流式细胞实验步骤

具体实验步骤如下：

1、把待用的培养基和PBS提前30min放在37℃预热。

2、取细胞长满的T25瓶两个，先用PBS清洗两遍，然后胰蛋白酶

消化，待细胞变圆，吸出消化液，每瓶各加入5ml的完全培养基，把细胞重悬计数，把细胞浓度调到5*105-1*106之间。

3、取30个塑料小皿，每皿铺细胞量为2.5*105个，待细胞长到

80%-90%的时候，用PBS清洗2遍，加入适量的PBS使细胞保持生理状态，进行紫外线处理。

4、吸出PBS加入OPT-i培养基900ul，加入HBDps100ul，37℃孵育

4h（把HBDps浓缩至3mg/ml）。

5、PBS清洗2遍，每孔150ul的胰蛋白酶消化，待细胞变圆加入完

全培养基500ul，PBS 500ul把细胞重悬置于1.5ml的EP管中做好标记，2000rpm离心10min，再用PBS清洗两次。

6、弃去上清加入300ul终浓度为10uM的探针DCFH-DA避光孵育

30min

7、2000rpm离心10min去除上清，再用PBS清洗3次，最后用400ul

重悬PBS，200目的纱布过滤，然后上样。

8、分析数据。