感受态细胞制备
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理是通过采用特定的培养条件和处理方法，使细胞转变为感受态细胞。
感受态细胞与其它类型的细胞相比，具有更特殊的功能和形态。
首先，制备感受态细胞通常需要选择合适的细胞系或细胞株作为起始材料。
这些细胞通常具有一定的可塑性和多能性，可以通过适当的诱导和处理转变为感受态细胞。
其次，制备感受态细胞需要提供一系列的培养条件，以满足细胞生长和分化的需要。
这包括提供适当的培养基组成、生长因子、细胞外基质支持等。
适当的培养条件可以促进细胞内信号传导途径的激活，从而触发感受态细胞的形成。
另外，制备感受态细胞的过程中还需要使用一些特定的诱导因子或化合物。
这些诱导因子可以通过激活或抑制特定的信号通路，调节细胞的基因表达和功能，从而诱导细胞转变为感受态细胞。
最后，制备感受态细胞还需要进行一系列的分析和鉴定，以确定细胞是否成功转化为目标细胞。
这包括检测特定标志物的表达、观察细胞形态学的改变、进行功能性实验等。
总之，制备感受态细胞的原理是通过选择合适的起始材料、提供适宜的培养条件、使用特定的诱导因子以及进行分析鉴定等步骤，将细胞转变为目标的感受态细胞。
这个过程涉及到多个层面的调控和影响，需要综合考虑细胞的内外环境因素。
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。
4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。
4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备（Hanahan法）什么是感受态细胞？野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。
那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
制备的关键因素：1.所用转化缓冲液的试剂纯度用高纯度的水和二甲亚砜（DMSO）制备感受态细胞是最重要的，包括细菌培养基在内的某些试剂会随着储存期的延长而降低效能。
无论何时，尽可能用新买的试剂和生长培养基。
2.细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得的，因此，不应该使用在实验室连续传代或存放于4℃或室温的培养物。
3.玻璃和塑料器皿的清洁微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅的降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（Mini-Q 或相当的水）充满，再经高温高压消毒。
水在玻璃器皿使用前应倒掉。
注意：很多手工操作后用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗涤剂的。
材料缓冲液和溶液二甲亚砜DMSODnD溶液（DMSO和DTT）DTT（二硫苏糖醇）1.53gDMSO 9ml1mol/L乙酸甲（PH7.5）100μl 加水补至10mlDnD溶液可用耐受有机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。
转化缓冲液标准的转化缓冲液（TFB）现用现配。
冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞培养基SOB琼脂板含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁和适量的抗菌素SOB培养基含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁SOC培养基每次转化反应需要1ml的SOC培养基核酸和寡核苷酸质粒DNA（重组质粒）离心机和转头Sorvall GSA转头或与之相当的转头专用设备液氮预冷的聚丙烯离心管（50ml）预冷的聚丙烯离心管（17*100mm；Falcom2059）预置的40℃水浴载体和菌种冻存的做转化用的大肠杆菌（该菌种需在-70℃下保存）方法和步骤（重要：本方案中的所有步骤均应在无菌条件下进行）细胞制备1.转化缓冲液的制备若制备立即使用的感受态细胞可用FTB。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
感受态细胞的制备过程
感受态细胞的制备感受态细胞也叫敏感细胞，它的细胞壁通透性增大，外界物质容易感染进去细胞体里。
目前常用感受态细胞（大肠杆菌）转染质粒载体，而感受态细胞的制备通常是利用0.1M的CaCL来处理，从而让大肠杆菌的细胞壁的通透性增大。
以下为制备感受态细胞的过程：一、试剂：Bacto tryptone (SIGMA Lot. 10k0202)Bacto Yeast Extract (SIGMA Lot. 60k0044)KCL (SIGMA Lot. 129h0080)NaCL (GB 1266-86 AR 广东台山粤侨化工厂)NaOH (GB/T629-1997 AR 广州化学试剂厂)MgSO4.7H2O (GB/T671-1998 AR 广州化学试剂厂)CaCL2（HGB3208-60 AR 广东西陇化工厂）甘油 99+% （SIGMA Lot. 119h0206）二、玻璃器皿：2000ml烧杯（1个）、1000ml量筒（1个）、2.8L三角培养瓶（2个）2L三角培养瓶（3个）、250ml离心管（12个）、试剂瓶（3个）、100ml量筒（1个）、75%酒精棉球三、前处理：配制1N的NaOH与10%SDS（十二烷基苯磺酸钠），对于实验过程中所有用到的玻璃器皿都用1N的NaOH进行泡洗，然后用自来水清洗干净NaOH,再用10%SDS清洗，最后用自来水冲洗7-8遍，并用ddH2O清洗3遍。
四、SOB培养基配方及配制：在本实验中，对于NaCL与KCL、Mg2+等不用母液加，是因为考虑到母液是以前配制，瓶子以及水等都没处理好，故在此实验中是以固体状加进去。
用NaOH调PH7.0，然后定容至3000ml，取40ml培养基装到100ml小三角瓶里作种子液用，其它分装到大三角瓶里（750ml/瓶），称重量并标志。
于1210C灭菌40min。
等温度冷却下来后，对试剂与培养基都进行称重，根据重量差进行补水（灭菌）。
21、1M CaCL2的配制（500ml）：称取CaCL255.49g，溶于ddH2O,定容至500ml，再于0.22μ滤膜上过滤除杂质。
感受态细胞制备实验报告
感受态细胞制备实验报告摘要本实验旨在探究感受态细胞的制备方法。
通过一系列步骤，我们成功地制备出感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
实验结果表明，我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。
介绍感受态细胞是一种具有感受外界刺激并做出相应反应的细胞。
在生物学研究中，制备感受态细胞是一项重要的实验工作。
本文将详细介绍感受态细胞的制备方法，并通过实验证实其有效性。
实验材料和方法材料•细胞培养基•细胞培养器具（培养皿、离心管等）•细胞培养箱•细胞染色剂方法1.细胞培养基的制备：–将适量的细胞培养基粉末加入无菌蒸馏水中，并充分搅拌溶解。
–调整pH值至合适范围。
–通过过滤器过滤，获得无菌的细胞培养基。
2.细胞的预处理：–选择适宜的细胞系，如人类上皮细胞系。
–将细胞培养在培养皿中，以适宜的温度和湿度进行培养。
–在细胞生长到合适密度时，进行下一步操作。
3.细胞的感受态诱导：–将培养皿中的细胞用无菌PBS缓冲液洗涤一次，以去除培养基中的成分。
–加入含有感受态诱导剂的培养基。
–将培养皿置于细胞培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间。
4.细胞的染色实验：–取出培养皿中的细胞，用PBS缓冲液洗涤去除培养基。
–按照染色剂使用说明，加入合适浓度的染色剂。
–在暗处孵育一定时间，使细胞充分染色。
–用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除多余的染色剂。
–观察细胞染色情况，使用显微镜拍摄图像。
结果与讨论经过以上步骤，我们成功地制备了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
观察到染色后的细胞明显显示出感受态特征，与对照组相比，表现出明显的区别。
这说明我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。
通过本实验，我们对感受态细胞的制备方法有了更深入的了解。
然而，还需要进一步的研究来探究感受态细胞的特性以及其在生物学研究中的应用。
此外，我们也可以尝试其他方法来制备感受态细胞，以寻求更高效的制备方法。
结论本实验通过一系列步骤成功地制备出了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株
连接产物的转化效率
转化效率
指单位质量的感受态细胞转化后，能够成功克隆的重组子数量。
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如感受态细胞的制备方法、连接产物的质量和浓度、转化条件等。为了提高转化 效率，需要优化这些因素，并确保感受态细胞的质量和活性。
03 克隆菌株的转化与筛选
转化过程
01
02
03
准备感受态细胞
连接产物浓度
确保连接产物浓度适中，过高或过低都会影响转化效率。
连接产物纯度
去除连接产物中的杂质，如未连接的DNA片段和蛋白质等。
克隆菌株的稳定性与可重复性
克隆稳定性
克隆菌株应稳定，不易发生变异或丢失目的基 因。
可重复性
确保实验结果可重复，避免因菌株变异或其他 未知因素导致的结果不一致。
菌株筛选
对转化后的菌株进行筛选，选择阳性克隆进行后续实验。
优点
方法简单，不需要特殊试剂。
缺点
转化效率相对较低，且不同菌株的感受态制备效果不一致。
人工感受态细胞的制备
人工感受态细胞制备方法
通过化学或电穿孔法处理细菌，使其进入感受态。常用的化学试剂包括CaCl2、DMSO 等。
优点
转化效率高，适用于大多数细菌。
缺点
需要特殊试剂，操作相对复杂。
02 连接产物转化
感受态细胞的制备态细胞的制备 • 连接产物转化 • 克隆菌株的转化与筛选 • 实验注意事项与难点解析
01 感受态细胞的制备
自然感受态细胞的制备
自然感受态细胞制备方法
将细菌在冰冷的0.1M CaCl2溶液中洗涤并悬浮，然后在42℃下热 激处理，使细菌进入感受态。
将细菌培养至对数生长期， 离心收集并用冰冷的0.1M CaCl2洗涤。
感受态实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解感受态细胞的制备方法。
2. 掌握感受态实验的基本原理和操作步骤。
3. 学习感受态细胞在基因工程中的应用。
二、实验原理感受态细胞是指对DNA分子具有高亲和力和吸收能力的细胞。
在基因工程中，利用感受态细胞将外源DNA分子导入细胞内，是构建基因表达载体、基因克隆等实验的重要步骤。
感受态细胞的制备方法有化学法和电击法等。
三、实验材料1. 细菌：大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株。
2. 质粒：pUC19载体。
3. 试剂：CaCl2、琼脂糖、DNA分子、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。
4. 仪器：电热恒温培养箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、移液器、无菌操作台等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α菌株在LB液体培养基中培养过夜。
（2）次日，将过夜培养的细菌按照1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养2小时。
（3）将培养好的细菌在冰浴中冷却5分钟。
（4）向冷却后的细菌中加入1ml的CaCl2溶液，混匀。
（5）将混匀后的细菌在冰浴中继续冷却30分钟。
2. 感受态实验（1）将质粒pUC19在限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切，回收酶切片段。
（2）将回收的酶切片段与T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。
（3）将连接好的DNA分子转化感受态细胞。
（4）将转化后的细胞在37℃恒温培养箱中培养1小时。
（5）将培养好的细胞涂布在含有氨苄西林的LB琼脂糖平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。
（6）观察菌落生长情况，挑取白色菌落进行PCR验证。
五、实验结果与分析1. 感受态细胞制备成功，细菌在LB琼脂糖平板上生长良好。
2. 转化后的细胞在氨苄西林平板上生长出白色菌落，说明转化成功。
3. PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因，验证转化成功。
六、实验讨论1. 感受态细胞的制备过程中，冰浴和CaCl2溶液的使用是关键步骤，有助于提高转化效率。
感受态细胞制备的方法
感受态细胞制备的方法
感受态细胞的制备方法有多种，其中一种常用的方法是通过转染的方式将特定的基因（例如感受器基因）导入目标细胞中，从而使得这些细胞能够表达特定的感受器或相关蛋白。
这种方法可以使用病毒载体、质粒转染等多种技术实现。
感受态细胞的制备主要有以下步骤：
1. 获取目标细胞：从人体组织或动物模型中获取需要制备感受态细胞的细胞。
2. 选择合适的载体：根据研究需要选择适合的载体，如病毒载体或质粒。
3. 构建转染载体：将目标基因插入到载体中，构建转染载体。
4. 转染目标细胞：将转染载体导入目标细胞中，使其表达特定的感受器或相关蛋白。
5. 筛选稳定表达细胞：通过特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
6. 验证感受态细胞的功能：通过功能实验等方法验证感受态细胞的功能。
感受态细胞制备的方法可以提供研究人员一个有效的工具，用于研究特定感受器或相关蛋白在生物体内的功能和调控机制。
这些细胞可以用于药物筛选、疾病研究和基因治疗等领域，有助于深入了解感受机制，并为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和途径。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备一、准备工作所有试剂、容器均需提早预冷。
1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头与200μl枪头各一盒。
2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）① LB平板：单纯LB平板，加有amp或者有kana的（制板时需标注好类型，时间）。
② SOB培养基（Super Optimal Broth）③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl20.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油与85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃储存，使用前务必预冷。
（装在50ml离心管，封口4度储存）④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油与17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前务必预冷。
配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。
（50ml离心管分装）在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。
（50ml离心管分装）在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。
感受态细胞制备原理
感受态细胞制备原理
感受态细胞（Acceptablecell）又称转基因细胞、外源DNA转化细胞，是指外源基因与宿主基因组结合并在宿主细胞内稳定表达的细胞。
根据其来源的不同，可分为外源基因在大肠杆菌中表达的感受态细胞和质粒在酵母中表达的感受态细胞。
外源DNA进入细胞后，首先与细胞核内的DNA聚合酶结合，使DNA聚合酶分子分解成单链，然后由DNA聚合酶催化单链复制形成双链DNA分子。
在这一过程中，DNA聚合酶活性与病毒颗粒的基因片段大小相关。
当感受态细胞将外源DNA 导入到受体细胞后，它们与受体细胞内的DNA聚合酶和DNA 聚合酶复合体结合，从而使载体上的目的基因片段得以复制和表达。
当质粒上的目的基因被整合到受体细胞基因组中时，目的基因被激活。
当感受态细胞与受体细胞融合后，被激活的目的基因便会在受体细胞中以单拷贝形式表达出来。
因此，感受态细胞对目的基因有较强的选择压力，在表达过程中会筛选出最具表达潜力的部分。
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制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
感受态细胞制备流程
感受态细胞制备流程感受态细胞制备流程，这是一个非常复杂和精确的过程，涉及到许多实验室技术和设备。
感受态细胞是指在特定的刺激下，可以触发细胞产生反应的细胞状态。
感受态细胞的制备可以用于研究许多生物学过程，如细胞信号传导、疾病机制等。
下面是一个常见的感受态细胞制备的流程：1.细胞培养首先，需要准备细胞培养基和细胞培养器皿。
细胞培养基是提供营养物质和条件来维持细胞生长和增殖的液体。
培养器皿选择取决于所使用的细胞类型和实验的要求。
然后，将细胞接种到培养器皿中，并在恒定的温度和湿度下进行培养。
2.细胞处理一旦细胞生长到足够数量，可以开始进行细胞处理。
这可以包括刺激细胞，例如添加化学物质、压力或温度变化。
刺激过程需要精确控制，以确保得到一致的结果。
3.细胞取样在细胞处理后，需要进行细胞取样。
这可以通过用吸管或毛细管吸取细胞悬浮液来实现。
取样过程需要快速和准确，以确保细胞状态的准确性。
4.细胞固定取样后，细胞需要固定以保持其形态和结构。
常用的细胞固定方法包括用甲醛或乙醛等化合物进行固定。
细胞固定可以帮助保留细胞结构和细胞内分子，以便后续的染色或分析。
5.染色和标记对固定的细胞进行染色或标记是感受态细胞制备的关键步骤。
染色和标记可以使用各种荧光染料或抗体来实现。
这可以通过将染料或抗体直接添加到细胞上，或使用转染技术将其引入细胞内。
6.显微镜观察完成染色和标记后，可以使用显微镜来观察细胞。
显微镜观察可以提供关于细胞形态和结构的信息，并且可以检测到染色或标记物的荧光。
这可以帮助研究人员获得有关感受态细胞的更多信息。
7.数据分析和解读最后，需要对得到的数据进行分析和解读。
这可能涉及到图像处理、统计学方法和生物学解释等。
数据分析和解读的目的是从实验结果中提取有意义的信息，并为后续的研究和应用做出贡献。
感受态细胞制备的流程是一个需要仔细和精确操作的过程。
任何一个步骤的错误或偏差都可能导致不准确的结果。
因此，研究人员需要具备高度的实验技能和实验室安全意识。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态，可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。
以下是一种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 培养细胞：选择需要研究的感受态细胞类型，如神经元、免疫细胞等，在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。
2. 刺激处理：给予细胞一定的外界刺激，如药物、光刺激、温度变化等。
刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。
3. 收集细胞：在刺激处理后，收集细胞，可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。
4. 提取RNA或蛋白质：利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质，用于后续分析。
5. 分析感受态：通过各种分析方法，如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。
感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异，因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
（写作参考：）。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10mllb液体培养基的50ml离心管中。
（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000mllb液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次od，当od值达到0.3-0.4时，停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。
离心5分钟后，向杯中加入少量H2O，然后以4000转/分的转速悬浮。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油,4℃,4000rpm,离心10min。
8.丢弃上清液，向每个离心杯中加入5毫升10%甘油，以暂停沉淀，然后将细菌溶液分装在1.5毫升离心管中，每管300微升，并储存在-80℃的冰箱中。
同时取100μL主管态加0.01ngpuc18直接电穿孔转化检测转化效率。
9.次日观察转化子生长情况，并记录。
二、连接产物纯化1.将连接产品转移至1.5毫米彭多夫管中，并添加以下试剂：10μlofddh2o2μlof3mnaac（ph5.2）50μl无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，topspeed离心30分钟；3.小心清除上清液，避免接触管道底部的沉淀物；4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，topspeed离心5分钟；6.小心地去除上清液，并将Eppendorf管置于空气中，直到没有乙醇气味；7.将10μLddh2o重新溶解和沉淀，并在4℃下短期储存，在-20℃下长期储存；3、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1μL纯化质粒置于1.5ml离心管中，用0.1cm电极杯冰上预冷。
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感受态细胞制备
实验目的
1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；
2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；
3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。
实验原理
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的
状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态, 如大肠杆菌。
大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶
液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗
DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时
间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
对这种现象的一种解释是CaCI2 能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化
学法高出1 到2 个数量级，达到1x108转化子每1 卩gDNA甚至1x109转化子每1卩gDNA所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围
广，感受态细菌可以在-70 C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
物理制备法：
电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109〜1010转化子/卩g 闭环DNA因操作简便，愈来愈为人们所接受。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化率（转化子数/每卩g质粒DNA =转化子总数/ 质粒DNA加入量（卩g）
理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数
为1*10 10
实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB 液体培养基、
实验试剂：溶液、含10%甘油的溶液、GYT三蒸水、10% 甘油的水
、实验材料
溶液、DH5a TopIO、DE3 BL21、液氮、冰水。
实验步骤(一)化学感受态细胞的制备
(1)菌种的活化：取-70 C的冰箱中感受态细胞DH5%、
Top10、DE3 BL21在LB的平板上进行划线分离。
(2)菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落，接种于10mlLB液体培养基中，37C振荡培养过夜至对数生长中后期。
(3)菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100 的比例分别接种于四个不含有抗生100mlLB液体培养基锥形瓶中,37 C振荡培养大约小时至OD=~。
( 4)感受态细胞的制备：
①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。
把100mL培养液均匀分成两份到50mL离心管中，在4C、3000转每分钟，离心
10min。
②弃去上清液，加入的CaCb溶液，轻轻混匀，在冰水中静置
30min。
③弃去上清液，加入的CaCl2 溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min。
④从冰水中取出4C、3000转每分钟，离心10min,弃去上清液并
用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净，加入含10% 甘油的溶液。
用
巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。
⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好离心管，用
剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装
40 Z悬浮液。
⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到
标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70 C保存。
（二）电转化的感受态细胞的制备
第1、2、3 步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3 三步相同。
（4）制备感受态细：
①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。
把100mL 培养液
均匀分成两份到50mL离心管中，在4C、3000转每分钟，离心
10min。
②弃去上清液，加入30mL三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离
心管壁上使沉淀充分混匀，在4 C、3000转每分钟下离心10mi n,倒去上清。
重复两次；
③再加入30mL含10%甘油水溶液，在4C、3000转每
分钟下离心10mi n,重复一次。
④弃去上清液，加入（含有
10%Glysiron 、%YeastExtraction 、%Trypton) ，放置在冰
上。
(5)准备好成有液氮的塑料盒子和把离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中，每管40 u l，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70 C保存。
三)效价检测
1、化学转化：
(1)取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。
(2)在含有40u l 感受态细胞的离心管中加入1u L
稀释后的标准质粒充分混匀。
冰上静置30min。
(3)将离心管置于42 C干式恒温器上90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却2〜3min。
(4)向离心管中加入已预
热的无菌LB培养液400卩L, 再转移到10ml离心管中，37C恒温振荡培养45〜60min。
(5)将离心管内容物混匀，分别吸取卩L和110 u L 菌液于含有AMP勺LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到液体被吸收，倒置平板，在37 C过夜培养，然后通过菌落数计算效价。
2、电转化:
( 1 )取电转化感受态细胞于冰上解冻，, 标准质粒也
置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。
(2)在含有40卩l感受态细胞的离心管中加入1卩L
稀释十倍的标准质粒，充分混匀。
然后转移到电击杯中，把电击杯放在电击仪上进行电击( 2500V，5ms)。
(3)在电击杯中加入160卩L无菌LB培养液(无抗生素)，
然后充分混匀，吸取于10ml离心管中，置于37C恒温振荡器中培
养45〜60min.
(4)分别取2卩L和50卩L涂板，涂板操作同化学转化。
(5)平板放到37 C的恒温培养箱过夜培养。
第二天早上读取
两个平板的菌落数。
四、实验结果
1、电转化感受态细胞的效价：涂2卩L菌液的平板上菌落数
为88 个，通过计算知道，电转化感受态细胞的效价为x 108。
2、化学转化感受态细胞的效价：无菌落生成，同组的也没有出
来结果。
五、讨论
1、感受态细胞制备及转化中的影响因素
①细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从—70C或-20 C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的
0D600来控制。
密度过高或不足均会影
响转化效率。
②质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA
转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。
1ng 的标准质粒即可使50卩l 的感受态细胞达到饱和。
一般情况
下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
③试剂的质量:所用的试剂，如CaCb等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
④防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, 枪头等最好是新的, 并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
2、效价检测结果分析：化学转化感受态细胞效价检测结果没有转化成功，而且所有人的结果都没有转化结果，所以造成该结果的可能原因是制备感受态细胞所使用的试剂配制有误。
电化学转化的结果有菌长出，在涂2卩l的菌液的平板上有80个菌落。
标准质粒的浓度为卩l。
使用时稀释十倍。
所以2卩l 的菌液中有的标准质粒。
那么转化率=80/*10 -6=8*108。