根系分泌物提取

方法二：马尾松根系分泌物的鉴定及化感作用段剑

1、根系分泌物的提取分离

采用两种不同的试剂进行浸提，通过GC-MS进行物质鉴定，得出适宜马尾松根系分泌物的提取方法。

方法一：分别取马尾松、枫香根际土壤于有盖玻璃瓶中，按1：3的比例加入85% 的乙醇，至于20℃磁力搅拌器，2600rpm浸提24h。再置于20℃高速离心仪中，3500rpm旋转15min。离心后上清液，置于旋转蒸发仪脱去浸提剂，用乙酸乙酯（1：1）萃取2次，乙酸乙酯相为中性组分；再用1mol/L的HCl将水相的pH 值调至3.0后，再用等量的乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯相为酸性组分；再用1mol/L的NaOH将水相pH值调至8.0，再用等量的乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯相为碱性组分。合并酸、中、碱性乙酸乙酯相，即为马尾松、枫香根系分泌物提取液。

方法二：分别取马尾松、枫香根际土壤置于有盖玻璃瓶中，按1：3的比例加入20%乙酸乙酯，置于20℃磁力搅拌器中，2600rpm浸提24h。再置于20℃高速离心仪中，3500rpm旋转15min。离心后的上清液，即为马尾松、枫香根系分泌物提取液。

2、根系分泌的鉴定

将上述两种浸提方式得到的马尾松、枫香根系分泌物提取液，35℃真空旋转蒸发仪浓缩至1ml，无水硫酸钠脱水后，供GC-MS测试分析。

检测仪器为GC-MS Agilent-6890N/59731（美国安捷仑公司），

色谱条件：色谱柱（Agilent 122-3832）：30m×0.25mm×0.25um，DB-35ms；

进样口温度250℃；程序升温：柱温70℃（2min），以10℃﹒min-1升温至280℃，20min；载气：He；流速：1.0ml﹒min-1。

质谱条件：EI源（电子轰击源）；轰击电压：70eV；离子源温度：230℃；扫描范围m/z：35-500amu；扫描速度0.2s扫全程；检测器电压500V；电流350uA；四级杆温度：150℃；溶剂延迟时间3.0min；进样量：1.0uL；不分流进样。GC-MS 数据应用标准质谱谱库NIST02获得，采用面积归一化法计算各类物质的相对含量。

方法三：烤烟根系分泌物的研究高欣欣

1、具体方法为：取定量过滤后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为中性组分；将剩余水相用1M HCl调节pH至2后，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为酸性组分；将剩余水相再用1M NaOH 调节pH 为8，用乙：酯萃取，得到乙酸乙酯相为碱性组分，将酸性、碱性和中性乙酸乙酯萃取液分别减压浓缩至1ml（45℃），过0.45μm 滤膜。

2、根系分泌物的硅烷化处理

利用常文理于1990 年提出的方法，将乙酸乙酯萃取后的上述浓缩样品中分别加入0.25mL 硅烷化试剂（BSTFA:TMC=5:1），加盖密封后于80℃水浴中衍生 2 h，待测。

原因是什么

3、GC-MS 分析条件

经硅烷化处理后的各组分根系分泌物采用Agilent7890A-5975C 进行仪器分析测定。毛细管柱采用HP-5MS柱（30m×0.25mm×0.25μm），进样口温度为250℃，升温程序为50℃（2min），以6 ℃/min程序升温至250℃（保持15min）。载气为He，流量1ml/min，进样量为1μl，离子源温度230℃，轰击电压70eV。应用NIST98 质谱数据库，分析质谱图，确定物质组成。

方法四：刺槐根系分泌物的研究石鑫

第一种提取办法是参考了尹玉莲等人对橡胶树以及王晗光等人对巨桉根系分泌物测定时的超声浸提法。此办法操作较为简单,只需要将过筛后的土壤放入具塞锥形瓶中,加入正己垸到完全淹没土样,再超声浸提20-30min,过0.45um微孔滤膜,将过滤的溶液在35℃条件下旋转浓缩至2mL,即得到根系分泌物的待测液(尹玉莲等,2008;王晗光等,2009)。

第二种是三性萃取法,该方法参考了张汝民等对梭梭的根系分泌物提取的经验。首先取根系土lOOg于容量瓶中,加入蒸馏水50ml,置于20℃摇床中,lOOrpm消化24 h。再将容量瓶放于20℃高速离心仪中,3500rpm旋转15min。将离心后上清液用乙酸乙酷萃取2次,得中性成分;再将上清液用Imol/L的HC1调PH至4,萃取,得酸性组分;用 Imol/L的NaOH将上清液的PH值调至9,萃取得碱性组分。合并乙酸乙酯相,在35°C旋转蒸发仪中浓缩至0.5ml,即得到根系分泌物待测液(张汝民等,2007)。

方法三是邵东华、宁心哲、樊石磊等对油松、虎榛子根系分泌物实验时萃取硅烷化法的改进。首先称取lOg 土样放入烧杯,用50 mllmol/L的NaOH溶液淋洗植株根系,收集洗液,倒入盛有lOg 土的烧杯中;放到20℃摇床上,180rmin消化lOh;过滤2-3次,取20mL滤液,调节pH值到2.5-3,滴入饱和NaCl,用乙醚萃取3次, 合并醚相,转入心型瓶中,旋转浓缩至干;滴入甲醇,溶解瓶壁上物质,并移入直径为1.8-2.0mm毛细管,抽干;加入8ul硅院化试剂,lOO'C衍生Ih后便为待测液(邵东华等,2011)

使用的第四种方法是陈华君、金幼菊等人在对杨树等根系分泌物测定时的萃取甲酯化提取方法。首先取200g跟际土,加入适量70%的乙醇,超声10min,此步骤重复3次。抽滤、减压浓缩、离心。将上清液40ml用2 mol/L的HC1调pH至2-3, 用O.lmol/L乙酸饱和的乙酸乙酯萃取3次,将有机相合并,在4(rC条件下解压浓缩至干,CH2N2甲酯化后,即为酸性物待测液。再取上淸液40m用0.1 mol/L磷缓液缓液调pH≥8, 用 O.lmol/L憐缓饱和的正丁醇萃取3次,将有机相合并,在55°C条件下解压浓缩至干，用硅烷化试剂进行TMS衍生化,即为碱性物待测液(陈华君等,1997)

方法三：梭梭幼苗根系分泌物提取方法的研究＊张汝民

1.4 根系分泌物的收集和提取

根系分泌物的水浸提取:取生长良好的梭梭幼苗,将其无损伤从石英砂中取出,用500ml蒸馏水浸石英砂24h,浸提液离心,上清液用乙酸乙酯萃取其酸性、碱性和中性成分。方法为:将离心上清液用乙酸乙酯萃取3次(每次用乙酸乙酯10ml),得到乙酸乙酯相为中性组分;将水相用1M HCl调节pH至3后,再用乙酸乙酯萃取3次(每次用乙酸乙酯10ml),得到乙酸乙酯相为酸性组分;将水相再用1M NaOH调节pH为8,用乙酸乙酯萃取3次(每次用乙酸乙酯10ml),得到乙酸乙酯相为碱性组分,将酸性、碱性和中性(原液)乙酸乙酯萃取液减压浓缩至1ml(45℃),用于进行GC/MS分析。根系分泌物的循环灌溉收集:将生长良好的梭梭幼苗培养盆下面安装一个塑料管与根系分泌物收集器相连接,通过收集器中XAD-16树脂吸附根系分泌物后的溶液又循环到培养盆中,如此连续循环5d后,将收集器中XAD-16树脂吸附的根系分泌物用甲醇洗脱,收集洗脱液为梭梭根系分泌物提取液。然后,45℃减压浓缩至1ml,再用1ml乙酸乙酯萃取,用于进行GC-MS分析测试。

将野外采集沙棘根系及根系表面0-3mm 土壤然风干,土壤过100 g。称取lOg 土放入烧杯;用50mnrnol/L的NaOH溶液淋洗沙棘根系,收集洗液,倒入盛有lOg 土的烧杯中:放到20°C摇床上,180r/min消化lOh;过滤2-3次,取20mL滤液,调节pH值到2.5-3,滴入饱和NaCl,用乙醚萃取3次,合并醚相,转入心型瓶中,旋转浓缩至干:滴入甲醇,溶解瓶壁上物质,并移入到直径为1.8-2.0mm毛细管中,抽千;加入8μl硅烷化试剂,100℃衍生Ih; GC/MS检测分析。