第八章 基因重组和杂交育种

通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞 的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性 状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合。 由此法获得的重组子，成为融合子（fusant）。
溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因
组上，而使宿主获得了除免异性外的新遗传性 状的现象，称溶源转变。
一个与转导相似又不同的现象
溶源转变与转导的不同？
a）这是一种不携带任何外源基因的正常时菌体；
b）是嗜菌体的基因内而不是供体菌的基因提供了
宿主的信性状；
c）新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗 传重组形成的稳定转导子；
1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验
通过细胞与细胞的直接接触而产生的
遗传信息的转移和重组过程
Байду номын сангаас间平板上长出的
原养型菌落是两菌 株之间发生了遗传
交换和重组所致！
大肠杆菌的接合机制
接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导
F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛
细胞水平
细胞水平的杂交包含分子水平上的重组。
基因重组是杂交育种的理论基础。在方向性
还是自觉性方面，比诱变育种前进了一大步。且
可消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的 产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育 种手段。
一、原核生物的基因重组
原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。
特点：
① 片段性，仅一小段DNA序列参与重组； ② 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组 向受体基因组）作单方向转移； ③ 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。
真核微生物
Saccharomy cescerevisiae（酿酒酵母）、
Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、 Aspergillusniger（黑曲霉）等。
3. 感受态（competence） 研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。
感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段
并能实现转化的一种生理状态。
调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子。
膜相关DNA结合蛋白（membraneassociated DNA binding protein） 细胞壁自溶素（autolysin） 几个核酸酶
4. 转化因子（transforming principle）
转化因子的本质是离体的DNA片段。一般只有
15kb左右。 在不同的微生物中，转化因子的形式不同。 良好的转化因子有dsDNA（最宜于细胞表面结合）、 ssDNA和质粒DNA，通常不能与核染色体组发生重组。
提高质粒的自然转化效率的二种方法：
1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高； 2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒 转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌—
—重组获救。
（2）人工转化 在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重 组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。 不是由细菌自身的基因所控制； 用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处 于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。 用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。
获得少量酶
细胞分裂
获得外源DNA
不 断 稀 释
DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。
特点：在选择培养基平板上形成微小菌落
DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，
而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。
特点：在选择培养基平板上形成微小菌落
质粒的转化效率高；
6. 转染（transfection） 指用提纯的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其 宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒
后代的现象。
噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒
现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
特点：
提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径 进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。
人工转化（artificial transformation）
2. 转化微生物的种类
原核生物
Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）、 Haemophilus（嗜血杆菌属）、
Bacillus（芽孢杆菌属）、
Neisseria（奈瑟氏球菌属）、 Rhizobium（根瘤菌属）、 Staphylococcus（葡萄球菌属）、 Pseudomonas（假单胞菌属）、 Xanthomonas（黄单胞菌属）等。
称转导子（transductant）。
由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：
一个细胞的DNA
通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中
能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA 带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。
细菌转导的二种类型：
完全普遍转导
普遍性转导 流产普遍转导 局限性转导
1.普遍转导（generalized transduction） 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何小 片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体 菌的现象，称为普遍转导。 一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。
指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少 数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整 合、重组，形成转导子的现象。 最初于1954年在E. coliK12中发现。
特点：
① 只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，
一般为噬菌体整合位点两侧的基因；
② 该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带； ③ 缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过 程中，发生低频率（～10-5）“误切”（不正常切离， abnormal excesion）或由于双重溶源菌的裂解而形成； ④ 局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的
b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。
c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染 色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子， 特称为F′因子。 细胞表面同样有性菌毛。
（四）原生质体融合（protoplast fusion）
（1）完全普遍转导 简称普遍转导或完全转导（complete
transduction）。经转导嗜菌体的媒介而获得了供
体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内进行交换、 整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，
称作普遍转导子，这种现象就称普遍转导。
供体菌 Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）
d）获得的性状可随嗜菌体的消失而同时消失；
（三）接合（conjugation，mating）
供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌
性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因
组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，
称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就 是接合子（conjugant）。
转染
转化
把重组噬菌体或重组病 毒DNA引入受体细胞
以质粒为载体的重组DNA 分子引入受体细胞
（二）转导（transduction）
通过缺陷噬菌体（defective phage）的媒介， 把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过 交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现 象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，就
感受态细胞（competent cell）具有摄取外源
DNA能力的细胞。
自然感受态
是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；
人工感受态
则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力， 或人为地将DNA导入细胞内。
（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）
感受态受遗传控制，但也存在个体差异。 感受态出现的时间不同； 感受态细胞所占比例和维持时间不同； 外界环境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2＋等对 感受态也有重要影响。
转化的频率通常为0.1％～1.0％，最高为20％。
能发生转化的最低DNA浓度极低，为化学方法无法 测出的1×10－5mg／mL（即1×10－11g／mL ）。
5. 转化过程 （1）自然遗传转化（简称自然转化）
1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象，转化过程研究得较深入的就
是这种G＋细菌。
目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
①建立了感受态的受体细胞 ②外源游离DNA分子
枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）
strS，有链霉素敏感型基因标记
strR，存在抗链霉素的基因标记
自然转化过程的特点：
a）对核酸酶敏感； b）不需要活的DNA给体细胞； c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化 （DNA）供体菌和受体菌之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；
普遍性转导的三种后果：
转导DNA不能进行重组和复制，但其
携带的基因可经过转录而得到表达。 进入受体的外源DNA通过 与细胞染色体的重组交换 而形成稳定的转导子。
流产转导（abortive transduction）
外源DNA被降解，转导失败。
2.局限转导（specialized transduction， restricted transduction）
（2）流产普遍转导 简称流产转导（abortive transduction）。经转 导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外
源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消