限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的:通过限制性内切酶酶切分析,了解DNA的结构和特性,掌握限制性内切酶的使用方法,以及掌握DNAGel电泳技术。
实验原理:限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶,可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。
限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段,这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。
将DNA和内切酶一起反应一段时间后,可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离,从而得出不同DNA序列的长度和特征,达到对DNA结构特点进行研究的目的。
实验步骤:1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。
2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。
3. 按照所选内切酶的说明书,将相应量的酶加入DNA样品中。
混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。
4. 制备1%的琼脂糖凝胶。
5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后,放入琼脂糖凝胶槽中。
6. 进行DNAGel电泳,根据DNA片段的大小,将DNA分离开。
7. 取出凝胶进行染色,直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。
实验注意事项:1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施,避免污染。
2. 在进行内切酶酶切反应时,需要严格按照酶的使用方法进行操作,以保证反应质量和结果准确。
3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。
4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作,以避免凝胶破损或电流过强,影响实验结果。
实验结果分析:通过限制性内切酶酶切分析后,可以得到DNA片段的长度和特征,从中了解到DNA的特性和结构。
实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结,以便进一步推进科研工作。
限制性核酸内切酶切割位点分析
分析结果
◆ 分析方法2(举例) 利用在线分析工具NEBcutter进行分析
输入序列或注册号,或调取载体序列 ,选择酶和显示方式
显示结果
具体描述
其它分析限制性内切酶切割位点软件
Restriction Map and MCS of pEGFP-N1 Vector
◆ 分析方法1(举例) 在本地计算机上利用BioEdit工具进行分析
拷贝fasta格式的序列,在BioEdit分析工具的“File”栏 目选择“New from Clipboard”输入序列
选择被粘贴序列的名称,在“Sequence”栏目点击 “NucleicAcid→Restriction Map”
生物信息学
第八章 生物信息学其他应用
8.7 限制性核酸内切酶切割位点 分析
பைடு நூலகம்
分析限制性内切酶切割位点
◆ 展示DNA序列的酶切位点图 ❖ 分离克隆基因或特定的DNA片段 ❖ 分子标记,如CAPS(cleaved amplified polymorphism sequence)标记
◆ 可选择限制性内切酶
◆ EnzymeX /science/enzymex
◆ RestrictionMapper /
◆ DNAMAN /pc/pcmain_new.html
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用,是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4~8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下,识别序列越长,在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的,即粘性末端,并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同,可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同,可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定,体积为20 μl, 含0.2~1 μg DNA,大量酶切反应用于制备目的基因片段,体积为50~100 μl,DNA用量在10~30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后,通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器:水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂:质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
酶切检测实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握限制性核酸内切酶(RE)的原理及其在分子生物学中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习并实践质粒DNA的酶切技术。
4. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用。
5. 分析酶切结果,鉴定目的基因。
二、实验原理限制性核酸内切酶(RE)是一类能够识别特定的DNA序列并在该序列处切割双链DNA的酶。
它们在分子生物学中具有广泛的应用,如基因克隆、基因编辑、基因表达调控等。
质粒DNA是常用的克隆载体,其提取方法主要有碱裂解法、盐析法等。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
酶切是将质粒DNA切割成大小不同的片段,通过琼脂糖凝胶电泳技术分离这些片段,从而鉴定目的基因。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术,其原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率差异进行分离。
在电场作用下,DNA分子带负电荷,会向正极移动。
DNA分子的大小与其迁移速率成反比,因此,通过比较不同片段的迁移距离,可以鉴定DNA片段的大小。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶(RE)3. 琼脂糖凝胶4. TAE缓冲液5. DNA marker6. 电泳仪7. 显色剂8. 紫外灯四、实验步骤1. 质粒DNA提取- 将含有质粒DNA的菌液接种于含有抗生素的LB培养基中,37℃培养过夜。
- 取适量菌液,加入等体积的碱裂解液,混匀,室温放置5分钟。
- 加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置10分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟,弃上清。
- 加入700 μL 70%乙醇,混匀,室温放置5分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟,弃上清。
- 加入50 μL无菌水,混匀,即得质粒DNA。
2. 酶切- 取10 μL质粒DNA,加入10 μL限制性核酸内切酶缓冲液,混匀。
- 加入1 μL限制性核酸内切酶,混匀。
- 37℃水浴反应3小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳- 配制琼脂糖凝胶,加入适量的DNA marker。
实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应(定稿)
实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ;3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。
Pvu I 的识别序列5'…CGAT↓CG…3' →5'…CGATCG…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒:2686bp,0.5μg/μl,40μl/管(日本东洋纺织株式会社) Pvu I 酶及其酶切缓冲液:10U/μl,200U/管(北京鼎国昌盛生物技术有限公司),在pUC18质粒上有两个酶切位点,分别为酶切第一个碱基位是276(896bp)、2066(1790bp)10X的酶切反应体系(使用时酶切反应体系为1X)琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭:5×TBE 电泳缓冲液:(使用时稀释10倍)6×电泳载样缓冲液:五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl(1μg)和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl(使总体积为19μl), 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物,用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。
限制性核酸内切酶一知识讲稿
切割方式独特
详细描述
Ⅲ型限制性核酸内切酶的切割方式也较为独特,它通常在识 别位点的两侧进行切割,产生具有不同序列和长度的DNA 片段。
总结词
应用潜力大
详细描述
由于Ⅲ型限制性核酸内切酶的独特特性和切割机制,它在 基因组学、生物信息学和基因治疗等领域具有较大的应用 潜力。
03
限制性核酸内切酶的作 用机制
04
限制性核酸内切酶的基 因工程应用
基因克隆与鉴定
基因克隆
限制性核酸内切酶能将DNA切割成特定序 列的片段,这一特性使得科学家能够通过切 割和重新连接DNA片段,将感兴趣的基因 从复杂的基因组中分离出来,从而实现基因 克隆。
基因鉴定
限制性核酸内切酶可以用来分析特定基因的 表达模式,通过比较不同组织或发育阶段中 特定基因的表达水平,可以了解该基因的功
感谢您的观看
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割位点固定
详细描述
B型限制性核酸内切酶的切割位点通常固定,切割后产生具有固定长度和序列的 粘性末端,这使得酶切后的DNA片段容易进行连接和重组。
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割效率高
详细描述
B型限制性核酸内切酶具有较高的切割效率,能够在短时间内将大量DNA分子进行切割,提高实验的 效率。
新技术的应用
随着生物技术的不断发展,限制性核酸内切酶的应用前景将更加 广阔,如基因编辑、基因治疗等领域。
安全性和伦理标准的提高
随着人们对生物技术的认识加深,限制性核酸内切酶的安全性和伦 理标准也将不断提高。
法规监管的完善
政府和国际组织将加强对限制性核酸内切酶的法规监管,确保技术 的合理应用和发展。
THANKS FOR WATCHING
基因工程酶切实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因工程中常用的酶切技术;2. 掌握DNA酶切实验的基本操作步骤;3. 熟悉DNA酶切反应的原理及影响因素。
二、实验原理DNA酶切实验是基因工程中的重要技术之一,通过限制性核酸内切酶(RE)对DNA 分子进行切割,产生具有特定黏性末端或平末端的DNA片段。
这些DNA片段可用于后续的基因克隆、基因表达等实验。
限制性核酸内切酶(RE)是一种能够识别并切割特定DNA序列的酶,其识别序列通常由4-6个核苷酸组成。
根据酶切位点的不同,RE可分为三类:I类、II类和III 类。
其中,II类RE是最常用的酶切酶,具有高度特异性和稳定性。
三、实验材料1. DNA模板:提取自细菌、动物或植物细胞的总DNA;2. 限制性核酸内切酶(RE):根据目的基因序列选择合适的酶切酶;3. 10×酶切缓冲液;4. dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸);5. Taq DNA聚合酶;6. 1×PCR缓冲液;7. 25℃反应体系;8. 灭菌水;9. 1.5%琼脂糖凝胶;10. 电泳仪;11. DNA回收试剂盒。
四、实验步骤1. DNA酶切反应:取2μl DNA模板,加入4μl 10×酶切缓冲液、2μl RE、2μl dNTPs、4μl Taq DNA聚合酶和2μl灭菌水,混匀后置于PCR仪上,进行酶切反应。
反应条件根据酶切酶说明书进行调整。
2. PCR扩增:取酶切反应产物,加入2μl 1×PCR缓冲液、2μl Taq DNA聚合酶、2μl dNTPs、2μl 10×PCR缓冲液和4μl灭菌水,混匀后置于PCR仪上,进行PCR扩增。
扩增条件根据目的基因序列和酶切酶说明书进行调整。
3. 琼脂糖凝胶电泳:将PCR扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶中,进行电泳分离。
根据DNA分子大小,调整电泳电压和时间。
4. DNA回收:将凝胶中的目的DNA片段用DNA回收试剂盒回收,得到纯化的DNA片段。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法,个人觉得总结得很好,特转贴供本供大家分享。
酶切现问题,看内切酶说明书,相应试剂公司目录。
不同公司出产的内切酶,菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同,。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基,同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。
杂蛋白存在会影响酶切,表现为A260/A280低于1.8;抑制物常见酚、盐、乙醇等;【重新提DNA,使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂,1.2 酶的问题:确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间,但过期后只要能够有效酶切,可用。
确认酶切效果不好,做标记,更换] 。
【题外话:用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求,保存-20~-30度。
并非越低越好,酶通常是保存在50%甘油缓冲液中,温度过低时,酶会发生冻结(运输过程例外,由于酶需要低温运输,所以方便的情况下是使用干冰,酶会冻结,但冻结次数有限,相对是一种比较好的选择),如果是经常使用的话,酶会被反复冻融,从而降低了活性。
当然如果温度过高,呵呵,你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。
这点大家都清楚,不过多强调也没坏处。
因为实验室有些同学,酶取出后是放在冰盒上的,但有两点忽略了:拿酶的时候,手不是抓着管子上端,而握在管子的底部,相当于用手在给酶进行加热;有些酶是放在冰盒中,但吸酶的时候,还是将酶拿出来。
偶尔一次没有大碍,反复如此,可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。
有时我们可以发现,即使是-20~-30度放置,酶仍然会冻结。
个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时,酶管的盖子在较长时间的开着,甘油会吸取空气中的水分,对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用;2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法;3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用;4. 通过酶切鉴定,验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶(Restriction Enzyme)是一种特殊的核酸酶,能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式,限制性核酸内切酶分为两类:I类酶和II类酶。
其中,II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛,如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是:通过将目的基因与载体连接,构建重组质粒。
然后,利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切,观察酶切后的DNA片段长度,以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂:限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等;2. 仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等;3. 样品:重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化(1)取含有重组质粒的细菌,用碱裂解法提取质粒DNA;(2)将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀,得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建(1)取目的基因DNA和载体DNA,分别进行PCR扩增;(2)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定目的基因和载体DNA的大小;(3)利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶,将目的基因连接到载体上;(4)转化大肠杆菌,筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定(1)取重组质粒和载体DNA,分别进行酶切反应;(2)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察酶切后的DNA片段长度;(3)根据酶切结果,判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果,比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点,则说明目的基因成功插入载体。
分子酶切实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的原理和应用。
2. 熟悉质粒DNA的提取和纯化方法。
3. 学习琼脂糖凝胶电泳技术,分析酶切结果。
4. 探讨影响酶切效率的因素。
二、实验原理限制性核酸内切酶(RE)是一种能够识别双链DNA上的特定序列,并在识别序列处切割DNA的酶。
根据酶切位点的不同,限制性核酸内切酶可分为两类:Ⅰ类酶和Ⅱ类酶。
本实验所使用的是Ⅱ类酶,如HindⅢ、EcoRⅠ等。
质粒DNA的提取和纯化是分子生物学实验中的基本操作,通过提取和纯化可以获得高纯度的质粒DNA,便于后续的酶切、连接、转化等操作。
琼脂糖凝胶电泳技术是一种常用的分子生物学分离技术,通过电泳分离不同分子量的DNA片段,从而对酶切结果进行鉴定。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶(如HindⅢ、EcoRⅠ)3. 琼脂糖4. DNA marker5. Tris-HCl缓冲液6. 10×Loading buffer7. 1×TAE电泳缓冲液8. 0.5×TAE电泳缓冲液9. 0.5%琼脂糖凝胶10. 紫外灯11. 显影液四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化(1)将质粒DNA加入Tris-HCl缓冲液中,加入等体积的酚/氯仿,剧烈振荡,静置5分钟。
(2)取上清液,加入等体积的氯仿,剧烈振荡,静置5分钟。
(3)取上清液,加入2/3体积的95%乙醇,混匀,室温放置10分钟。
(4)将沉淀物用70%乙醇洗涤,室温放置5分钟。
(5)将沉淀物溶于适量TE缓冲液中,即为纯化的质粒DNA。
2. 酶切反应(1)将纯化的质粒DNA加入酶切缓冲液中,加入限制性核酸内切酶,混匀。
(2)37℃水浴孵育2-3小时,或根据酶的说明书进行。
(3)加入适量DNA loading buffer,混匀。
3. 琼脂糖凝胶电泳(1)制备0.5%琼脂糖凝胶,加入1×TAE电泳缓冲液。
(2)将酶切反应产物加入凝胶孔中,同时加入DNA marker。
DNA的限制性酶切实验原理
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
1
一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性, 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类(I型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链,但是切割的核苷 酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克
❖ 如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 , 则 以 罗 马 数 字 表 示 , 如 HindⅠ, HindⅡ,HindⅢ等。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
7
由 pUC18改造而来,大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
8
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
9
二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具 有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场 作用下向正极泳动。
溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物, 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
11
琼脂糖电泳的优点
(1)琼脂糖含液体量大,可达98-99%,近似自由 电泳,但是样品的扩散度比自由电泳小。
生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构),并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。
它主要分布于细菌体内,目前已发现1800多种。
根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同,可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型,而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶,如Eco RⅠ、BamHⅠ等,它们被誉为分子生物学家的手术刀。
临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点,因此当用一定的限制性内切酶切割时,产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异,因而发生DNA限制性酶切图谱改变,据此可达到基因诊断的目的。
实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析,观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱,理论上可产生21226bp,7421bp,5804bp,5604bp,4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。
经琼脂糖凝胶电泳后,在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。
【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1.DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。
2.限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司,每种限制性内切酶均配有2种缓冲液,在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。
3.10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g,冰醋酸5.7ml,0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml,加蒸馏水至500ml。
酶切分析实验报告
一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果,鉴定目的DNA片段。
二、实验原理限制性核酸内切酶(Restriction Endonucleases)是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。
在基因工程中,限制性核酸内切酶用于切割DNA分子,以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。
本实验中,我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
根据酶切位点的不同,质粒DNA会被切割成不同长度的片段。
通过比较酶切前后的DNA片段,可以鉴定目的DNA片段。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取:根据试剂盒说明书提取质粒DNA。
2. 酶切反应:将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合,加入缓冲液,进行酶切反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳:- 准备琼脂糖凝胶,加入电泳缓冲液。
- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。
- 连接电源,进行电泳。
- 电泳完成后,关闭电源,取出凝胶。
4. 凝胶成像与分析:- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。
- 根据标准DNA分子量标记,分析酶切产物的长度。
- 比较酶切前后的质粒DNA片段,鉴定目的DNA片段。
五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取:成功提取出质粒DNA,通过紫外分光光度计检测,A260/A280比值在1.8-2.0之间。
2. 酶切反应:限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA,产生不同长度的片段。
3. 琼脂糖凝胶电泳:- 电泳结果显示,酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。
- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物,可以确定酶切位点的位置。
酶切体系实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶(RE)的基本原理和应用。
2. 学习构建酶切体系并优化反应条件。
3. 熟悉琼脂糖凝胶电泳技术,用于检测酶切产物。
二、实验原理限制性核酸内切酶(RE)是一类具有特异识别和切割DNA序列能力的酶。
它们在分子生物学研究中广泛应用于基因克隆、基因表达调控、基因突变分析等领域。
RE能够识别双链DNA中的特定核苷酸序列,并在识别位点处切割双链,产生具有粘性末端或平端的两条DNA片段。
酶切体系是指将RE、DNA模板、缓冲液等试剂混合在一起进行反应的体系。
构建酶切体系时,需要考虑RE的种类、浓度、反应时间、温度等条件。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA片段的技术,通过观察DNA条带的位置和数量,可以判断酶切反应是否成功。
三、实验材料1. 试剂:限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖、Tris-HCl缓冲液、NaOH、NaCl、EtOH、异丙醇、DEPC水等。
2. 仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机、恒温箱等。
四、实验方法1. 构建酶切体系(1)将DNA模板和RE分别加入PCR管中。
(2)加入适量的缓冲液。
(3)根据RE的说明书,调整反应体积和酶的浓度。
(4)混匀后,将PCR管置于适宜的温度下进行反应。
2. 琼脂糖凝胶电泳(1)制备琼脂糖凝胶:将琼脂糖和Tris-HCl缓冲液混合,加热溶解,冷却至60℃左右,加入适量的NaOH和NaCl,混匀后倒入电泳槽中。
(2)将酶切产物和DNA分子量标准加入凝胶孔中。
(3)接通电源,进行电泳。
(4)电泳结束后,关闭电源,取出凝胶。
(5)将凝胶放入凝胶成像系统中,观察DNA条带。
五、实验结果与分析1. 观察凝胶中的DNA条带,判断酶切反应是否成功。
2. 分析DNA条带的位置和数量,推测酶切产物的长度和数量。
3. 比较不同酶切条件下的酶切结果,优化酶切体系。
六、实验结论通过本实验,我们掌握了限制性核酸内切酶的基本原理和应用,学会了构建酶切体系并优化反应条件,以及使用琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切产物。
DNA的限制性酶切实验原理
(2)、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 (如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
4.酶解温度与时间:
大多数限制酶反应温度为37℃,如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等,也有如BclⅠ需在50℃下进行反应, 反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定,原则 是酶:DNA=2-3:1 2小时即可,充分酶解。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
23
Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间;
NaCl浓度不同形成3种级别的离子强度:
低盐(10mM NaCl)
中盐(50mM NaCl)
高盐(100mM NaCl)
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
22
五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其 杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的 强度,应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡,以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5’端 突出;3’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用, 才使得人们能
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤,掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术,并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中,使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理:1. DNA提取:利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切:利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列,并在这些序列上切割DNA分子,产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接:利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接,形成重组DNA分子。
4. 转化:将重组DNA分子导入宿主细胞,使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选:通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取:取一定量的大肠杆菌DH5α菌液,加入细胞裂解液,充分振荡,加入蛋白酶K,37℃水浴30min,加入酚/氯仿抽提,离心,取上清液,加入无水乙醇沉淀,离心,洗涤,溶解,得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切:将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切,酶切产物经电泳鉴定后,切胶回收酶切产物。
3. 连接:将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接,连接产物经电泳鉴定后,取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化:将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中,在冰浴中振荡,加入CaCl2,热冲击,涂布于含有抗生素的琼脂平板上,37℃培养过夜。
5. 筛选:挑选单菌落,进行PCR扩增,鉴定阳性克隆。
限制性内切酶技术在基因工程中的应用
限制性内切酶技术在基因工程中的应用基因工程作为生命科学领域的前沿技术之一,已经成为了当今世界农业生产、医疗保健、环境保护等领域中不可或缺的一部分。
在这个过程中,限制性内切酶技术发挥的作用十分重要,因为它可以方便地对DNA分子中的目标序列进行选择性切割,从而实现基因工程技术的多种应用。
这里,我们主要论述限制性内切酶技术在基因工程中的应用。
一、限制性内切酶技术的概述限制性内切酶是细菌体内存在的一种具有特定特性的内切酶,在酶学中有一个很长的历史。
它们最先在20世纪50年代被发现,随后又在60年代得到了更广泛的应用。
这种酶可以在DNA分子中寻找到一段特定的核苷酸序列,并在该序列外侧切割骨架中的化学键。
不同的限制性内切酶有着不同的底物特异性和识别序列。
有些酶只认可具有对称性的序列,在DNA双链中的两个链也同时被切割,如EcoRI,而另一些酶则只切割特定的非对称的序列,如HpaII。
二、限制性内切酶技术的原理限制性内切酶技术的原理非常简单,利用细菌或者微生物体内产生的限制性内切酶靶向切割特定的DNA序列。
首先,需要将待切割的DNA序列和所需的限制性内切酶混合,然后在合适的反应条件下,产生酶促的DNA切割。
一般情况下,DNA序列和限制性内切酶在混合后会在较短的时间内结合。
最终,在适当的反应条件下,在目标DNA序列内,适当地刺激酶作用,就可以实现目标DNA序列的切割。
切割后的DNA分子可用于克隆、测序、PCR等一些基本的操作。
三、限制性内切酶技术在基因工程中应用非常广泛,主要包括以下几个方面。
1.基因克隆基因克隆是指把DNA片段插入到另一个DNA分子中的操作。
限制性内切酶可用于扩大DNA片段,甚至特定的目标序列,以便于克隆。
通过选择合适的限制性内切酶,将其切割需要被插入的DNA和载体DNA,就可以生成相应的克隆载体。
选择合适的限制性内切酶也可以帮助确认目标DNA的长度和结构,从而避免一些问题的出现。
2.PCR聚合酶链式反应(PCR)技术是基因工程实验中应用最为广泛的技术之一。
酶切回收实验报告(3篇)
第1篇实验日期:2023年X月X日实验地点:生物化学与分子生物学实验室实验目的:1. 掌握限制性核酸内切酶(限制酶)的酶切原理及其应用。
2. 学习并掌握DNA片段的酶切回收技术。
3. 熟悉琼脂糖凝胶电泳的操作流程及结果分析。
实验原理:限制性核酸内切酶是一种能够识别特定的DNA序列并在此位点切割双链DNA的酶。
在分子生物学研究中,限制酶被广泛应用于基因克隆、基因编辑等领域。
酶切回收技术是指利用限制酶切割DNA片段,然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,最后通过特定的方法将目的片段从凝胶中回收,以便进行后续的实验操作。
实验材料:1. DNA模板:质粒DNA或基因组DNA。
2. 限制性核酸内切酶:例如HindIII、EcoRI等。
3. 10×限制酶缓冲液。
4. dNTP混合物。
5. Taq DNA聚合酶。
6. 琼脂糖凝胶电泳试剂。
7. 紫外灯。
8. 琼脂糖凝胶回收试剂盒。
9. 实验器材:PCR仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机等。
实验步骤:1. DNA模板制备:- 将质粒DNA或基因组DNA进行PCR扩增,获得目的DNA片段。
- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测扩增结果。
2. 限制酶酶切:- 将PCR产物加入10×限制酶缓冲液,加入适量的限制酶。
- 在PCR仪上设置合适的温度和时间进行酶切反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳:- 将酶切后的DNA样品加入琼脂糖凝胶孔中,进行电泳分离。
- 使用凝胶成像系统观察电泳结果,确定目的片段的位置。
4. 酶切回收:- 根据电泳结果,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将目的片段从凝胶中回收。
- 将回收的DNA片段进行PCR扩增,检测回收结果。
5. 结果分析:- 根据PCR扩增结果,分析酶切回收的效果。
实验结果:1. DNA模板制备:- PCR扩增结果良好,获得目的DNA片段。
2. 限制酶酶切:- 酶切反应顺利进行,获得酶切片段。
3. 琼脂糖凝胶电泳:- 目的片段位于琼脂糖凝胶的特定位置。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全? 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯,反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大,取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低
应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异,只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外,还将含有lac操纵子起始部分的片段(包括启动子, 操作区,核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分) 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制,重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作:杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾:
1、定义: 1、定义:限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列,并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶,简称限制酶。 2、分类:
(根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性,将限制性内 切酶分为三种类型)
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释,增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟,取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
通过 使 用 ( 1 5 种 ) 限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质
粒,说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶
酶切图谱分析的方法o
方法:
1.质粒的构建
采用聚合酶链反应 chainreaction , PCR) 方法扩增出 MLCKcDNA 片段,插入质粒 pBKrsv 中,构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒 按 Maniatis 等方法进行。 2. 酶切、构建、片段的纯化和连接
质粒 DNA 浓度 (g/L)=AZ60Xቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ稀释度 /Z0=AZ60X5
6.重组质粒的限制性核酸内切酶酶切 取0.5ml离心管 1 5 只,分别加入质粒 2μl(2μg),依 次 加 入 限 制性内 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、
熔化后冷却至 60℃,加入3μL10g/l溴化乙锭,混匀,倒入插好梳子的模具中,凝固后放入电泳 槽中。电泳槽中加入1×TAE缓冲液。
8、电泳
取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀,进行琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下可观察
到橘红色DNA条带,结果如图
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.
切酶切割?
1. 内切酶失活
2.DNA 不 纯 , 含 有 SDS , 酚 ,
EDAT 等内切酶抑制因子 3. 条件不适(试剂、温度) 4.DNA 酶 切 位 点 上 的 碱 基 被 甲基化
菌菌株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA ,重新将质粒转至 dcm+,dam+ 菌株中扩增 6. 将 DNA 底物与 λ DNA 混匀进行切割验证 7. 换用其它 的酶切割 DNA 或过量 酶消化进行
在进行限制性内切酶实验时首先应进行 D N A 的 定 量 , 1 U 酶的限制性 内切酶活性指在一定时间内 ( 60min )~ 适当温度下和建议使用的缓冲液中 , 在 50 μl 反应体系中 , 将 1 μg 底物 D N A 完全消化所需要的酶量 l 单位活性依所 用底物的不同而不同 , 使用其他底物时 , 应根据情况确定所用酶量 l 根据 本实验室的经验 , 1 μg 底物 D N A 加入 5 U 的限制性内切酶在 2h 时间内可以 酶切完全,通常延长消化。
11. 加大酶量 5-10 倍
10. 反应条件不适
11. 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺 序
三 . 如 果 DNA 片段 数目 多于理论值?
解决方法
1. 其它内切酶污染
2. 底物中含其它 DNA 杂质
1. 用 λ DNA 作底物检查酶切结果 2. 电泳检查 DNA ,换用其它酶切 ,
纯化 DNA 片段
结果分析
限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得 的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向 ( orientation )l 在选 择限制性内切酶时 ,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒 序列中均含有的限制性内切酶酶切位点 ,这样可保证酶切片段大小能满
足进一步分析的需要。
例如:
几种限制性内切酶的切割位点
3、同工异源酶:来源不同但能识别和切割同一位 点的酶。如:BamHⅠ和BstⅠ,XhoⅠ和Pae R7 等可以相互代替使用。 4、同尾酶:识别序列不同,但产生相同末端的限 制性内切酶。如:BamHⅠ和Sau3AⅠ等由此产生 的DNA片段可借黏性末端相互连接,操作是具有更 大的灵活性。
Ⅱ型酶:是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链,所
以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。 Ⅲ型酶:与Ⅰ型酶一样,具有限制与修饰活性,其切割位点很难预测。 3、命名:
规则: 第一个字母(大写):取自该酶的细胞属名 第二、三个字母(小写):该细胞的种名 第四个字母(罗马数字):代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号 例如:EcoRⅠ、HindⅢ 等等
3. 重组质粒的转化
4. 重组质粒的提取 组质粒。
转化采用“热休克”法。
挑取阳性克隆,在 LB 培养基中培养,采用碱裂解法提取重
5. 定量 取 5 μLDNA 溶液用 4.5 μl去离子水稀释,用紫外分光光度计比色,读取 AZ60 和 AZ80 吸光度值,计算出 AZ60/AZ80 比值,按下列公式计算质粒 DNA 浓度 , 本 实验中质粒 DNA 浓度为 1.0g/L 。
限制性核酸内切酶的
应用
基因的定位和基因分离 DNA分子碱基序列分析 比较相关的DNA分子和遗传工程 用于DNA基因组物理图谱的组建
应用一
将水稻叶绿体的DNA,用EcoR1限制性核酸内切酶消化后, 放入含有溴化乙锭的低熔点(LMP)的1%琼脂糖凝胶中做电泳分 离。从LMP中分离出分子大小为1.8-2.5kb之间的DNA片段,再 与同样经过EcoR1限制性核制性内切酶切割并用碱性磷酸酶做了 脱磷酸化处理的pBR322质粒连接,然后将混合物转移到大肠杆 菌5346菌株,培养在氨苄青霉素选择板上,形成Ampr转化子菌 落群体。这样就构成了由EcoR 限制性核酸内切酶切割的水稻 DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的psbA DNA 探针做菌落杂交,可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性 克隆体中分离出来的重组体质粒DNA,经进一步的分析,就能测 出水稻叶绿体基因psbA的序列。
SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 应的 NEBuffer2μL、BSAμL、去离子水 13.5μL、 混匀、
点动离心,37 ℃ 水浴孵育2小时。
7、配置1.5%的琼脂糖凝胶 称取琼脂糖0.6g,加入 1XTAE 缓 冲 液 40 ml置 微 波 炉 中,中 火120s,
{
Ⅰ型酶:具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割 DNA。 Ⅱ型酶:是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异 位点识别和切割DNA双链,所 以通常所说的限制 性内切酶就指这一类酶。 Ⅲ型酶:与Ⅰ型酶一样,具有限制与修饰活性,其切 割位点很难预测
Ⅰ型酶:具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶: 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于 ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割 某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别 序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列,产生5'或3'黏性末端(也有一些产生平端或钝端)
实验中可能出现的 问题及其讨论
一 . 如 果 DNA 完 全 没 有 被 内
解决方法 1. 标准底物检测酶活性 2. 将 DNA 过柱纯化,乙醇沉淀 DNA 3. 检查反应系统是否最佳 4. 换用对 DNA 甲基化 不敏感的同 类酶酶解 , 重新将质粒 DNA 转化至 dcm-,dam- 基因型的细
结果
重组质粒 pBKrsv-MLCK 全长 7378bp , 通过
DNAstar 软件分析获得各酶酶切位点的信息 ,
选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质
粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,计 算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切 酶酶切后,获得不同大小的片段,经电泳分析 与理论设计完全一致。