流式细胞实验步骤

流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验⽅法流式细胞仪实验⽅法⼀、实验准备1．标本制备：2.最⼩化⾮特异性结合：⼆、凋亡1．凋亡的检测⽅法：⽹站和其它2．PI染⾊法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因⼦1．激活的细胞因⼦2．CBA四、⾎⼩板1．活化2．活化检测3．⽹织⾎⼩板五、红细胞1．⽹织红细胞2．PNH3．胎⼉红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋⽩3．多药耐药4．微⼩残留⽩⾎病第⼀部分标本处理⼀、流式细胞术常规检测时的样品制备(⼀)直接免疫荧光标记法取⼀定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每⼀管中分别加⼊50µl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加⼊连接有荧光素的抗体进⾏免疫标记反应(如做双标或多标染⾊，可把⼏种标记有不同荧光素的抗体同时加⼊)，。

孵育20-60分钟后，⽤PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加⼊缓冲液重悬，上机检测。

本⽅法操作简便，结果准确，易于分析，适⽤于同⼀细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较⾼，但减少了间接标记法中较强的⾮特异荧光的⼲扰，因此更适⽤于临床标本的检测。

(⼆)间接免疫荧光标记法取⼀定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加⼊特异的第⼀抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加⼊荧光标记的第⼆抗体，⽣成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本⽅法费⽤较低，⼆抗应⽤⼴泛，多⽤于科研标本的检测。

但由于⼆抗⼀般为多克隆抗体，特异性较差，⾮特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加⼊阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适⽤测定细胞数较少的标本。

⼆、最⼩化⾮特异性结合的⽅法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过⾼，背景会因为⾮特异性的相互作⽤的增加⽽增加。

2．在使⽤第⼀抗体之前，将样品与过量的蛋⽩⼀起培育，如⼩⽜⾎清蛋⽩（BSA），脱脂⼲奶酪，或来⾃于同⼀寄主的正常⾎清来作为标记的第⼆抗体。

流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。

以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。

用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。

离心，弃上清。

4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

ros检测流式步骤

ROS（Reactive Oxygen Species）检测流式细胞术是一种用于检测细胞内活性氧水平的技术。

以下是一般的 ROS 检测流式细胞术的步骤：
1. 准备细胞样本：将需要检测的细胞培养至适当的密度，并收集细胞悬液。

2. 处理细胞：将细胞悬液与适当的荧光染料（如 DCFH-DA、H2DCFDA 等）一起孵育，这些染料可以被 ROS 氧化并产生荧光。

3. 孵育：将细胞与染料在合适的条件下孵育一段时间，使染料能够进入细胞并与 ROS 反应。

4. 洗涤：孵育结束后，用缓冲液或培养基洗涤细胞，以去除未结合的染料。

5. 流式细胞仪分析：将处理后的细胞悬液加载到流式细胞仪上，通过激发荧光染料并检测荧光信号，从而确定细胞内 ROS 的水平。

6. 数据分析：使用流式细胞仪软件分析荧光信号，根据荧光强度的差异来区分不同水平的 ROS。

需要注意的是，具体的操作步骤可能因所使用的荧光染料、细胞类型和实验条件而有所不同。

在进行 ROS 检测流式细胞术时，建议根据实验需求和参考相关文献来选择合适的方法和条件。

流式分选细胞培养步骤

流式分选细胞培养步骤
1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；
2.写编号纸并编号；
3.取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液；
4.刺激：取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640进行稀释一倍，加入刺激剂PMA，离子霉素和BFA，混匀。

最后在全血中的终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1g/mlBFA：10g/ml；
5.37℃，5% CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖) ；
6.胞外染色：各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀，室温避光20分钟；
7.溶血：每管加入溶血素2ml，室温避光10分钟。

离心，1200转，5分钟。

弃上清；
8.破膜通透：每管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。

加入2mlPBS，1000转，离心5分钟。

弃上清；
9.胞内染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l，混匀，室温避光30分钟。

加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃上清；
10.加入PBS 500l。

上机前4度保存；
11.上机检测。

整理)流式细胞检测细胞周期

流式细胞检测细胞周期一、所需试剂1、细胞周期检测试剂盒（1）PI：Propidium Iodide，碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，如果自己买，那就10mg用200mlPBS 溶解，4℃避光保存（0.05mg/ml）（2）RNAase：PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解，如果自己买，那就100mg用20mlPBS溶解，200μl分装-20℃避光保存（5mg/ml）2、预冷70%-75%酒精：可用无水乙醇和纯水配制3、预冷PBS4、流式管：可以去医研中心拿二、实验步骤<一>、细胞处理1、种板处理等同功能实验（保证细胞有2-5×10*5个）2、消化细胞，离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。

3、用预冷的PBS清洗细胞1-2次。

4、离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀5、固定细胞：用0.2ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入2ml预冷70-75%酒精，震荡，4℃固定过夜。

（直接向细胞加入酒精容易使细胞成团，震荡不要过猛，容易使细胞破碎）<二>、细胞染色和检测1、离心（1000r/300g 5min）收集固定的细胞2、2mL的预冷PBS洗细胞一次，离心再次获取细胞沉淀3、染色：加入50μlRNA酶和250μl-450μl PI染色剂（用量根据试剂盒说明书），避光染色5-10min（一般加300μl，保证适当细胞浓度，浓度太高检测速度太快，结果不准；浓度太低检测速度太慢，时间太长）4、上机检测三、注意事项1、流式细胞仪原理看ppt非荧光信号（1）前向角散射光（FSC Forward scatter）细胞相对大小及其表面积（2）侧向角散射光（SSC side scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性2、PI(碘化丙啶)不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

流式细胞术实验报告

一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。

通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。

二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。

其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。

最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。

- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。

- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。

2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。

- 收集数据，进行细胞分类和分析。

3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。

五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。

2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。

3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。

bdfacsverse流式细胞仪实验流程开机→质控（pqc）→实验→数据

BD FACSVerse流式细胞仪实验流程开机→质控(PQC)→实验→数据处理→清洗→关机使用者在操作BD FACSVerse流式细胞仪实验时，务必按照以上流程进行，方可保证实验数据的准确性和仪器状态良好，除数据处理外不可随意缺失任一步骤。

实验者所需准备的用品：1、流式上样管若干；2、1000μL加样枪一支、枪头若干；3、40μm细胞筛网。

仪器平台提供以下用品：1、鞘液；2、Clean洗液；3、去离子水；5、CS&T微球。

开机步骤1.开机前先将上样管取下2.清空废液桶Waste，鞘液筒Sheath内装FACSFlow鞘液至三分之二体积3.打开流式细胞仪右后侧的白色电源开关，仪器进行自检并预热，约需20min，完成后仪器状态灯显示绿色4.打开电脑，双击桌面FACSuite软件图标，输入用户名和密码，密码为bdadministrator，点击OK后进入5.软件主窗口左下角的联机状态显示为Connected（绿色），显示电脑已与仪器联机仪器质控Performance QC流程，每天一次1.配制微球：取一只流式管加入500ul FACSFlow鞘液，加2滴CS&T微球。

注意：滴加微球时不要滴在壁上，微球使用前要摇匀2.点击软件界面左边的快捷启动键“Setup & QC”图标；3.在Tube里选择Performance QC4.选择正确的CS&T Bead Lot ID；5.点击Start按钮，进样管处放置准备好的CS&T微球，点击continue；6.取下CS&T微球，放置装DI水的流式管；点击Yes，查看质控报告。

清洗步骤1.所有实验结束后，选择Cytometry > Daily Clean命令，进样管加入2mL FACSClean洗液，点击Continue；2.冲洗后，按照仪器提示，另一进样管加入3mL去离子水，点击Continue，等待仪器清洗完毕；备注：（一）清洗时所用清洗液和去离子水务必置于两支不同的干净上样管中，且清洗液的体积不得多于去离子水的体积。

流式细胞仪常用技术方法)

流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析（PI法）一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min；8.用300目滤网过滤，上机检测。

细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1四、实验步骤1. 将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。

流式细胞方法测定

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞操作步骤

流式细胞操作步骤：
1.制备脾细胞悬液1 107/ml
2.每个流式管（即样品）放入100ul 细胞悬液
3.每个样品中加入2ul CD4及5ul CD5 ，避光孵育30分钟
4.洗涤：每个样品中加入2ml的流式缓冲液，1200rpm下离心7分
钟，弃上清后漩涡混匀，再重复洗涤一次，共两次
5.每个样品中加入1ml Foxp3 固定/渗透液，混匀后4℃过夜
6.每个样品中加入2ml流式缓冲液
7.室温下1200rpm离心（400g×5min），弃上清
8.重复步骤（6），（7）
9.每个样品中加入小鼠血清2ul，室温下孵育15分钟
10.每个样品中加入2.5ul的Foxp3抗体，室温下孵育30分钟，并用
PE Rat IgG2a在平行管中空白对照
11.每个样品中加入2ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心（400g×
5min），弃上清
12.重复步骤（11）
13.每个样品中加400ul流式缓冲液，上机。

细胞免疫流式实验报告

细胞免疫流式实验报告1. 引言细胞免疫流式实验是一种常用的分析细胞表面标记物和内表达物的方法。

该实验通过结合细胞免疫学和流式细胞术的原理，能够快速准确地对细胞进行分类、定量和表型描述。

本实验旨在研究不同细胞表面标记物的表达情况，从而深入了解细胞免疫功能。

2. 实验材料和方法2.1 实验材料- 人外周血单个核细胞（PBMCs）- 流式细胞仪- 一系列细胞表面标记物的单克隆抗体- 细胞培养基- 离心管- 生理盐水- PBS缓冲溶液- 表面标记物的荧光染料2.2 实验步骤1. 采集人外周血，分离PBMCs；2. 使用生理盐水洗涤PBMCs，并离心沉淀细胞；3. 用PBS缓冲溶液漂洗细胞，并离心沉淀；4. 重新悬浮细胞，根据实验设计将细胞分为不同的实验组和对照组；5. 按照实验需求，添加特定荧光染料标记细胞表面标记物；6. 在流式细胞仪上设置相应参数进行数据采集和分析；7. 对数据进行统计学处理和结果分析。

3. 实验结果在本次实验中，我们使用了一系列具有特定细胞表面标记物的单克隆抗体和相应的荧光染料。

我们成功地对PBMCs中的不同细胞类型进行了表型鉴定和数量统计。

通过流式细胞仪的数据采集和分析，我们得到了不同细胞表面标记物的表达情况。

例如，CD3标记物用于鉴定T细胞的表型和数量，CD19标记物用于鉴定B细胞，CD14标记物用于鉴定单核细胞，等等。

通过统计学处理，我们得到了不同细胞种类的百分比和细胞数量。

4. 结果分析根据实验结果，我们可以看到PBMCs中的T细胞、B细胞和单核细胞的百分比分别为65%、20%和15%。

其中，CD4阳性细胞占T细胞总数的70%，CD8阳性细胞占T细胞总数的30%。

此外，CD14阳性细胞占单核细胞总数的80%。

这些结果表明，在正常外周血中，T细胞是最主要的细胞类型，而B细胞和单核细胞的数量相对较少。

此外，我们还发现在某些疾病状态下，特定细胞表面标记物的表达情况会发生改变。

通过与对照组的比较，我们可以进一步了解细胞免疫功能的变化，从而为疾病的诊断和治疗提供参考。

流式细胞仪实验流程

流式细胞仪实验流程英文回答：Flow cytometry is a powerful technique used to analyze and quantify various characteristics of cells. It allowsfor the simultaneous analysis of multiple parameters, such as cell size, granularity, and the expression of specific proteins or markers on the cell surface. In this response, I will outline the general workflow of a flow cytometry experiment.1. Sample preparation: The first step in a flow cytometry experiment is to prepare the sample. This involves obtaining a single-cell suspension from the tissue or cell culture and ensuring that the cells are in asingle-cell form without clumps. This can be achieved by enzymatic or mechanical dissociation, depending on the cell type. The cells are then washed and resuspended in a buffer solution.2. Staining: To analyze specific characteristics of the cells, fluorescent dyes or antibodies are used to label the cells. These labels can target specific proteins or markers of interest. For example, if we want to analyze the expression of a particular surface marker on immune cells, we can use a fluorescently labeled antibody that binds specifically to that marker. The cells are incubated with the fluorescent labels, allowing the antibodies to bind to their targets.3. Instrument setup: Once the cells are stained, the next step is to set up the flow cytometer. This involves calibrating the instrument using fluorescent beads of known size and intensity. The laser(s) and detectors are adjusted to ensure optimal detection and resolution of the labeled cells.4. Data acquisition: With the instrument properly set up, the sample is loaded into the flow cytometer. The cells are passed through a flow cell one at a time, and as they pass through a laser beam, the fluorochromes on the cells emit light. The emitted light is then detected by thecorresponding detectors, and the signal is converted into electronic data. This data includes information about the fluorescence intensity and scatter properties of each individual cell.5. Data analysis: After data acquisition, the collected data needs to be analyzed. Flow cytometry software is used to analyze the data and generate graphical representations. Various parameters can be measured, such as the percentage of cells positive for a specific marker, the mean fluorescence intensity, or the cell cycle distribution. Statistical analyses can also be performed to compare different samples or conditions.6. Interpretation: The final step is to interpret the results obtained from the flow cytometry experiment. This involves comparing the data to control samples or previous experiments and drawing conclusions based on the findings. For example, if the percentage of cells positive for a specific marker is higher in a disease sample compared to a healthy control, it may indicate an abnormality or disease state.Overall, flow cytometry is a versatile technique that allows for the analysis of various cellular characteristics. It provides valuable information about cell populations and can be used in a wide range of research areas, such as immunology, cancer biology, and stem cell research.中文回答：流式细胞仪是一种用于分析和定量细胞特征的强大技术。

流式细胞术操作步骤

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

流式步骤

流式步骤
1.取肠系膜淋巴结及脾脏：颈椎脱臼处死小鼠后，腹部朝上固定于泡沫板上，喷少量酒精后打开腹腔，沿盲肠向上寻找淋巴结，取下淋巴结及脾脏放入预冷PBS。

2.提取组织细胞：将淋巴结及脾脏分别在细胞过滤器上均匀研磨，用预冷PBS缓慢冲洗研磨后组织，获得细胞悬液，脾脏细胞悬液中加入1ml红细胞裂解液，裂解5min,将细胞悬液离心，1500rpm,5min。

倒掉上清，加入PBS轻柔洗涤两次，离心后获得细胞。

3.刺激：将获得的细胞加入预冷的细胞培养基混匀后放置在6孔板上，加入MIX、PLUG及STOP，混匀后，放入37℃细胞培养箱6h。

4.收集细胞：取出6孔板后轻轻吹打几次细胞，将LN细胞及脾脏细胞吸到流式管中，取脾脏细胞时小心吹打，勿将底层贴壁的巨噬细胞纤维细胞吸入流式管，离心1500rpm,5min。

加入预冷的PBS轻柔洗涤细胞一次，离心1500rpm,5min，倒掉上清。

5.上机：避光加入细胞表面荧光抗体（CD3、CD4），室温孵育30min,加入PBS洗涤一次，甲醛固定，加入破膜液混匀，冰上30min，PBS 洗涤两次，500rpm,5min。

加缓冲液重悬，然后避光加入胞内INF-γ等的荧光抗体及同型，4℃过夜，加入FACS Buffer上机。

流式细胞实验步骤
流式细胞实验是一种广泛应用于生物学研究的技术，可以用来分离和分析细胞群体中的不同亚群。

以下是流式细胞实验的步骤：
1. 细胞样品准备：将需要分离和分析的细胞样品收集到离心管中，并用生理盐水或PBS洗涤细胞，去除细胞表面的杂质。

2. 细胞染色：将细胞样品加入合适的染色液中，使细胞表面标
记上某种荧光标记物，以便后续流式细胞仪中的激光能够识别和测量。

3. 流式细胞仪操作：将染色后的细胞样品加入流式细胞仪中，
仪器会将细胞一一通过激光束，测量细胞的各种特征（比如大小、形状、荧光强度等），并将数据记录下来。

4. 数据分析：将流式细胞仪得到的数据导出，使用特定的软件
对数据进行分析和绘图，识别和分类不同细胞亚群，并对其数量和特征进行统计和比较。

以上是流式细胞实验的主要步骤，不同的实验目的和细胞类型可能需要进行一些额外的优化和操作。

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流式细胞血清封闭步骤

流式细胞血清封闭步骤
流式细胞血清封闭步骤是一种常见的细胞实验操作，主要包括以下几个步骤：
1. 细胞培养
在进行流式细胞血清封闭前，需要对所需细胞进行培养。

细胞的培养条件包括培养基的选择、培养温度、CO2浓度等，需要根据不同细胞类型进行调整。

2. 细胞收集和洗涤
将培养好的细胞进行收集和洗涤。

收集的方式可以是离心、剪切或使用解离酶等方法，洗涤时需要使用含有血清的培养基来缓解细胞的压力。

3. 细胞计数
使用细胞计数仪来确定收集到的细胞数量和浓度，以便后续操作中确定实验条件。

4. 细胞处理
将需要封闭的细胞加入含有血清的培养基中，使其能够有效地进行封闭操作。

5. 血清封闭
使用所需的抗体和其他试剂来对细胞进行血清封闭。

关于选择抗体种
类和浓度等细节，需要根据实验的具体设计和细胞类型进行调整。

6. 细胞培养和分离
将处理好的细胞重新加入含有血清的培养基中，以便进行后续的实验
操作。

如果需要进行单细胞分离等操作，需要使用特定的工具和技术
来实现。

总之，流式细胞血清封闭步骤需要仔细地进行计划和操作。

只有在细
胞培养、收集、处理、封闭和分离等环节上都做好充分的准备和操作，才能获得准确、可靠的实验结果。

流式细胞染色步骤

流式细胞染色步骤一、流式细胞染色的概念和意义流式细胞染色是一种通过荧光标记物来对细胞进行检测和分析的技术。

该技术可以用来研究细胞表面分子、内部结构和功能等方面，对于诊断疾病、筛查药物、研究免疫学和癌症等领域都具有重要的应用价值。

二、流式细胞染色的基本步骤1. 细胞样品的处理：将待检测的细胞样品经过处理后变成单个细胞悬液状态，以便于流式细胞仪进行检测。

2. 细胞染色：将荧光标记物与待检测的细胞样品进行反应，使其产生荧光信号。

3. 流式细胞仪检测：将经过染色后的单个细胞悬液注入到流式细胞仪中，利用仪器中激光器产生的光线对标记物进行激发，并通过检测器来收集产生的荧光信号。

4. 数据分析：对采集到的数据进行分析，得出相应结果。

三、详解流式细胞染色的步骤1. 细胞样品的处理细胞样品的处理是流式细胞染色中非常重要的一步，它可以影响到后续步骤中数据的准确性和稳定性。

一般来说，可以采用以下方法处理细胞样品：（1）消化酶分离法：将组织切成小块后加入消化酶进行消化，使其变成单个细胞悬液状态。

（2）机械分离法：通过机械手段将组织碾碎、刮下或振荡等方式使其变成单个细胞悬液状态。

（3）冷冻解冻法：将组织或细胞经过低温冷冻后解冻，使其变成单个细胞悬液状态。

2. 细胞染色在流式细胞染色中，荧光标记物是非常重要的一环。

荧光标记物可以与待检测的分子特异性结合，以便于在流式仪器中检测到。

一般来说，可以采用以下方法进行染色：（1）直接染色法：将荧光标记物直接加入到待检测的单个细胞悬液中，使其与目标分子结合。

（2）间接染色法：通过抗体的特异性识别，将荧光标记物与待检测的分子结合。

3. 流式细胞仪检测流式细胞仪是一种高级的仪器设备，能够对单个细胞进行多参数检测。

在流式细胞染色中，经过染色后的单个细胞悬液会被注入到流式仪器中进行检测。

流式仪器会利用激光器产生的光线对标记物进行激发，并通过检测器来收集产生的荧光信号。

一般来说，可以采用以下步骤进行流式仪器的设置和调整：（1）选择合适的波长：根据荧光标记物的特性和激发波长选择适当的波长。

流式细胞实验流程

流式细胞实验流程
一、样本准备
1.细胞培养
（1）选择合适培养基
（2）细胞传代
2.样本处理
（1）收集细胞样本
（2）处理待测样本
二、细胞染色
1.细胞固定
（1）使用固定液处理细胞
（2）冷冻保存待测样本
2.细胞染色
（1）选择染色试剂
（2）染色处理细胞
三、流式细胞仪设置
1.仪器预热
（1）启动流式细胞仪
（2）设定温度稳定时间2.参数设定
（1）设定激光参数（2）确定流速和压力
四、数据采集
1.样本输入
（1）调试样本进样器（2）将处理样本输入2.数据采集
（1）启动数据采集程序（2）确认数据传输完整
五、数据分析
1.数据导出
（1）保存原始数据文件（2）导出数据文件
2.数据解读
（1）进行数据统计分析（2）进行结果解读六、结果报告
1.报告撰写
（1）编写实验报告
（2）结果图表制作
2.结果讨论
（1）分析结果与文献比对（2）讨论实验结论。