微生物培养及实验基本操作技术

微生物培养及实验基本操作技术

一、培养基配制

培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。

配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。

注意事項–灭菌锅的使用

①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀

灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門

進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆

拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套

培养基中的主要成分及其作用：

营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水

常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏

常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖

双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）

水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等

抑制剂：

1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率

2、种类：

盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等

染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红

胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐

抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素

指示剂

1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含

氮化合物，产酸产碱的能力。

2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。

培养基的类型：

●根据培养基的物理状态来区分：

1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养

2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定

3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种

4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。

●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装

瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。

●根据培养基的用途来区分：

➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基

1、增殖培养基：在普通培养基中加入

一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。能够给微生物提供较适当的生长环境从而使微生物大量繁殖的培养基称为增菌培养基。

增菌、运送用培养基

2、选择培养基：在培养基中加入抑制剂以杀死或抑制不需要的菌种,分离对象因对该抑制剂有抗性而正常生长繁殖的培养基,称之为选择培养基。

分离培养用的培养基

3、鉴别培养基：在培养基中加入指示剂或化学药品,目的菌经培养后其代谢产物与化学试剂发生显色反应,因而用肉眼可快速鉴别出目的菌,这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如:伊红美蓝培养基(EMB)就是一种常用的鉴别性培养基。伊红美蓝培养基用于食品、乳制品、水源和病源标本中革兰氏阴性肠道菌的分离和鉴别

鉴别用培养基

4、活体培养基：病毒、立克次氏体等专性寄生微生物不能在一般培养基上生长,常用鸡胚、活细胞和动物进行培养。

采用鸡胚培养时,将微生物接到绒毛尿囊膜、尿囊、羊膜囊和卵黄囊中进行培养,即可得培养物。细胞培养指将病毒接种到体外培养的活细胞上使其增殖。

（三）培养基制备的基本方法和注意事项

•培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化

•培养基pH的初步调正培养基的过滤澄清培养基的分装

•培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存1、培养基的制备记录

•每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。

•记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

2、培养基成分的称取

•培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最

好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。

完全称取完毕后，还应进行一次检查。

3、培养基各成份的混合和溶化

•指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足水份；

•不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。

4、培养基pH的校正

灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；

pH调整后，还应将培养基煮沸。

5、培养基的过滤澄清

•液体培养基可用滤纸过滤法

•琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤６、培养基的分装

•斜面：1/５管半固体培养基：1/3管

•高层斜面：1/4～1/3管平板：13~15ml

7、培养基的灭菌

（1）含糖类或明胶的培养基：113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。

（2）无糖培养基：121℃灭菌15~20分钟。

（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。

（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。

8、培养基的质量测试

（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。

（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。

（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。