临床医学检验基础知识讲解：斑点免疫层析试验原理
免疫层析法检测原理分类介绍
免疫层析法检测原理分类介绍免疫层析法是一种常用的免疫学测定手段，通过血清免疫反应和生物化学技术的结合，可以快速、敏感地检测特定物质的存在与水平。
免疫层析法根据不同的检测原理可以分为多种类型，下面将对常见的几种免疫层析法原理进行分类介绍。
1.竞争型免疫层析法竞争型免疫层析法是一种常用的免疫层析法，其原理基于抗体对抗原的结合竞争关系。
在竞争型免疫层析法中，通常将抗原标记在固定相上，待测样品中的特定抗原与固定相上标记的抗原竞争结合抗体。
这样，样品中的抗原与标记物竞争结合抗体，通过可视化或者仪器测定标记物的存在与水平来判断样品中的目标物质。
2.夹心型免疫层析法夹心型免疫层析法是一种常用的免疫层析法，其原理基于抗原与抗体的特异结合。
在夹心型免疫层析法中，通常将特定抗原固定在固定相上，待测样品与标记的抗体在该抗原上竞争结合。
样品中的抗原与标记的抗体的竞争结合通过可视化或者仪器测定标记物的存在与水平来判断样品中的目标物质。
3.单抗免疫层析法单抗免疫层析法是一种通过单克隆抗体进行检测的免疫层析法。
单抗免疫层析法拥有高度特异性和敏感性，通常可以用于检测非常低浓度的目标物质。
其原理和基本步骤类似于竞争型或夹心型免疫层析法，主要区别在于用于检测的抗体是经过单克隆化处理的。
4.荧光免疫层析法荧光免疫层析法是一种通过荧光标记物进行检测的免疫层析法。
其原理和基本步骤类似于竞争型或夹心型免疫层析法，主要区别在于标记物不同。
荧光标记物具有较高的敏感性，并且可以通过仪器进行定量测定。
因此，荧光免疫层析法通常用于对目标物质进行定量检测。
5.滴定型免疫层析法滴定型免疫层析法是一种通过滴定反应进行检测的免疫层析法。
滴定型免疫层析法能够通过滴定法测定目标物质的含量，常用于检测待测样品中目标物的浓度。
滴定型免疫层析法的原理是待测样品中的目标物质与滴定试剂反应生成可滴定物种，通过滴定法判断目标物质的存在与水平。
以上是常见的几种免疫层析法的原理分类介绍。
荧光免疫层析技术的原理与进展
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谢谢！
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料。—— UCP( up-converting phosphor，UCP) 颗粒。
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• UCP 颗粒主要含有如 A3 下三种成分:
• 主基质：氧硫化物
（Y2O2S,GdO2S）、
氟化物(YF3,GdF3）、 S2
A2
硅酸盐
(YSi2O5,YSi3O7）...
• 吸收子Yb3+ Er3+ Sm3+ S1
荧光免疫层析技术的原理与进展
介绍人：罗敏
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1
荧光免疫层析技术的基本原理
层析法(chromatography)的原理是利用混 合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、 分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、 分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase)和 流动(Mobile Phase)相组成。
• 氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子 中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨 基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧 光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米 粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团 不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。
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5纳米磁性颗粒
• 竞争法原理 • 用于农药残留定量检
测
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2 镧系元素
• 镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周 期表中原子序数 57～71 的所有元素。
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• 两种不同镧系元素离子( 分别作为光 吸收子和发射子) 掺杂入亚微米尺寸 的陶瓷颗粒( 作为主基质) 中，会构成 一类能上转发光产生荧光的特殊材
斑点免疫层析试验报告
斑点免疫层析试验报告
一、实验目的
通过斑点免疫层析试验检测特定抗体的存在，判断样本中是否含有目标抗体。
二、实验原理
斑点免疫层析试验利用抗原与抗体的特异性结合性质，检测样本中是否存在与特定抗原结合的抗体。
在试验过程中，将包含目标抗原的蛋白质在膜上固定，待其干燥后滴加待检测样本，目标抗体与蛋白质结合，再加入掺杂有染色剂的检测抗体，与样本中的抗体结合后呈色，通过颜色变化来判断样本中是否含有目标抗体。
三、实验步骤
1.将含有目标抗原的蛋白质涂在膜上，在室温下静置1小时。
2.将膜表面上的蛋白质冲洗干净，并加入待检测样本。
3.样本和蛋白质在室温下结合30分钟。
4.将掺杂染色剂的检测抗体加入，与样本中含有目标抗体的检测位点结合。
5.再次冲洗样品，待染色剂充分浸染30分钟。
6.观察染料颜色的变化。
四、实验结果及分析
将待检测样品加入检测后，测定斑点颜色变化。
颜色变化为深棕色代表样品中含有目标抗体，未检测到颜色变化则代表样品中不含目标抗体。
五、实验结论
根据斑点颜色变化判断出待检测样品中存在/不存在目标抗体。
六、实验注意事项
1.斑点免疫层析试验产生的颜色变化取决于样品中的目标抗体
浓度。
如果样品中目标抗体浓度较低，则可能无法检测到颜色变化。
2.在试验过程中，一定要注意卫生和消毒，避免出现污染。
3.试剂的储存和使用必须遵从说明书的规定。
4.使用试剂前进行试剂准备，检查是否过期或损坏。
5.在试验过程中，必须严格按照实验步骤进行，避免试验失败。
金免疫技术(斑点免疫层析试验)
金免疫技术（斑点免疫层析试验）一、原理金免疫技术是免疫标记技术之一，金盐被还原成原子金后形成金颗粒悬浮（胶体金），这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。
典型的测定方法有斑点买免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。
二、材料1 、HCG金标试纸条2、妊娠尿液正常尿液三、方法（一）胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。
（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HA uCl4水溶液100ml，加热煮沸。
根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。
（二）胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1．待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 Na Cl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1 h，去除聚合物。
2．待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
临床医学检验临床免疫技术：酶免疫技术必看题库知识点
临床医学检验临床免疫技术：酶免疫技术必看题库知识点1、单选制备酶标记物的交联剂的反应基团至少应有（）A.5个B.4个C.3个D.2个E.1个正确答案：D2、单选ELISA双抗体夹心法（）A.将（江南博哥）酶标记特异抗体用于检测抗原B.先将待测抗原包被于固相载体C.标记一种抗体可检测多种抗原D.能用于半抗原的测定E.将酶标记抗抗体用于抗原检测正确答案：A3、单选为消除非特异性显色导致的本底偏高，酶免疫技术中将抗原抗体包被后需再进行封闭的是（）A.15％～25％牛血清白蛋白B.10％～15％牛血清白蛋白C.10％牛血清白蛋白D.1％～10％牛血清白蛋白E.1％～5％牛血清白蛋白正确答案：E4、单选下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定（）A.间接法ELISAB.反向间接法ELISAC.竞争法ELISAD.双抗体夹心法ELISAE.捕获法正确答案：D5、单选以下哪一种复合物的形成属于间接法ELISA免疫反应结果（）A.固相抗原-抗体-酶标二抗B.固相抗体-抗原-酶标抗体C.固相二抗-IgM抗原-酶标抗体D.固相抗体-酶标抗原E.固相抗体-抗原-抗体-酶标抗体正确答案：A参考解析：间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
6、单选酶免疫技术中的酶结合物指的是（）A.酶标记抗体B.酶标记抗原C.酶标记抗原或抗体D.结合在固相载体上的酶E.酶与底物的结合正确答案：C7、单选酶联免疫吸附试验（ELISA）中应用最多的底物是（）A.邻苯二胺（OPD.B.四甲基联苯胺（TMB.C.ABTSD.对硝基苯磷酸酯（p-NPP）E.以上都不是正确答案：B参考解析：邻苯二胺灵敏度高，比色方便，是ELISA中应用最早的底物，但稳定性差，反应过程需要避光，还具有致癌性；四甲基联苯胺稳定性好，反应无需避光，没有致突变作用，是目前应用最广泛的底物，但是水溶性差。
金免疫测定技术
（2）于小孔内滴加免疫金试剂3滴，待完全渗入。
（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。 （4）目测观察结果
结果判断
在膜中央有清晰的红色斑点者判为阳性反应，说
明标本HCG阳性；反之则为阴性反应，说明标本 HCG阴性。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。
结果书写
例如：1号标本醋酸纤维膜中央出现红色斑点，该
抗体、毒品类药物及HCG等检测。
金免疫测定技术灵敏度不及酶标法和酶发光免疫
测定法，在临床应用中意事项
（1）打开层析条包装后应在1h内应用。
（2）将层析条插入样品中，样品的液面不 能超过试剂条的标记线。
应用与评价
这两种方法具有操作简便、快捷以及操作人员不
需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、便 于保存等特点，因此特别符合POCT项目的要求。
只作为定性或半定量试验，常用于传染病抗原和
滤出膜片。其后加入的免疫金在渗滤过程中与已
结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，
阳性反应即在膜中央显示红色斑点（胶体金聚
集）。
免疫金
HCG 抗HCG抗体 醋酸纤维素膜
主要材料
试剂盒：渗滤装置、免疫金、洗涤液
器材：一次性滴管
标本：尿液
操作步骤
（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加尿 液5滴，待完全渗入。
标本为HCG阳性
注意事项
注意试剂的保存及使用温度。
正确操作，注意加入尿液样品量和免疫金 试剂量。
斑点金免疫层析试验
原理
主要材料
层析条
标本：尿液
操作步骤
（1）将试剂条的加样端浸入尿液中2-5s，取
出，平放于桌面上。
量子点免疫层析技术原理
量子点免疫层析技术原理量子点是一种纳米尺度的半导体颗粒，具有特殊的光电性质。
当激发光照射到量子点上时，会激发量子点内部的电子跃迁，使其从基态跃迁到激发态，同时会发生自发辐射，释放出特定波长的荧光。
这种荧光具有窄的发射谱带宽、高量子效率和长的荧光寿命，使得量子点在生物标记和生物光学成像领域受到广泛关注。
1.选择合适的免疫反应：量子点免疫层析技术可以应用于抗原-抗体免疫反应、配体-受体相互作用等多种免疫反应。
根据具体的实验需求，选择适合的免疫试剂和条件。
2.准备量子点标记试剂：将特异性结合目标分子的抗体或其他配体修饰在量子点表面，形成量子点标记试剂。
这一步骤的关键是确保抗体或配体的稳定与活性，并保证其与量子点之间的牢固结合。
3.样品处理：样品中的目标分子需要被处理以使其与量子点标记试剂之间发生特异性结合。
这可能需要特定的提取步骤，如盐析、蛋白质结合剂等进行分离和富集。
4.免疫层析：将试剂和样品混合，通过吸附、洗涤和检测等步骤实现目标分子的富集和检测。
其中，量子点标记试剂与目标分子之间的特异性结合使得目标分子能够通过层析介质的通道，而非特异性结合物则被阻止。
5.信号检测：通过荧光显微镜或其他荧光检测设备对层析结果进行观察和分析。
量子点固有的荧光特性使得可以通过特定波长的激发光激发量子点放出特定波长的荧光信号，从而对目标分子的存在和数量进行定性和定量分析。
量子点免疫层析技术具有许多优势，如高灵敏度、高选择性和高稳定性。
其灵敏度通常比传统的酶联免疫吸附试验和放射免疫测定高出数倍，可实现低浓度目标分子的检测。
其选择性通过特异性抗体和配体的使用得以保证。
同时，量子点引入了荧光信号的检测方式，可以实现实时监测和多重检测。
此外，量子点的高稳定性也保证了其在检测过程中的可靠性和重复性。
量子点免疫层析技术在生物医学领域有广泛的应用。
它可以用于分析生物样品中的肿瘤标志物、病原体、药物残留等，具有诊断疾病、监测疗效和研究疾病发生机制等方面的潜在应用。
临床医学检验临床免疫：免疫标记技术必看题库知识点(强化练习)
临床医学检验临床免疫：免疫标记技术必看题库知识点（强化练习）1、多选电泳技术根据其工作原理可分为OA.移界电泳B.区带电泳C.等速电泳D.等电聚焦电泳E.免疫电泳正确答案：A,B,C,D,E2、单选、（江⅛⅛哥‘）'用E1.lSA抗体夹心法检测抗原A时，固相载体的包被物是（）A.酶标记A抗体B.未标记的抗A抗体C.未标记抗原AD.酶标抗球蛋白抗体E.酶标记的A抗原正确答案：B3、单选电泳分析的血标本，冰箱冷藏保存标本可稳定的时间是OA.1周B.2周C.3周D.4周E.5周正确答案：A4、单选在用RIA检测某种激素在血清中的浓度时，其抗原抗体复合物中的放射性强度越大，表明OA.该激素在血清中的浓度越高B.该激素在血清中的浓度越低C.游离的标记激素的浓度越高D.对这种激素的特异性抗体浓度越高E.游离的标记激素浓度越低正确答案：B参考解析：RIA原理：标记抗原与非标记抗原（待测物）对有限量特异性抗体竞争性结合，Ag—Ab复合物放射性越大，则表示被标记的抗原结合越多，而非标记标原（待测物）浓度越低。
【考点】：放射免疫分析（RlA）5、单选荧光抗体染色技术的检测方法特异性最好，敏感度最差的方法是OA.直接法B.间接法C.补体法D.双标记抗体法E.流式细胞技术正确答案：A6、单选在E1.ISA中，不是E1.lSA的反应过程，但却是决定试验成败的关键的是（）A.温育B,洗涤C.加样D.结果判断E.做阴阳性对照正确答案：B7、单选酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的OA.均相酶免疫测定B.异相酶免疫测定C.固相酶免疫测定D.液相酶免疫测定E,固相一液相酶免疫测定正确答案：A8、单选下列不属于E1.ISA测定方法中所必需的试剂（）A.固相的抗原或抗体B.酶标记的抗原或抗体C.酶作用的底物D.戊二醛交联剂E.稀释的血清正确答案：D参考解析：E1.lSA是在固相载体上包被抗原或抗体后，通过抗原抗体反应使酶标抗体（或酶标抗原）结合到载体上，经洗涤使结合的酶标抗体和游离的酶标抗体分离，洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原）。
[基础科学]斑点免疫层析试验
![[基础科学]斑点免疫层析试验](https://img.taocdn.com/s3/m/58a7c171793e0912a21614791711cc7931b778f2.png)
实验二十三斑点免疫层析试验(Dot immunogold chromatographic assay)斑点金免疫层析试验是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。
本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。
本实验以双抗体夹心法测定HBsAg为例。
【实验原理】金标抗HBsAg抗体(兔型)干片粘贴在近下端，抗HBsAg单克隆抗体(鼠型)羊抗兔IgG抗体分别包被在NC膜的测试区和质控区。
测试时，试纸条下端浸入血清样品中或滴加血清样品，通过层析作用，上端移动，流经干片时将金标抗HBsAg抗体复溶，若待检血清中含HBsAg，即形成金标抗HBsAg-HBsAg复合物，移至测试区时，形成金标抗HBsAg-HBsAg-抗HBsAg复合物，金标抗HBsAg 被固定下来显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标抗HBsAg抗体移至质控区被羊抗兔免疫球蛋白抗体捕获，呈现红色质控线条。
【主要试剂与器材】1.胶体金层析条所用试剂全部为干试剂被组合在该层析条上，有商品供应。
2.样品待检血清和HBsAg阳性质控血清【操作方法】1.将试剂条标记线一端浸入待检样品中2～5秒或在样品加样处加一定量待检样品，平放于水平桌面上。
2.室温下5～15min，目测观察结果。
【结果判断】结果判断见图23-1。
HBsAg阳性(+)：两条紫红色条带出现，样品中含有乙肝表面抗原。
HBsAg阴性(-)：仅质控区(C)出现一条紫红色条带，样品中检测不出乙肝表面抗原。
试剂条无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质失效。
图23-1 斑点免疫层析试验结果判断示意图【注意事项】1.打开试剂条包装后应在1h内应使用。
2.将试剂条插入血清/血浆样品中，血清/血浆样品液面不能超过试剂条的标记线。
3.若发现试剂条无效，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。
如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品。
几种胶体金技术详解
胶体金免疫分析技术详解随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。
前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验” 和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。
这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。
它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。
本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。
金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。
此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。
此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。
近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。
胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。
与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。
第三节免疫检测技术的基本原理
第三节免疫检测技术的基本原理免疫检测技术是一种利用机体免疫系统对抗入侵病原体的能力进行疾病诊断和评估的方法。
该技术主要基于抗原与抗体之间的高度特异性结合反应，通过检测抗体或抗原的存在来确定其中一种疾病是否存在或预测其中一种疾病的发展趋势。
免疫检测技术的基本原理主要包括两大类：免疫层析和免疫荧光。
免疫层析（immunochromatography）是一种利用抗原与抗体反应在试纸上形成可见免疫复合物的技术。
它使用特定的膜或纸质载体，上面含有抗体、抗原或标记物，形成不同测试区域。
当待检样品进入试纸后，如存在目标抗原，则会与试纸上的抗体发生特异性结合。
在试纸上形成特定结合的复合物，被标记物所发出的染色信号或带测结果的线条可见，从而判断是否存在该抗原。
常见的免疫层析方法包括单克隆抗体纸胶片法和双特异性抗体纸胶片法，广泛应用于尿液、血液、唾液等体液的检测。
免疫荧光（immunofluorescence）是一种利用特定的荧光标记物对抗原或抗体进行检测的技术。
它通过将特定标记的抗体与待检样品中的抗原或抗体反应，产生与待检物质特异性结合的荧光信号。
该荧光信号可以使用荧光显微镜或相关设备进行观察和分析。
免疫荧光技术具有高度敏感性和高度特异性的优势，特别适用于寻找病原体感染或自身免疫疾病的抗核抗体、抗DNA抗体等。
除了以上两种基本原理外，免疫检测技术还有其他几种常见的方法。
酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种利用酶作为标记物来检测抗原或抗体的技术。
该方法通过将酶标记的抗体与待检样品中的抗原或抗体进行特异性结合，再加入相关底物产生反应，并通过酶底物产生的染色或荧光信号的强度或颜色来判断待测物的含量或存在与否。
ELISA广泛应用于疾病的诊断、药物检测和食品安全等领域。
免疫印迹（immunoblotting）是一种将待检样品中的蛋白质分离、转移到膜上，然后使用特异性抗体与膜上的蛋白质进行反应的技术。
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
2024临床免疫学检验名词解释(第二部分)
2024临床免疫学检验名词解释（第二部分）49、荧光：荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光。
so、荧光免疫试验：是以荧光物质标记抗体或抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异也绪合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。
51、时间分辨荧光免疫试验：以系元素标记杭原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。
52、Stokes位移：选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱的波长差，即Stokes位移。
53、荧光偏振免疫试验：是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与荧光素抗原－抗体复合物之间荧光偏振程度的差异测定体液中小分子抗原物质的含量。
54、荧光效率：荧光物质分子将吸收的光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。
55、荧光滓灭：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、硝基苯、酚、I－等）作用下，发射荧光减弱甚至消退的现象称为荧光滓灭。
56、酶免疫试验：是继荧光免疫试验和放射免疫试验之后的三大经典免疫标记技术之一，它以酶标记抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的专一性和抗原－抗体反应的特异性相结合的免疫检测技术。
57、包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程称为包被。
58、封闭：由千包被液蛋臼浓度很低，造成包被后固相载体表面会剩余少量未结合位寺，可非特异性吸附标本中的蛋白质和酶结合物，形成非特异性结合导致本底增高。
为消除干扰，包被后的微孔板或膜等还需用1%~5％牛血清白蛋白(BSA),5% ~ 20％小牛血清或2％脱脂乳等再包被一次，此过程称为封闭。
59、均相酶免疫试验：是利用酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合酶标记物和游离酶标记物分离的清况下，通过测定标记酶活性的改变（酶活性增强或减弱），从而确定待测物的含量。
临床免疫学检验-第十一章固相膜免疫测定
DOT-ELISA优点
• 吸附蛋白能力强，微量抗原吸附完全， 灵敏度高
• 试剂用量少 • 不需特殊设备 • 结果可长期保存。
DOT-ELISA局限性
• 仅为能定性实验 • 非特异性吸附 • BUBBLE FORMATION导致试剂不均结
果模糊
免疫印迹法
（immunoblottingtest，IBT）
第一节 免疫金标记技术
• 金标记免疫分析技术是一种以抗原抗体 特异性反应为基础,以金颗粒示踪的新 的标记免疫技术.
胶体金及其制备
• 胶体金也称金溶胶,是由金盐被还原成原 金后形成的金颗粒悬液.也称金溶胶。
枸橼酸三钠还原法制备金溶胶
• 加热0.01%氯金酸水溶液适量至沸腾，搅 动下加入1%枸橼酸三钠水溶液适量，金 黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红 色，继续煮沸15分钟，冷却后加蒸馏水 至原体积即可。金溶胶的呈色与溶胶颗 粒的大小密切相关，而金溶胶颗粒的直 径与制备时加入的枸橼酸三钠量密切相 关，改变枸橼酸三钠量可制得不同粒径 和颜色的金溶胶。
临床免疫学检验 第十一章
固相膜免疫分析技术
技术原理
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微 孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒 子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝 酸纤维素（NC）膜。
技术分类
免疫渗滤试验：穿流形式 免疫层析试验：横流形式
斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 免疫印迹法 (Western blot)
: probed with Ab & then radiolabeled or enzyme-linked 2nd Ab.
FIGURE 6-12
: a position is visualized by means of an ELISA reaction.
免疫层析各种方法法原理
免疫层析各种方法法原理免疫层析法（immunochromatography）是一种广泛应用于生物医学领域的免疫分析技术。
它基于抗原抗体反应的特异性，通过将抗体固定在固相支持材料上，实现对目标分子的检测和测定。
免疫层析法具有操作简便、实时性强和可视化结果等优点，在快速诊断、环境监测、食品安全等领域有广泛的应用。
免疫层析法的基本原理是将液相中的目标分子与固相上的特异性抗体发生反应，从而实现目标分子的检测和分离。
免疫层析法常用的方法包括间接免疫层析、竞争免疫层析和直接免疫层析。
间接免疫层析法是最常见的免疫层析方法。
其基本原理是将目标物质与标记物结合形成复合物，然后将复合物与固相上的抗体相互结合，从而实现目标物质的检测和测定。
间接免疫层析法通常使用胶体金或者其他标记物质进行标记，在免疫层析试纸上可见金红色线条显示结果。
竞争免疫层析法是通过竞争分子与目标分子在固相上的抗体结合来实现检测和测定的方法。
它的原理是将标记的检测物与待测物在固相上的抗体竞争结合，形成竞争复合物，进而通过与检测物竞争亲和力的程度确定目标物质的浓度或者存在与否。
竞争免疫层析法通常使用竞争物与待检测物在固相上的抗体结合，从而实现结果的测定。
直接免疫层析法是将目标物质直接与固相上的抗体相互结合，从而实现检测和测定的方法。
它的原理是将液相中的目标分子直接与固相上的抗体结合形成复合物，然后通过可视化或其他方法来判断复合物的形成情况，从而进行目标物质的检测和测定。
除了以上三种方法之外，还有一些衍生的免疫层析方法。
例如，双向免疫层析法，它的原理是将待测物与标记物在液相中预先形成复合物后加样，这种方法可以大大提高灵敏度和准确性。
另外，还有一种称为流动免疫层析法的方法，它基于待测物与经过标记的抗体结合后，形成可见线条或者其他显示方式的反应结果。
总之，免疫层析法是一种通过特异性抗体与目标分子结合形成复合物来实现检测和测定的免疫分析方法。
通过不同的方法和策略，可以实现对不同分子的快速、准确和可视化的检测。
荧光免疫层析技术的原理和进展PPT培训课件
• 胶体金既有明亮的色彩， 又有高电子密度，可以吸 附生物大分子，且不影响 生物分子的活性，故可作 为生物分子的标志物，用 于免疫反应中抗原或抗体 的标记定位，定性甚至定 量研究。层析试纸标记用 金颗粒的直径大多在 20～ 40 nm，呈深红色。
• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。
发射荧光的光量子荧 数光 （强度） 吸收光的光量子数发 （光 激强度）
荧光寿命
定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程 度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
• 引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag
(k)Ab1-Ag
(k)Ab1-Ag-Ab2
Ab3-(k)Ab1
(k)Ab1
阳性结果T,C均有颜
Ab2
色
T
C
待测液，不含抗原 Ag
(k)Ab1 (k)Ab1
(k)Ab1 Ab2
Ab3-(k)Ab1
阴性结果T无颜色， C有颜色
T
C
双抗体加心法检测原理图 K代表某一标记物
过调整粒子尺寸可
得到不同发射光谱，
即可使用大小不同 的同种 QDs 颗粒实 现不同颜色标记。
• ②较大的Stokes 位移和狭 窄对称的荧光谱峰。
• 使得用同一激发光源可同 时激发不同大小的量子点， 产生不同发射光谱，使同 步检测多样本成为可能。
• ③QDs 荧光性质稳定，可 长期保存，经受反复多次 激发。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
免疫层析法检测原理
免疫层析法检测原理The principle behind the immunoassay technique lies in the specific interaction between an antigen and an antibody. (免疫层析法的原理在于抗原和抗体之间的特异性相互作用。
) This interaction forms the foundation for the detection of various substances, such as hormones, drugs, and infectious agents, in biological samples. (这种相互作用为检测生物样本中的激素、药物和感染性物质等各种物质奠定了基础。
)One of the key components in immunoassays is the use of a labeled molecule, such as an enzyme or a fluorescent dye, which allows for the visualization and quantification of the antigen-antibody complex. (免疫层析法的关键组成部分之一是使用标记分子，如酶或荧光染料，这使得抗原-抗体复合物的可视化和定量成为可能。
) This labeled molecule serves as a marker for the presence of the antigen, leading to a color change or emission of light that can be measured and analyzed. (这种标记分子作为抗原存在的标志，导致颜色变化或发射光线，可以进行测量和分析。
)The process of immunoassay typically involves several steps, starting with the incubation of the sample containing the antigen with a specific antibody. (免疫层析法的过程通常涉及几个步骤，从含有抗原的样本与特异性抗体的孵育开始。
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。