感受态细胞制备

感受态细胞制备

实验目的

1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；

2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；

3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。

实验原理

在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的

状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态, 如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶

液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗

DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时

间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCI2 能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化

学法高出1 到2 个数量级，达到1x108转化子每1 卩gDNA甚至1x109转化子每1卩gDNA所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围

广，感受态细菌可以在-70 C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

物理制备法：

电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109〜1010转化子/卩g 闭环DNA因操作简便，愈来愈为人们所接受。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化率（转化子数/每卩g质粒DNA =转化子总数/ 质粒DNA加入量（卩g）

理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数

为1*10 10

实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB 液体培养基、

实验试剂：溶液、含10%甘油的溶液、GYT三蒸水、10% 甘油的水

、实验材料

溶液、DH5a TopIO、DE3 BL21、液氮、冰水。

实验步骤(一)化学感受态细胞的制备

(1)菌种的活化：取-70 C的冰箱中感受态细胞DH5%、

Top10、DE3 BL21在LB的平板上进行划线分离。

(2)菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落，接种于10mlLB液体培养基中，37C振荡培养过夜至对数生长中后期。(3)菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100 的比例分别接种于四个不含有抗生100mlLB液体培养基锥形瓶中,37 C振荡培养大约小时至OD=~。

( 4)感受态细胞的制备：

①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100mL培养液均匀分成两份到50mL离心管中，在4C、3000转每分钟，离心

10min。

②弃去上清液，加入的CaCb溶液，轻轻混匀，在冰水中静置

30min。

③弃去上清液，加入的CaCl2 溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min。

④从冰水中取出4C、3000转每分钟，离心10min,弃去上清液并

用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净，加入含10% 甘油的溶液。用

巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。

⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好离心管，用

剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装

40 Z悬浮液。

⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到

标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70 C保存。

（二）电转化的感受态细胞的制备

第1、2、3 步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3 三步相同。

（4）制备感受态细：

①把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100mL 培养液

均匀分成两份到50mL离心管中，在4C、3000转每分钟，离心

10min。

②弃去上清液，加入30mL三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离

心管壁上使沉淀充分混匀，在4 C、3000转每分钟下离心10mi n,倒去上清。重复两次；

③再加入30mL含10%甘油水溶液，在4C、3000转每

分钟下离心10mi n,重复一次。

④弃去上清液，加入（含有

10%Glysiron 、%YeastExtraction 、%Trypton) ，放置在冰

上。

(5)准备好成有液氮的塑料盒子和把离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中，每管40 u l，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70 C保存。三)效价检测

1、化学转化：

(1)取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。

(2)在含有40u l 感受态细胞的离心管中加入1u L

稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min。

(3)将离心管置于42 C干式恒温器上90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却2〜3min。

(4)向离心管中加入已预

热的无菌LB培养液400卩L, 再转移到10ml离心管中，37C恒温振荡培养45〜60min。

(5)将离心管内容物混匀，分别吸取卩L和110 u L 菌液于含有AMP勺LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到液体被吸收，倒置平板，在37 C过夜培养，然后通过菌落数计算效价。

2、电转化:

( 1 )取电转化感受态细胞于冰上解冻，, 标准质粒也