶核苷酸。在嘌呤核苷酸合成过程中有：谷氨酰胺、甘氨酸和天冬氨酸参加。在嘧啶核苷酸全成过程中有：谷氨酰胺和天冬氨酸参加。 4. 嘌呤核苷酸合成的调节：（1）催化合成途径第一步反应的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶是别构酶，受 AMP 和 GMP 的反馈抑制。（2）次黄嘌呤核苷酸氧化成黄嘌呤是由次黄嘌呤核苷酸氧化酶催化，过量的 GMP 抑制该酶的活性。（3）次黄嘌呤核苷酸在 GTP 供能的条件下，与天冬氨酸生成腺苷酸琥珀酸，催化该反应的腺苷酸琥珀酸合成酶，受过量 AMP 的抑制。嘧啶核苷酸合成的调节：（1）氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ受 UMP 的反馈抑制。（2）天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）是别构酶，ATP 是正效应物，GTP 是负效应物。（3）CTP 合成酶受 CTP 的抑制。 5. 羽田杀菌素（N-羟-N-甲酰甘氨酸）与天冬氨酸结构相似，可强烈抑制腺苷酸琥珀酸合成酶的活性，该酶催化：次黄嘌呤+天冬氨酸+GTP→腺苷酸琥珀酸，然后由腺苷酸琥珀酸裂解为腺苷酸和延胡索酸。羽田杀菌素阻止腺苷酸琥珀酸生成，减少腺苷酸的合成量，是一种具有抗癌作用的抗菌素。 6. 标记氨基氮的腺嘌呤进入人、小鼠和鸽子体内，分解后标记物出现在 NH3 上排出体外。标记 N7 的腺嘌呤进入人和鸽子体内分解后，标记物出现在尿酸分子中，进入小鼠体内分解后，标记物出现在尿囊酸分子中。 7. 将标记 14C4 的腺嘌呤在含有鱼的腺嘌呤分解酶系统中， 14C4 出现在腺嘌呤分解的最终产物乙醛酸分子上。 H — 14 C4OCOOH 3Cp 8. (1)该寡核苷酸为十二个单核苷酸所组成，各种单核苷酸的分子比例为 A：C：G：U = 2：4：4：2。 ApUp (2) 胰核糖核酸酶处理得到的多核苷酸碎片的 3 端均含有嘧啶（U 或 C）核苷酸：

2 基因工程的酶学基础

14
2. Ⅲ型限制性内切酶
识别序列与切割位点不相一致
切割位点相对固定反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
EcoP1: AGACC EcoP限制性内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割（一致）序列呈典型的旋转对称型回文结构
酶催转换 DNA易位作用
甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的序能列进行切割序列特异的切割不是
能
是十分有用
能
是用处不大
37
基因工程中的用途无用
四、限制性内切酶酶解反应条件 1. 标准酶解体系的建立
识别位点处
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
EcoR V
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’ 产生平齐末端
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
Bgl Ⅱ
29
Sau 3A
[7] 限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的
温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割
能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性
如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。
30
使用的时候要特别注意！
EcoR I和BamH I等都有*活性。
7
4. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株

酶切、连接与转化

Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因此第二活性又称星号活性。概括起来，诱导星号的因素有以下几种： 1,高甘油含量(>5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高(100u/ug DNA)；3,低离子强度 (<25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）
限制性酶切 (修饰 DNA 末端) 连接载体与插入片段转化 (将重组质粒导入宿主细胞) 分析重组子
谢谢
限制性内切酶的特点
1. 2. 3. 4. 高度特异性商业化生产反应需要Mg2+ 不同的内切酶可能产生相同的末端
4. 影响核酸限制性内切酶活性的因素
（1）DNA 纯度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应温度（4）DNA的分子结构（5）限制性内切酶的缓冲液
5、限制性内切酶的星号活性
3’ 突出末端
p -GGG-3’ OH-CCC-5’
平末端
+
粘性末端: DNA片段经限制性内切酶切割后, 在切割位点处所产生突出的5’-或3’-单链末端.
识别序列
识别 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶识别 6 bp 发生的概率为 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp) 5’ GAATTC 3’ 如 EcoRI 识别序列: 3’ CTTAAG 5’

基因工程常用的工具酶

基因工程常用的工具酶常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系生物制药0911 刁亚军学号:2009423134引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。

本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。

这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。

限制性内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。

根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

限制性内切酶的由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组限制性核酸内切酶成，第四个字母表示菌株(品系)。

例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。

限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。

它能识别外源DNA并将其降解。

单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。

基因工程中常用的酶

分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长，切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割，可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗基因插入到载体中，制备基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶，通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性等特性，能够在特定的模板指导下，高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其切割成适当大小的片段，进行基因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识别并切割DNA特定序列的酶，是基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特异性，能够识别并切割DNA中的特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例

限制性核酸内切酶和核酸外切酶

核酸外切酶exonuclease核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。

其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。

按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。

核酸内切酶endonuclease核酸内切酶是在核酸水解酶中，水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶。

限制性核酸酶在原核和真核细胞中都有发现，按其性质可分为三大类。

所谓Ⅰ型的酶要求DNA分子上有特定的识别顺序，但是切点却不在此识别顺序之中，而与之有一定距离。

在反应中,它还要求有ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。

酶由不同的α，β，γ亚基组成。

全酶兼有限制性内切酶的活性和甲基化酶的活性。

Ⅲ型的酶与Ⅰ型的酶有相似特征，只是切点距识别顺序距离是严格的。

Ⅱ型的酶，可说是独立的限制性核酸内切酶。

因为，它并不兼有甲基化酶的活性。

它切断DNA时不需ATP,也不需SAM。

它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。

所认知的位置多为短的回文序列，下面对Ⅱ型酶作进一步的介绍。

常用的限制性核酸酶有EcoRⅠ,HindⅢ,AluⅠ,HaeⅢ等。

EcoRⅠ来自Escherichia coli RY13之酶ⅠHindⅢ来自Haemophilius influenzae Rd之酶ⅢAluⅠ来自Arthrobacter luteus之酶ⅠHaeⅢ来自Haemophilus aegyptius之酶Ⅲ这些酶的识别顺序多数是4或6个碱基对。

有的酶要5或7个甚至更长的识别顺序。

识别顺序短的在DNA分子上出现的几率多，酶可把DNA分子切成较多的小片段。

识别顺序长的则往往只切出少数大片段。

这些酶切片段统称为限制性片段。

根据不同限制性核酸酶在某DNA分子上的切点分布，可以绘出该DNA分子的“限制性图谱”即“酶切图谱”，也称“物理图谱”。

限制性图谱可以反映出一个DNA片段或基因结构的基本特征。

基因工程中常用的酶分类和性质

3’
3‘ A
5’
T4 DNA Ligase
5‘ G G A T C T 3‘ C C T A G A
3’ • 连接处不再是内切酶识别序列
5’
• BamH Ⅰ/ Bgl Ⅱ • Sal Ⅰ/ Xho Ⅰ • Spe Ⅰ/ Xba Ⅰ
三、限制酶的识别序列与DNA的切割
（P47） • 1、限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特
基因工程中常用的酶分类和性质
• 一、限制性核酸内切酶 • 二、连接酶 • 三、聚合酶 • 四、修饰酶
第一节限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme)
基因的剪刀
----------------限制性内切酶
• 核酸酶（P41-42)：切割相邻的两个核苷酸残基间的磷
酸二酯键导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。可分为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。
• 具3’突出未端的粘性未端
5‘ 3‘
5‘ 3‘
GAGCTC CT CGAG
Sac Ⅰ
G A G C T 3’
5’ C
C 5’
3’ T C G A G
3’ 5’
3’ 5’
• KpnⅠ (5’ ··· GGTAC^ C ··· 3’) • PstⅠ (5’ ··· CTGCA^ G ··· 3’) • SacⅠ (5’ ··· GAGCT^ C ··· 3’)
化酶亚基分开
能酶
识别位点 4～6bp 序列
5～7bp
两侧对称或不对称
常为回文
不对称序列
剪切位点在限制位点
限制位点上游离限制位点 >1000
24～26bp 处 bp 的非特异位点

核酸酶

复习思考题
1. 概念:（1）核酸的一级结构概念: （2）解链温度（Tm）解链温度（Tm）（3）DNA变性 DNA变性（4）核酸分子杂交碱基与核糖、 2. 碱基与核糖、核糖与磷酸及核苷酸之间各以何种键连接？何种键连接？
简述RNA DNA的主要不同点 RNA与的主要不同点。 3. 简述RNA与DNA的主要不同点。 DNA双螺旋结构要点双螺旋结构要点。 4. B型DNA双螺旋结构要点。真核生物mRNA的结构特点。 mRNA的结构特点 5. 真核生物mRNA的结构特点。 6. tRNA一~三级结构各有哪些特点？ tRNA一三级结构各有哪些特点？试述RNA的种类及其主要功能。 RNA的种类及其主要功能 7. 试述RNA的种类及其主要功能。

第六节
核酸酶
核酸酶(nucleases)是指所有可以是指所有可以核酸酶水解核酸的酶。水解核酸的酶。按底物不同分为：按底物不同分为： DNA酶（DNase ）酶 RNA酶（RNase ）酶
按作用部位不同分为：按作用部位不同分为：核酸外切酶核酸内切酶限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：有严格的序列依赖性，有严格的序列依赖性，是基因工程中的重要工具酶。程中的重要工具酶。 5´末端外切酶 ´ 3´末端外切酶 ´