细胞工程知识点总结

细胞工程：以生物细胞或组织为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的的利用或改造生物遗传特性，以获得特定细胞、组织、产品或新型物种的一门综合性学科。

1.微繁殖：是指在离体培养条件下、将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。

2.繁殖系数：经一次增值培养或在一定时间段内由一个繁殖体所增殖获得的总繁殖体数或苗数。

3.玻璃化：也称超水化作用，是离体培养过程中试管苗发生形态、生理和代谢异常的现象。

4.褐变：是指组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。

5.原球茎：兰科植物的种子在萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。

6.茎尖分生组织：指茎尖最幼龄叶原基上方的由2或3层分生细胞组成的很小区域、一般最大直径不超过0.1mm,长度0.25mm，最小的茎尖长度仅有几十微米，有时也称顶端分生组织。

7.不定芽：相对于顶芽和腋芽、由植物的其他部位或器官、组织上通过器官发生重新形成的、无固定着生位置的芽统称为不定芽。

细胞细胞工程知识点绪论研究内容（根据操作对象）：1）器官组织和细胞培养2）原生质体培养3）植物胚
胎培养4）动物胚胎工程5）转基因动植物6）胚胎干细胞7）染色体工程研究内容(研究水平）；个体、器官、组织、细胞、亚细胞、分子等不同研究层次动物细胞发展经历了哪些阶段？答：①细胞培养技术②细胞融合技术③动物胚胎移植技术④体外受精技术⑤动物克隆技术⑥转基因动物技术⑦胚胎干细胞技术生物工程：1）发酵工程2) 基因工程3）酶工程4）细胞工程5）蛋白质工程
（第二章没有放进来！！！！）
第三章培养原理
细胞学说：1838年，主要观点：细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。

植物细胞的全能性：每个植物细胞都具有该物种的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。

植物细胞全能性含义：（1）每个植物细胞都具有它母性的全部遗传特征。

（2）每一个细胞都可以在特定条件下发育成为与母体一样的植株。

全能性的实现：一个已分化的细胞要实现其全能性两个过程：一是脱分化，使外植体的细胞转变成胚性细胞，从而获得不断分裂的能力；二是再分化，使胚性细胞分化形成器官。

条件：①具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下；②赋予离体细胞一定刺激，包括营养物质、植物激素、光周期、温度、酸碱度等。

途径：1）以植物的体细胞为培养材料，可以诱导形成完整植株。

2）以植物的性细胞为培养材料，可以诱导形成完整植株。

3）用酶解法去除植物细胞的细胞壁，培养裸露的原生质体，原生质体发育成植物体。

4）加入促溶剂，可以诱导两个不同种的原生质体融合，继续培养可发育成杂种植株。

5）将外源基因通过不同基因载体引入植物细胞，使植物细胞在分子水平上发生修饰，经离体培养后可再生成具有新性状的植物体。

（转基因）
植物细胞的分化：由发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。

脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的表型也不稳定，其基因活动模式也发生可逆的变化，细胞脱离原状态而回复到分生状态。

细胞脱分化的结果产生愈伤组织。

成熟细胞分生细胞多细胞团形态建成完整植株
外植体离体培养到再分化形成各器官三个时期：
（1）诱导期（2）分裂期（3）分化期
植物愈伤组织：植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不断增值形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。

愈伤组织的类型：胚型紧密型（胚性质地较坚实、乳白色或黄色、表面有球形颗粒）易碎型非胚性（松散易碎、黄的或褐色、表面粗糙、生长迅速）
Ⅰ型（乳白色或绿色、结构致密、复杂多样、生长缓慢、不宜长时间保持胚性）。

Ⅱ型（淡黄色或黄色、结构松散、松软、呈颗粒状生长较快、能长时间保持胚性。

）Ⅲ型（白色或灰色透明水渍状，松软无结构，形似或冰针絮状，继代易褐化而死亡。

）
愈伤组织的细胞组成（分生细胞、薄壁细胞、厚壁细胞和管状细胞。

）
分生细胞存在于分生组织和胚状体内，其细胞小，细胞核占比例大，细胞质着色深，无或少有液泡。

薄壁细胞较大，细胞非圆形，核小，且被中央大液泡挤到边缘，很多薄壁细胞中不见核的存在，部分薄壁细胞已解体，胞质内无或残留少量物质，残留物着色均一。

厚壁细胞存在于愈伤组织表面，其细胞质解体，细胞壁是通过木质化或栓质化加厚而形成的。

管状分子是由薄壁细胞经细胞壁木质化次生加厚形成的，有环纹、网纹和孔纹三种类型。

特性：异质性、嵌合性、变异性
继代培养;固体培养简便易行，但有缺点：
①由于被培养愈伤组织仅一部分和培养基接触，在培养过程中，接触部位的营养物质很快被吸收掉，而从培养基其他区域补充较慢，造成愈伤组织生长不平衡。

②愈伤组织在培养过程中排出的有害物质在培养物附近积累。

③在静止放置情况下，受重力作用和单向受光等因素影响，愈伤组织极易出现极化和分化，产生微管分子和结节等分化细胞，最终难以获得均一的细胞群体。

液体培养的优点：①在液体培养基中愈伤组织一手营养均衡，易获得均一的细胞群体；②愈伤组织块在液体震荡培养中会分裂成更小的细胞团或单细胞，因而产生更大的吸收表面积。

在液体培养基中，体细胞胚胎发生比固体培养基更容易。

被子植物对愈伤组织的诱导较敏感；双子叶植物比单子叶植物容易诱导成功；草本植物比木本植物易产生愈伤组织及进行其后的形态建成。

极性：在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。

造成了细胞内生活物质的定向和定位。

1.生长素：IAA NAA IBA 2-4D
2.细胞分裂素：KP ZP玉米素6-BA 促进细胞分裂
调节作用发生在有丝分裂准备期，即G2期。

3.脱落酸：ABA 低水平的ABA有利于胚性愈伤组织的形成。

ABA的效应与外植体的发育时期有关。

4.乙烯：Eth乙烯抑制剂可促进高度胚性愈伤组织的形成。

培养条件的影响 P48
器官发生：植物根、茎、叶、花、果实等器官的分化与形成。

生长素和细胞分裂素之间的平衡控制器官发生。

发生方式：直接发生途径：直接产生不定芽。

间接发生途径：先产生愈伤组织生长中心形成器官原基及器官形成。

影响器官发生的因素：
体细胞胚胎：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。

（SE）
①体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚。

②体细胞胚起源于非合子细胞，区别于由受精卵发育而成的合子胚。

③体细胞经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构。

与合子胚区别：①无真正胚柄②子叶常不规范③体积明显小④无明显的休眠期，心形期后可直接分化为植株。

与器官发生的比较：一：体细胞胚最根本特征两极性：即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端；器官发生是单极性的。

二：体细胞胚的维管组织分布是独立的“Y”字形结构，与外植体组织无结构上的联系，出现所谓的生殖隔离现象。

三：由体细胞胚形成的再生植株其遗传性相对稳定，变异性远小于由器官发生途径形成的再生植株。

来源1.直接从外植体上产生体细胞胚（在一定的培养条件下，许多离体培养的植物器官外植体表面已分化细胞脱分化后均可产生胚状体。

）
2.由愈伤组织产生（离体培养时，存在于愈伤组织内部的一些薄壁细胞开始分裂，形成一个球形的分生中心，球形胚进一步发育成心形胚至鱼雷形胚。

）
3.悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生。

4.由悬浮培养中游离的单细胞产生。

5.由单倍体细胞产生。

影响体细胞胚发生因素（1）氮源（2）生长素（3）组织起源P54
人工种子技术：通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚胎或胚芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒。

结构：1体细胞胚：胚状体、愈伤原球茎、不定芽、顶芽、腋芽
2人工胚乳：养分 3人工种皮：防机械损伤、保护、干燥
意义：1）人工种子能代替试管苗的快速繁殖，体细胞胚具有数量多、繁殖快、结构完整的特点。

2）体细胞胚是由无性繁殖体系产生的。

固定杂种优势。

3）使自然条件下不结实或种子生产成本昂贵的植物得以繁殖。

4）可以加入植物激素及有益微生物或抗虫、抗病农药，而赋予人工种子比自然种子更优越的特性。

控制胚性细胞同步化的方法：1.抑制剂法促进细胞同步分裂
2.低温处理促进细胞同步分裂
3.渗透压控制同步化法
4.同步胚的分段收集筛选法
5.通气法
问题：①高频诱导②可能发生变异③人工种皮还存在缺陷
④储存、发芽技术不够成熟⑤工厂化生产配套设施成本过高
2、愈伤组织的形成大致可分为几个时期？各有何特点？
答：（1）启动期(诱导期)：主要是指细胞准备分裂的时期,需要采用合适的诱导剂,如NAA(萘乙酸)、IAA（吲哚乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等或细胞分裂素。

特征：距伤口较近的薄壁细胞略有增大，细胞质开始增多，相应的液泡缩小，核变大，呈球形，并由细胞边沿向中央移动；核仁明显变大，RNA含量增加，细胞恢复到具有分裂能力的状态，进入分裂的准备阶段，开始脱分化。

（2）分裂期：进入分裂期就是脱分化的完成，同时也是再分化的开始。

特征：被启动的细胞全面地进行活跃分裂。

启动分裂的细胞体积变小，细胞内有旺盛的物质合成，并逐渐恢复到分生组织状态。

如果此时经常更换培养液，愈伤组织就可以无限制地进行分裂而维持不分化状态。

（3）分化期（形成期）：细胞内部开始发生一系列形态和生理的变化，分化出形态和功能不同的细胞。

特征：这一时期与分裂期没有明显界限，一方面细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，另一方面细胞开始再分化。

3.愈伤组织有何生长特征？
答：1、愈伤组织的类型：根据组织学外观特征及其再生方式分为：
胚性愈伤组织（EC）：质地较坚实，颜色有乳白或黄色，表面具有球形颗粒，生长缓慢。

又可分为：致密型、易碎型。

非胚性愈伤组织（NEC）：松疏易碎，颜色有黄色或褐色，表面粗糙，生长迅速。

一般只有胚性愈伤组织有再生能力。

某些植物的非胚性愈伤组织经适当继代培养可转变为胚性愈伤组织。

5、培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？
（1）有直接发生与间接发生两种途径。

（2）影响其发生的因素有：1、外源激素的影响
2、物理因素：光照、温度
3、外植体的生理状态
4、培养物的年龄
8、影响器官发生的主要因素有哪些？
答:1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态
4、培养物的年龄
9、何谓胚状体？胚状体与合子胚有何异同？
答：胚状体离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。

异同：细胞胚具有两极性，而器官发生是单极的。

细胞胚维管组织分布是独立的Y字形结构，形成的再生植株遗传性比器官发生的稳定。

10、离体培养条件下，胚状体的产生有几种方式？
答：（1）、直接从外植体上产生体细胞胚由愈伤组织产生（2）悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生（3）有悬浮培养中游离的单细胞产生（4）由单倍体细胞产生
第四章离体无性繁殖
离体无性繁殖：是指在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。

意义：
（1）利用较少的植物材料，在无菌和人工控制条件下，不受季节限制在有限空间内实现规模化连续生产，繁殖周期短、速度快，节约大量的土地和人力资源。

（2）与脱病毒技术相结合，可以为生产上提供健康无病毒植株。

（3）繁殖苗体积微小、不携带病原菌，便于储运和种质材料交换。

（4）保持优良性状。

类型 1.腋生枝型：指在离体条件下利用外植体上已有的顶芽和腋芽诱导其发育成枝并培养成苗的繁殖方式。

2．不定芽型：指利用外植体上形成的不定芽培养成苗的繁殖方式。

3.体细胞胚型：指通过离体外植体培养，诱导胚胎发生形成体细胞胚，再由体细胞胚发育成苗的繁殖方式。

（1）成苗率低（2）胚状体的发生和发育情况极为复杂
（3）再生植株有明显的遗传变异及返幼特性
4.原球茎型：指由外植体培养形成原球茎，通过原球茎进行增殖并培养成苗的方式。

离体无性繁殖的技术 P66生根培养基特点试管苗的特点移栽方法
取材→灭菌→接种→诱导→继代→分化→生根→炼苗
技术问题:1.污染：指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

2.褐变：组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。

3.玻璃化：也称“超水化作用”，是离体培养过程中试管苗发生的形态、生理和代谢异常的现象。

P69 玻璃化特点防止方法光自养培养P70
茎尖和根尖分生组织病毒含量低的原因：
（1）分生细胞构成，无维束管，胞间连丝也不发达，病毒很难进入。

（2）分生细胞不断进行活跃的分裂增殖，消耗大量的能量，代谢旺盛，能抑制病毒的复制
（3）茎尖和根尖中内源激素浓度水平较高，抑制了病毒的复制
（4）可能跟RNA干扰有关二脱病毒的方法及原理1.物理方法：不能杀死病毒。

如热处理、低温处理。

2.化学方法：主要是抑制细胞分裂
3.生物学方法：
茎尖分生组织培养：
（1）茎尖分生组织;茎尖最幼龄叶原基上方的由2或3层分生细胞组成的很小区域，一般最大直径不超过0.1mm，长度约0.25mm，最小茎尖长度仅有几十微米。

这一区
域通常不含病毒，取这个组织进行培养可获得无病毒植株。

（2）供体选择：a：实用性和典型性 b：健康，病感程度轻的植株 c：生理状态和部位（3）茎尖分生组织的分离：茎尖大小的选择要兼顾脱毒率和成活率两方面。

三植物病毒的检测及无病毒苗的保存和繁殖
1.指示植物检测法：指示植物指对某一种或某一类病毒非常敏感的植物。

病毒的鉴定
工作必须在防虫网室内进行。

对于主要通过汁液传染的病毒可采用汁液感染法来检测。

2.血清学检测法：利用抗体和抗原在体外的特异性结合进行病毒检测的方法。

基本程序包括：抗原制备、抗血清制备和病毒鉴定三步。

P77
3.分子生物学检测法：通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。

二：植物离体无性繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。

1.周期短，便于控制培养条件。

繁殖速度快，经济效益高。

2.占用空间小，不受地区、季节限制。

3.繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。

4.利物保持原来品种的特性。

三：离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有哪几种？各有何特点？离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有 4种。

1腋生枝型特点（1）繁殖率高（2）能保持植物遗传稳定性（3）可缩短林木繁殖周期。

2不定芽型特点：（1）繁殖率非常高，但繁殖速度较慢；（2）遗传性稳定。

3胚状体发生型
特点：（1）胚状体发生数量多，速度快，结构完整，繁殖系数高；（2）遗传性稳定。

4原球茎型是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官，可萌发成苗。

四：离体无性繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。

离体无性繁殖一般可分为5个阶段。

1、植株的准备：供体植株应生长旺盛、健壮、不病虫害，并尽可能生长在干净的环境中。

2、无菌培养物的建立：获得无菌材料并诱导外植体生长和发育。

包括从供体植株上采取外植体进行消毒、接种及启动外植体生长等程序。

3、培养物的增殖：通过反复培养使第一阶段获得的数量有限的嫩枝、芽苗、胚状体或原球茎等培养物的总量增加。

4、生根培养：将增殖阶段形成的无根芽苗转移到生根培养基上诱导产生不定根，获得健壮的具有根、芽、茎的完整小植株。

5、试管苗的移栽及鉴定：移栽是将具根试管苗转移到土壤中的过程，是试管苗从离体培养逐步适应温室或田间生长环境的过程。

六：离体繁殖中常见得技术问题有哪些? 如何克服或防止其发生？污染问题和褐变、玻璃化污染问题预防措施１、通风２、去湿３、光照４、防霉5、改进外植体消毒方法或使用抗生素等。

褐变防治措施1、选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。

2、合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度和光照、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

3、使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等。

4、使用吸附剂：使用聚乙烯基吡咯烷酮、0.1%-0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

玻璃化防治措施
1、降低细胞分裂素的浓度，调节激素配合
2、增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的渗透势。

3、降低氨态氮，提高硝态氮的含量
4、增加容器的气体交换，降低容器内相对湿度
5、降低培养温度，增加自然光照
6、在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂等物质。

九、脱除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？物理方法（1）、高温处理又称热疗法原理:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40 ℃)即钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害. (2)、低温处理又称冷冻疗法原理：降低温度能使病毒活力下降。

化学处理 (1).病毒抗血清预处理：用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。

(2).RNA抑制剂处理：烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。

放线菌D和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。

（3）.三氯唑核苷：病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-β-D-呋喃核苷，防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。

生物脱毒方法（原理：培养材料中通常不含病毒，可通过植物组织培养就行脱毒）（1）、茎尖分生组织培养（2）、微体嫁接脱毒（3）、愈伤组织培养脱毒（4）、珠心胚培养脱毒（5）、花药培养脱毒
十：简述通过茎尖分生组织培养脱除植物病毒的一般程序选取感病程度轻的植株→分离大小合适的茎尖分生组织→茎尖分生组织培养→病毒检验
十二：无病毒植物的检测方法有哪些？（1）、直接检测法:直接观察（2）、电镜检测法 3 ）、指示植物法（4）、血清学检测法（5）、分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术
第五章
1.植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。

2.植物单细胞分离：由完整的植物器官中分离单细胞
机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。

①细胞不受到酶的伤害；②不用质壁分离；③细胞产量低；④细胞易破。

酶解法：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。

①细胞受到酶的伤害；②要质壁分离；③细胞产量高；④细胞不易破由培养组织分离单细胞：从培养的未分化的且疏松易碎的愈伤组织中分离单细胞
3．植物单细胞的培养技术：
平板培养：植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。

看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持
续分裂和增殖的培养方法。

饲养层培养用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培
养的细胞，使其分裂和生长。

液体浅层静置培养法：将一定密度悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层封口静止培养。

细胞悬浮培养法：细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。

微室培养：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法
4.植物细胞的大规模培养（p89-p95）悬浮培养：分批培养，连续培养，半连续培养固定化培养：包埋法，吸附法植物细胞大规模悬浮培养的优点1）可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养吸收。

2）可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害。

3）保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果
细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期，使细胞保持相对一致的细胞学和生理学状态，便于研究细胞分裂和细胞代谢。

细胞固定化:将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。

细胞固定化意义1）细细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。

2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。

3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。

4）有利于进行连续培养和生物转化。

5.影响次生代谢产物的因素1）生物因素：细胞株，细胞凋亡，细胞团，生物合成机制2）化学因素：营养盐，前体，诱导子，反馈抑制3）物理因素：光照，温度，PH4）工程技术问题：培养液的流变特性，气体传递，搅拌与剪切力，泡沫与器壁表面粘附性P92 细胞生长量的计算。