基因工程第四章目的基因的分离和合成
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
目的基因的分离方法
目的基因的分离方法摘要：介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。
总结了基因分离中的各种方法，主要有：直接酶切分离法，化学合成法，序列克隆法，功能克隆法，作图克隆法，表型差异克隆法，计算机辅助分离法等，并对其特点和适用范围进行了简单评述。
关键词：目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的，包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。
每种方法运用这些特性的一种或者多种，产生了各种各样的分离方法。
这些方法又相互之间组合，从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。
1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因，而不适用于单拷贝基因。
并且所得到的目的基因纯度较低。
但是操作简单，对设备的依赖性很低，即使在很简陋的实验室里也能完成操作。
2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，然后按照DNA碱基序列顺序，先合成DNA短片段，再通过DNA连接酶作用，将这些短片段依次连接成一个完整的基因。
人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因，而且，所合成的是单基因，无其它有害基因，比较完整；缺点是只适用于较短的基因，操作比较难，费用也比较大。
目前这种方法主要用于PCR引物的合成，一些突变基因的合成等。
3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3．1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时，通常采用PCR的方法来克隆基因。
基本原理和方法是：利用已知目的基因的序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链)，然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。
扩增的片段经过纯化后，连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子，并与已知基因的序列进行比较，来进行鉴定。
鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
厦门大学基因工程课后思考题
第一章核酸的制备1.名词解释：脱氧核糖核酸：核糖核酸：ccc-DNA：当两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA（cccDNA）oc-DNA：如果两条核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA）l-DNA,：发生双链断裂而形成线性分子（L—DNA），L构型DNA变性：双联变成单链DNA复性：单链又变成双链PCR, 模板，引物2.分别阐述用CTAB裂解法，SDS裂解法，碘化钠裂解法以及蛋白酶K裂解法和溶菌酶裂解法裂解细胞的依据。
溶菌酶：破坏细胞的细胞壁肽聚糖骨架，在内部渗透压的作用下使得细胞胀破。
CTAB裂解法：CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚SDS裂解法：利用中性去污剂NP-40破坏全血的红细胞膜，离心弃去溶血液，收集白细胞沉淀，加入去污剂SDS以破坏白细胞核膜，并使核蛋白解离，再加入高浓度的NaCl使DNA溶解，同时使蛋白盐析。
通过离心收集水相，加2——2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA碘化钠裂解法：低渗破坏细胞，碘化钠破坏核膜蛋白酶K裂解法：蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解3.用于检测样品纯度和浓度的方法有哪些？简述个各方法的基本原理。
电泳、OD值、荧光定量法第二章基因工程工具酶1.名词解释：限制性内切核酸酶：在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA•裂口连接起来逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶DNA聚合酶：是一类催化DNA合成的酶类，酶的作用需要DNA或RNA作为模板，合成DNA链的序列与模板的序列互补Klenow片段（Klenow酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow 酶限制性图谱（物理图谱）：描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱，通常以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。
第四章 目的基因的获得-PCR
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
4. 1个循环的结果
5. 新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
DNA elongation
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 亚磷酸三酯法 原理
将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH
与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接， 然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使 用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具 体的合成和延伸过程如图。
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所 要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
模板
ACGTACGTA 5’
3. DNA链的延伸
72 oC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
(d)
3’
3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
（四）PCR的特点
第四章基因工程制药
3.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制
4.基因工程技术的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transfer vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,---- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell ----glycoprotein
5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测 序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）
二、化学合成法
较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成 法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基 因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
10mM Tris 1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使
oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。
3、cDNA第二链的合成：
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
基因工程的基本过程
基因工程的基本过程基因工程主要包括几个过程：1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子；3、将重组DNA片段导入受体；4、选择目的基因；5、目的基因的表达。
对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。
很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。
如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤：图10-3-8 基因工程过程(1)目的基因的分离和制备目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。
获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。
目前获得目的基因有4条途径：1.从生物基因组群体中分离目的基因原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。
真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。
图10-3-1 限制性内切酶限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。
例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。
也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。
多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。
限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。
限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。
这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。
基因工程第四章目的基因的分离和合成
基因的分离方法
电泳分离
利用电场的作用，通过基因的大小和电荷差 异来分离目的基因。
过滤膜分离
利用过滤膜的孔隙大小，将目的基因与其他 分子分离。
基因的合成方法
1
Байду номын сангаас
基因合成的步骤
2
包括设计基因序列、合成基因、验证
基因等步骤。
3
基因合成的原理
利用化学合成的方法合成目的基因的 DNA序列。
基因合成的应用
用于基因工程研究、生物医药和农业 领域，推动科学发展。
实验步骤
1. 收集目的基因样本 2. 提取目的基因DNA 3. 分离目的基因 4. 合成目的基因 5. 验证合成的目的基因 6. 分析实验结果
结果与讨论
实验结果表明电泳分离和过滤膜分离是有效的基因分离方法，基因合成技术 可用于合成目的基因。讨论了实验过程中的优缺点和改进方法。
结论和展望
基因工程中的目的基因的分离和合成方法有重要的应用价值，未来可以进一 步优化分离和合成技术，提高实验效率和基因合成的准确性。
基因工程第四章目的基因 的分离和合成
本章介绍了基因工程中的目的基因的分离和合成方法，包括电泳分离和过滤 膜分离，以及基因合成的原理、步骤和应用。
实验目的
1 了解基因工程的目的基因
明确在基因工程中需要分离和合成的目的基因。
2 掌握基因的分离和合成方法
学习电泳分离、过滤膜分离和基因合成的原理和步骤。
3 了解基因合成的应用
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
基因工程原理与技术复习题
《基因工程原理与技术》复习题第一章绪论一、名词解释·基因工程技术：以分子生物学、分子遗传学和生物化学等学科为基础，在分子水平对基因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状，并且能够稳定遗传的一种技术。
·性状：是指生物体所表现的形态结构、生理生化特性、细胞形态或动态过程、解剖构造、器官功能或精神特性、和行为方式等的统称。
·基因：核酸中储存遗传信息的遗传单位，也是储存有功能的蛋白质多肽链或功能RNA序列信息以及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。
·基因表达：基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子或功能性RNA的过程。
二、简答题1．什么是基因工程技术？请简要描述基因工程技术的基本操作步骤。
答：基因工程技术是指以分子生物学、分子遗传学和生物化学等学科为基础，在分子水平对基因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状，并且能够稳定遗传的一种技术。
广义的基因工程技术是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分，狭义的基因工程是指上游技术。
基因工程技术基本操作步骤：①分离目的基因②将载体与目的基因进行限制性酶切③将外源基因与载体连接起来④重组后的载体转化受体菌⑤转化后对重组子的筛选⑥使外源基因在宿主体内稳定遗传表达2. 请分别描述原核生物和真核生物基因的结构特征。
答：原核生物基因：基因组较小，具有操纵子结构，基因密度高，结构基因中无内含子结构，多为单拷贝，遗传物质载体内部不形成细胞核结构，基因转录产物为多顺反子。
真核生物基因：DNA与蛋白质相结合形成染色体储存在细胞核中，基因转录产物为单顺反子，存在大量的重复序列，基因并不连续，存在内含子结构三、论述题1、什么是基因工程技术？试从理论和技术两个方面谈谈基因工程诞生的基础，并结合基因工程在生物技术中的地位，谈谈基因工程在生物产业中的重要性及发展前景？答：基因工程技术是指以分子生物学、分子遗传学和生物化学等学科为基础，在分子水平对基因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状，并且能够稳定遗传的一种技术。
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例如，已知某目的基因位于1.8 kb的
SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，
琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相 当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶
2.0 kb 1.6 kb
块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后
与载体进行拼接
1.8 kb
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段基因的构建程序基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DN物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因ot gun）：
1. 从细菌细胞中分离细菌染色体 2. 用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段 3. 用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体
细胞 4. 转化子的选择
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控
获得目的基因的方法 6. 基因改造
第四章 目的基因的分离与合成
第一节 限制酶直接分离
一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基
因的制备
1. 对已定序列的DNA分子
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一与合成
通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为 “外源基因”
将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特 定基因或DNA片段，称为“目的基因”。
获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物， 另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功 能的研究
第四章 目的基所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体Dol） 特定生物体全基因组的Fra bibliotek合（天然存在）
基因（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化 所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到 目的基因的克隆。
2. 对已知定位的目的基因
只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次 即可获得目的基因。
第一节 限制酶直接分离
二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核
鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图 谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染 色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整 性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进
在连接前将DNA片段进行分级分离
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载
体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）基因的基本概念基因的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因的构建程序基因组DNA的制备
为了最大限度地保证基因在度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体
A
A
DNA的长度一般在100 kb左右