微生物培养及实验基本操作技术

微生物培养及实验基本操作技术
一、培养基配制
培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。

配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。

注意事項–灭菌锅的使用
①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀
灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門
進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆
拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套
培养基中的主要成分及其作用：
营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水
常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏
常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖
双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）
水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等
抑制剂：
1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率
2、种类：
盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等
染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红
胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐
抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素
指示剂
1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含
氮化合物，产酸产碱的能力。

2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。

培养基的类型：
●根据培养基的物理状态来区分：
1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养
2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定
3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种
4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。

●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装
瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。

●根据培养基的用途来区分：
➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基
1、增殖培养基：在普通培养基中加入
一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。

能够给微生物提供较适当的生长环境从而使微生物大量繁殖的培养基称为增菌培养基。

增菌、运送用培养基
2、选择培养基：在培养基中加入抑制剂以杀死或抑制不需要的菌种,分离对象因对该抑制剂有抗性而正常生长繁殖的培养基,称之为选择培养基。

分离培养用的培养基
3、鉴别培养基：在培养基中加入指示剂或化学药品,目的菌经培养后其代谢产物与化学试剂发生显色反应,因而用肉眼可快速鉴别出目的菌,这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如:伊红美蓝培养基(EMB)就是一种常用的鉴别性培养基。

伊红美蓝培养基用于食品、乳制品、水源和病源标本中革兰氏阴性肠道菌的分离和鉴别
鉴别用培养基
4、活体培养基：病毒、立克次氏体等专性寄生微生物不能在一般培养基上生长,常用鸡胚、活细胞和动物进行培养。

采用鸡胚培养时,将微生物接到绒毛尿囊膜、尿囊、羊膜囊和卵黄囊中进行培养,即可得培养物。

细胞培养指将病毒接种到体外培养的活细胞上使其增殖。

（三）培养基制备的基本方法和注意事项
•培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化
•培养基pH的初步调正培养基的过滤澄清培养基的分装
•培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存1、培养基的制备记录
•每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。

•记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

2、培养基成分的称取
•培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最
好一次完成，不要中断。

可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。

完全称取完毕后，还应进行一次检查。

3、培养基各成份的混合和溶化
•指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足水份；
•不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。

4、培养基pH的校正
灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；
pH调整后，还应将培养基煮沸。

5、培养基的过滤澄清
•液体培养基可用滤纸过滤法
•琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤６、培养基的分装
•斜面：1/５管半固体培养基：1/3管
•高层斜面：1/4～1/3管平板：13~15ml
7、培养基的灭菌
（1）含糖类或明胶的培养基：113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。

（2）无糖培养基：121℃灭菌15~20分钟。

（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。

（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。

8、培养基的质量测试
（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。

并测定其最终pH。

（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。

（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。

应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。

9、培养基的保存
（1）基础培养基不能超过两周
（2）生化试验培养基不宜超过一周，
（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。

二、无菌技术
指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。

消毒灭菌技术是微生物检验最基本的试验技术之
灭菌：
应用物理或化学的方法杀死或除去物品上或环境中的所有微生物称为灭菌。

经过灭菌以后的物品,应该不存在具有生命力的微生物营养体及其芽孢、孢子,即处于无菌状态,否则就是灭菌不彻底。

消毒
应用物理或化学的方法杀死物体上或环境中绝大部分微生物(特别是病原微生物)。

物品消毒处理后,虽仍有少数微生物未被杀死,但已不致引起有害作用,故消毒实际上是不彻底的灭菌。

具有消毒作用的物质称为消毒剂。

消毒剂的杀菌作用是有限的,并不是所有的消毒剂都能将各种病原微生物杀死。

无菌：
指没有具有生命力的微生物存在的意思。

只有通过彻底灭菌,才能达到无菌要求。

因此,灭菌是指对物品的作用,而无菌则是描述物品的状态。

灭菌是无菌的先决条件,无菌是灭菌后的结果
灭菌方法：物理方法：加热法、过滤除菌法化学方法：化学消毒剂
（一）无菌环境：无菌室无菌柜超净工作台
1、无菌室：
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间
（2）无菌室的消毒和防污染
•每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.
•每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.
•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。

2、超净工作台
超净台的使用与保养:
•（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;
•（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;
•（3）让超净台预工作10－15分钟;
•（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.
（二）无菌器材
•灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.
•消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等
（三）无菌操作
1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；
•（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。

2、进入无菌室前的准备
•（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；
•（2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；
•（3）检查无菌器材是否备齐；
•（4）洗手消毒；
•（5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。

3、检验操作过程的无菌操作要求
•（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；
•（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。

•（3）在正火焰上方操作；
•（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；
•（5）在接种培养物时，协作应轻、准。

•（6）不能用嘴直接吸吹吸管。

•（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

斜面接种时的无菌操作
(1)接种环灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞
无菌操作–斜面接种取菌技巧
1. 接種環前端镍絲部分以酒精燈烧红灭菌，後端鐵棒部分過火
2. 試管前端過火
3. 打開試管蓋
4. 試管傾斜，放入接種環
5. 試管前端過火，蓋上試管蓋
6. 接種環燒紅灭菌
无菌操作–平板接种取菌技巧
自Plate 上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培养基，避免空氣中菌體掉入) 方法二：plate 反面拿起)
无菌操作–吸球取菌技巧：
1. 擠出安全吸球內空氣，插上灭過菌之玻璃吸管
2. 向上為吸，向下為放
无菌操作–移液器取菌技巧
1. 調整Pipetman 刻度(P1000 吸取範圍200 ~ 1000μl)
2. 插上灭過菌之Tip (用力插緊)
3. 按鈕壓至第一段(不可壓至最底)
4. 深入液面下2 ~ 4 mm
5. 慢慢釋放按鈕，即可吸取液體
无菌操作–接菌技巧
1. 試管前端過火
2. 打開試管蓋
无菌操作–液体接菌技巧
方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌
方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液
方法三：以Pipetman 吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液三、微生物的接种与分离、纯化技术
（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

1、接种工具和方法
1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀
2、常用的接种方法
•１）划线接种２）点植接种３）穿刺接种４）倾注接种
•５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种
(二)、分离纯化
1 稀释倾注平板法：
1、先稀释样品，加入平板
2、倒平板时注意培养基温度
3、混合均匀
３、平板划线法：.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。

2、划线方法
四、微生物的培养方法
（一）一般培养法（需氧培养）
•培养温度:25~37℃；接种后平板、试管、三角瓶，置
于恒温培养箱
（二）、厌氧培养方法
1、简易的厌氧培养法：
•（1）庖肉培养法
•（2）铁丝圈厌氧培养法
•（3）焦性没食子酸法
2、厌氧罐法
3、厌氧手套箱法
A、厌氧缸法：厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

•接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。

B、厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。

（三）二氧化碳培养法
•1、烛缸法2、二氧化碳置換法
•3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳
升加入
•4、二氧化碳培养箱法
五、微生物培养特性观察与记录
•在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。

•在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。

•半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。

1. 菌落形态观察
•菌落特征:
(1)大小:大、中、小、针尖状,可用游标卡尺测量菌落的直径(mm)。

(2)颜色:黄、浅黄、乳白、灰白、红、粉红等。

(3)干湿:干燥、湿润、黏稠。

(4)质地:蜡状、液滴状、皱褶状等。

(5)形态:圆形、不规则等。

(6)表面:扁平、隆起、凹、凸、突脐状等。

(7)透明:透明、半透明、不透明。

(8)边缘:整齐、不整齐、圆锯齿状、裂叶、不定形。

六、染色技术
(一) 染色的基本原理
•微生物染色的基本原理是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。

•物理因素：如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。

•化学因素：根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各
种化学反应。

•酸性物质对于碱性染料较易吸附,且吸附作用稳固;同样,碱性物质对酸性染料较易于吸附。

•如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力,易于吸附。

(二) 染料的种类和选择
•碱性染料：如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等；
•酸性染料：如伊红、酸性复红或刚果红等；
•中性染料：是上述两者的结合物,也叫复合染料,比如,伊红美蓝、伊红天青等。

(三) 染色方法
•单染色法即只用一种染料对细菌着色。

此法手续简便,但一般只能显示菌体的形态,功能较单一。

•复染色法是使用两种及两种以上染料对细菌染色。

•常用的方法有革兰氏染色法和抗酸染色法等。

(四)染色的基本程序
单细胞细菌染色为例
1.涂片：(1)在洁净无油脂的载玻片上滴一滴生理盐水(如果是液体菌悬液,则可不滴)。

(2)用灭菌接种环挑取菌落少许至载玻片的生理盐水内,并轻轻涂布成薄薄的菌膜。

若是菌液标本,则用无菌接种针直接涂布成菌膜。

2.干燥：涂布的标本,一般在室温下自然干燥。

•若需加速干燥，则可在酒精灯火焰上方利用其热空气加温,切忌火烤和温度过高。

3.固定：细菌固定常用的是火焰加热法
•将干燥涂片迅速通过火焰2~3次,温度不宜过高,以玻片背面触及皮肤有热感而不烫手为度。

4.染色：染色的目的是增大标本与环境的反差，便于在显微镜下观察。

•以普通涂片标本的染色为例,就是将所需染色液滴加在标本上，以覆盖涂膜为够，达到所需染色时间，倾去染色液，水洗，吸干即可。

5.媒染：有的染色还需要增加媒染剂。

以增大染料与被检标本物质的亲和力，或使染料更好地固定于被染标本。

•媒染剂可用于细菌标本固定之后，也可包含在固定剂或染色液中，革兰氏染色中的碘液就是媒染剂。

6.脱色：使着色的染料脱去颜色称为脱色。

能脱色的物质称为脱色剂。

•在染色中,使用脱色剂的作用有的是起溶媒作用,有的是影响细菌蛋白质的电离度，改变电荷的性质和数量，因而影响染料的染色质量。

•利用脱色剂主要是检查染料与细菌结合的稳定程度，作为鉴定染色之用。

如革兰氏染色使用乙醇，就是鉴别不同的细菌。

•使用脱色剂时，就是将脱色剂滴在经过染色的标本上，作用一定时间后，倾去脱色剂，水洗即成。

有的脱色一定要掌握好时间，否则不能达到理想目的。

7.复染：在进行鉴别染色时,已经进行过脱色的标本，常需要复染剂重复染色1次，使复染剂与初染颜色形成鲜明对比。

复染不宜太强，以免覆盖初染颜色。

常用的细菌染色法
1. 简单染色法：简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色。

简单染色方法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
简单染色流程
(1)涂片：取一块干净的载玻片,并在其中央滴一小滴生理盐水(或无菌蒸馏水)。

接种环在酒精灯上杀菌后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后,涂布成一均匀的薄层。

涂布面一般以直径1cm大小范围为宜。

(2)干燥与固定：涂片最好在室温下使其自然干燥。

亦可在酒精灯上微微加热,加速水分蒸发,但切勿过热。

固定时,在酒精灯火焰外层尽快地来回通过2~3次,多为2~3s,以载玻片背面不觉烫手为宜,放置待冷后,进行染色。

(3)染色：在涂片上滴染色液一滴,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

(4)水洗：斜置载玻片,在来自水龙头下用小股水线冲洗,直至洗下的水呈无色为止。

(5)干燥：用吸水纸吸去涂片边缘的水珠,置室温下自然干燥或微微加热,以加快干燥速度。

注意用吸水纸时切勿将菌体擦掉。

(6)镜检：用显微镜观察,并用铅笔绘出细菌形态图。

2. 革兰氏染色法：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

革兰氏染色是一种复染色法(由两种或多种染料染色的方法,称复染色法,又叫鉴别染色法)。

革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G¯表示。

革兰氏染色需要的试剂主要有草酸铵结晶紫染液、碘液、石炭酸复红染液、95%乙醇、番红染液、香柏油、二甲苯。

•染色流程：制片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水
洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察
革兰氏染色流程
(1)制片。

取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片。

方法与简单染色法相同(取菌一定不要太多和涂片太厚,否则导致菌体重叠,难以观察)。

(2)初染。

用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。

(3)媒染。

滴加碘液媒染1min后水洗。

(4)脱色。

将载玻片上水滴小心吸净后,滴加95%乙醇脱色,至流出的乙醇不现紫色为止,需时20~30s,随即水洗;或将乙醇滴满整个涂片,静置约30s,水洗,这样可节约乙醇。

(5)复染。

用番红染液复染约1.5min后水洗。

(6)干燥。

用吸水纸吸掉水滴,于室温下自然干燥。

(7)镜检。

待标本片干后置显微镜下,用油镜观察,注意细菌细胞的颜色,并用铅笔绘出细菌形态图。

3. 芽孢染色法
细菌芽孢含水量很低,具有厚而致密的壁,其通透性比营养细胞低,着色和脱色均较困难,折光性很强。

除了用着色力强的染料外,还必须加热,以促进芽孢的着色,再使菌体脱色,而芽孢上的染料则难以渗出,故仍保留原有颜色,然后用另一种反差强烈的染料复染,使菌体和芽孢呈现出不同的颜色,明显地衬托出芽孢来。

具体方法有很多,如孔雀绿一番红染色法等。

细菌芽孢染色流程
(1)制备菌液：加1~2滴无菌水于小试管中,用接种环从斜面上挑取2~3环苏云金杆菌或者枯草杆菌的菌体于试管中并充分打匀,制成浓稠的菌液。

(2)加染色液：加5%孔雀绿水溶液2~3滴于小试管中,用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

(3)加热：将此试管浸于沸水浴(烧杯),加热15~20min。

(4)涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上,做成涂面,晾干。

(5)固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。

(6)脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

(7)复染：加番红水溶液染色5min后,倾去染色液,不用水洗,
直接用吸水纸吸干。

（8）镜检：先低倍,再高倍,最后用油镜观察。

结果：芽孢呈绿色,芽孢囊和菌体为红色。

4. 鞭毛染色法
•细菌鞭毛极细,其直径⊥般为10~20nm,只有用电子显微镜才能观察到。

但是若采用特殊染色方法,则在普通光学显微镜下也能看到。

•鞭毛染色法有很多,但基本原理相同,即在染色前先经媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。

•常用的媒染剂是由单宁酸和钾明矾或氯化铁等配制而成的一种不太稳定的胶体溶液,而染料可根据不同的方法有多种选择。

5. 荚膜染色法
•荚膜是由多糖类衍生物和多肽聚集而成的,能溶于水,且自身含水量很高。

•由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染
色法对荚膜染色,即设法使菌体和背景着色而荚膜不着
色。

因此,荚膜在菌体周围呈现一个透明圈,从而可以清
晰地观察到荚膜的大小和形态。

•荚膜染色法主要有番红染色法、湿墨水法、干墨水法和Tyler法等
1. 负染色法
•(1)制片：取洁净的载玻片一块,加蒸馏水一滴,取少量胶质芽孢杆菌的菌体放人水滴中混匀并涂布。

•(2)干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

•(3)染色：在涂面上加复红染色液染色2~3min。

•(4)水洗：用水洗去复红染液。

•(5)干燥：。

将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

•(6)涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素,用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素,使黑素沿玻片边缘散开,然后
向右一拖,使黑素在染色涂面上成为一薄层,并迅速风
干。

•(7)镜检先低倍镜、再高倍镜观察。

•结果：背影灰色,菌体红色,荚膜无色透明。

2. 湿墨水法
(1)制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上,挑少量胶质芽
孢杆菌的菌体与其充分混合均匀。

(2)加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片
上放一张滤纸,向下轻压,吸去多余的菌液。

加盖玻片时不可有气泡,否则会影响观察。

(3)镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。

结果：背景灰色,菌体较暗,在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。

3. 干墨水法
(1)制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端,挑少
量胶质芽孢杆菌的菌体与其充分混合,再加1滴墨水,充分混匀。

（2）制片：左手执玻片,右手另拿一边缘光滑的载玻片,将载玻片的一边与菌液接触,使菌液沿玻片接触处散开,然后以30°角,迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端,使菌液
铺成一薄膜。

(3)干燥：空气中自然干燥。

(4)固定：用甲醇浸没涂片,固定1min,立即倾去甲醇。

(5)干燥：在酒精灯上方,用文火干燥,不可使玻片发热。

(6)染色：用甲基紫染1~2min。

(7)水洗：用自来水轻洗,自然干燥。

(8)镜检：先用低倍镜、再高倍镜观察。

结果：背景灰色,菌体紫色,荚膜呈一清晰透明圈。

6. 霉菌的染色
•霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,且孢子容易飞散,所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。

•此染色液制成的霉菌标本片的特点是:细胞不变形,具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间,溶液本身
呈蓝色,有一定染色效果。

七、微生物显微技术
•在实验室中常用的有:普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

通常在我们观察细菌、放线菌以及真菌等相对较大的微生物时,可以采用普通光学显微镜。

普通光学显微镜通常能将物体放1500~2000倍。

八、微生物计数法
•显微直接计数法：利用血细胞计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内。

•平板计数法：是平板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长。

（一）微生物直接计数法
•利用血细胞计数板进行直接计数。

•计数前需对样品做适当稀释,然后将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血细胞计数板的计数室内,按照在显微镜下观察到的微生物数目代入计算公式运算后,即可得出单位体积微生物总数目。

•此法的优点是直观、快速。

•用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/mL)。

活跃运动的细菌应现用甲醛杀死或适度。