基因工程第四章目的基因的分离和合成
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只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化 所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到 目的基因的克隆。
2. 对已知定位的目的基因
只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次 即可获得目的基因。
第一节 限制酶直接分离
二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核
生物基因的制备 采用鸟枪法（shot gun）：
1. 从细菌细胞中分离细菌染色体 2. 用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段 3. 用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体
细胞 4.百度文库转化子的选择
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控
第二节 建立基因组文库
基因文库的完备性
基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率
f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
载体和受体的选择
基因文库的构建程序
第四章 目的基因的分离与合成
通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为 “外源基因”
将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特 定基因或DNA片段，称为“目的基因”。
获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物， 另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功 能的研究
第四章 目的基因的分离与合成
鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图 谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染 色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整 性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进
在连接前将DNA片段进行分级分离
第二节 建立基因组文库
基因文库的基本概念
基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段
基因文库的构建程序
基因组DNA的切割
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一
基因文库的构建程序
基因组DNA的制备
为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组
文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体
A
A
DNA的长度一般在100 kb左右
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的
SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，
琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相 当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶
2.0 kb 1.6 kb
块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后
与载体进行拼接
1.8 kb
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
获得目的基因的方法： 1. 限制酶直接分离 2. 从基因组文库中筛选 3. 逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选 4. 人工合成 5. PCR扩增 6. 基因改造
第四章 目的基因的分离与合成
第一节 限制酶直接分离
一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基
因的制备
1. 对已定序列的DNA分子
第二节 建立基因组文库
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载
体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
2. 对已知定位的目的基因
只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次 即可获得目的基因。
第一节 限制酶直接分离
二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核
生物基因的制备 采用鸟枪法（shot gun）：
1. 从细菌细胞中分离细菌染色体 2. 用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段 3. 用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体
细胞 4.百度文库转化子的选择
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控
第二节 建立基因组文库
基因文库的完备性
基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率
f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
载体和受体的选择
基因文库的构建程序
第四章 目的基因的分离与合成
通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为 “外源基因”
将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特 定基因或DNA片段，称为“目的基因”。
获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物， 另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功 能的研究
第四章 目的基因的分离与合成
鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图 谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染 色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整 性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进
在连接前将DNA片段进行分级分离
第二节 建立基因组文库
基因文库的基本概念
基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段
基因文库的构建程序
基因组DNA的切割
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一
基因文库的构建程序
基因组DNA的制备
为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组
文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体
A
A
DNA的长度一般在100 kb左右
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的
SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，
琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相 当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶
2.0 kb 1.6 kb
块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后
与载体进行拼接
1.8 kb
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
获得目的基因的方法： 1. 限制酶直接分离 2. 从基因组文库中筛选 3. 逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选 4. 人工合成 5. PCR扩增 6. 基因改造
第四章 目的基因的分离与合成
第一节 限制酶直接分离
一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基
因的制备
1. 对已定序列的DNA分子
第二节 建立基因组文库
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载
体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）